Syndromes d’origine génétique avec vieillissement prématuré

Éthique et consentements

Tous les patients ou leur représentant légal pour les mineurs ont signé un consentement écrit relatif aux analyses génétiques effectuées conformément à la loi Française (L1131-1-1 Code de la Santé Publique). Un consentement supplémentaire, spécifique à cette publication, a été obtenu par les patients eux-mêmes ou leur représentant légal pour les mineurs ou leur ayant droit pour les patients décédés afin d’utiliser les données cliniques et/ou les photographies. Cette étude est conforme au Règlement Général sur la Protection des Données (RGPD) (n°2016/679): l’utilisation des données cliniques et génétiques issues du diagnostic moléculaire a été validée par le Délégué à la Protection des Données de l’Assistance Publique des Hôpitaux de Marseille conformément à la réglementation Française et Européenne.

Séquençage de nouvelle génération

Depuis 2015, 66 cas index ont été analysés dans notre laboratoire. L’ADN a été extrait à partir des prélèvements sanguins. Le Centre de Ressource Biologique (CRB-TAC) (certifications NF-S 86-900 and ISO-9001 V2015) du Département de Génétique Médicale a préparé et fourni ces ADN au laboratoire de Biologie Moléculaire du même département afin qu’ils y soient analysés. À l’aide de la librairie Custom SureSelectXT 12-24Mb, nous avons conçu et fait préparer un kit « à façon » portant sur 1032 gènes en collaboration avec Agilent Technologies (Santa Clara, California, USA) ; ce kit est utilisé pour l’enrichissement de séquences cibles analysées dans les différents panels NGS proposés par le laboratoire. Les régions codantes et les jonctions introniques flanquantes les 1032 gènes ont été enrichies en solution, en utilisant le SureSelect Target Enrichment System from Agilent (Santa Clara, California, USA), conformément aux recommandations du fournisseur. Le séquençage haut débit a été réalisé sur la plateforme Ion Proton (Thermo Fisher Scientific, USA). Les données brutes obtenues ont été converties en fichiers Fastq et alignées à la séquence de référence du génome humain (University of California Santa Cruz, hg19/ GRCh37, (https://genome. ucsc.edu/) en utilisant le logiciel Torrent Suite (Thermo Fisher). Ce même logiciel est utilisé pour effectuer l’étape de variant calling (germline_low_stringency_targetseq), selon les paramètres suivants : min_cov_each_ strand: 0, min_variant_score: 10, min_allele_freq: 0.1, snp_min_coverage: 6 snp and indel; strand_bias: 0.98 snp and 0.85 indel. Un fichier au format .VCF (variant call format) et un fichier .BAM/.BAI (binary alignment map and index) sont obtenus et utilisés pour l’annotation des variants avec le logiciel « maison » VarAFT (Variant Annotation and Filtration Tool, https://varaft.eu/ (30). La liste des gènes à analyser pour chaque patient est ciblée en utilisant le bedfile correspondant (fichier qui définit les coordonnées chromosomiques des régions qui doivent être analysées) du panel d’intérêt enregistré dans VarAFT. La visualisation des variants et la lecture des séquences sont réalisées avec IGV (https://software.broadinstitute.org/software/ igv/) (31). Dans le cadre du diagnostic moléculaire, nous avons analysé 82 gènes incluant les gènes associés aux laminopathies et les gènes connus impliqués dans les syndromes avec vieillissement prématuré (Annexe 1). Le module de couverture basé sur BEDTools et contenu dans VarAFT a été utilisé pour calculer la couverture et la profondeur des données de séquençage à partir des fichiers BAM de la liste de gènes sélectionnée, produisant un rapport de couverture. L’interprétation des positions nucléotidiques n’a été réalisée que si les nucléotides étaient séquencés à une profondeur minimum de 20X selon les recommandations de la Société Européenne de Génétique Humaine (ESHG). Les variants dont la fréquence était > 1% dans GnomAD (https:// gnomad.broadinstitute.org) et 1000 genomes (http://www.internationalgenome.org/) ont été éliminés, ainsi que les variantsintroniques profonds. Les variants restant ont été analysés d’après leur position génomique et leur effets prédits sur les ARN et les protéines. Afin d’étudier la pathogénicité des variants retenus, nous avons utilisé différentes bases de données de populations comme gnomAD(https://gnomad.broadinstitute.org/), de patients telles ClinVar (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/clinvar/), LOVD (http://www.lovd.nl/3.0/home), de maladies génétiques comme OMIM (https://www.omim.org/) de bases de données intégrées comme ClinGen et des logiciels de prédiction bio-informatiques tels MutationTaster (http:// www.mutationtaster.org/), Human Splicing Finder (http://www.umd.be/HSF3/) et UMD Predictor (http://umd-predictor.eu/), ainsi que les données de la littérature (32–34). Les variants sont ensuite classés en « pathogène », « probablement pathogène », « de signification inconnue»,« probablement bénin » et « bénin » (respectivement de classe 5 à 1) en accord avec les recommandations de l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) et en utilisant les logiciels Intervar (http://wintervar.wglab.org/), ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) et ClinGen (https://www.clinicalgenome.org/) La classification était ajustée manuellement si besoin selon les données bibliographiques, cliniques et familiales (35) (Annexe 2). Pour chaque cas, les critères de la classification ACMG que nous avons rajoutés sont détaillés dans le tableau 1. Seulement les variants de classes 3 à 5 ont été rapportés dans le compte rendu diagnostic après confirmation par séquençage Sanger. Les gènes ont été nommés en suivant les recommandations HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee) (https:// www. genenames.org/); les changements au niveau génomique et protéique ont été nommés selon les recommandations HGVS (http://varnomen.hgvs.org/).

DISCUSSION

Nous rapportons les données issues de 4 ans de diagnostic moléculaire par séquençage haut débit avec un panel de 82 gènes sur une cohorte de 66 patients atteints de syndromes associés à un vieillissement prématuré. A notre connaissance, ce panel est le seul disponible en France et en Europe permettant d’offrir un diagnostic moléculaire large pour différents syndromes incluant des signes cliniques de vieillissement prématuré. Comme nous le montrons dans la figure 1, d’autres panels, pour la plupart impliqués dans les syndromes associés aux anomalies du tissu conjonctif, contiennent certains gènes inclus dans notre panel. Ce panel nous permet de proposer un diagnostic moléculaire pour des patients venant de toute la France métropolitaine et dans quelques cas des territoires français d’Outre-mer et de l’étranger. Comme nous pouvions le présager, plus de la moitié des prélèvements adressés à notre laboratoire de génétique moléculaire était originaire du Sud de la France (Figure 2). Ceci peut s’expliquer de par les liens étroits établis entre les Hôpitaux Universitaires Français du sud de la France, et par les conventions inter-hospitalières existant dans ce cadre et facilitant les échanges. Néanmoins, nous avons aussi reçu des prélèvements en provenance de régions plus éloignées, des territoires d’Outre-mer et de l’étranger. Cela peut s’expliquer par la possibilité unique proposée par notre laboratoire d’étudier de nombreux syndromes associés à un vieillissement prématuré, lesquels, dans certains cas, partagent un certain nombre de signes cliniques. De plus, le laboratoire de diagnostic et l’équipe de recherche de Marseille, sont impliqués depuis de nombreuses années dans le vieillissement prématuré lié aux Lamine A/C (1, 10, 13, 27, 57–62). Pour la totalité des cas index (n=66), le rendement diagnostic (identification de variants pathogènes ou probablement pathogènes) était d’environ ¼ (26%). Nous avons séparé la cohorte en 2, selon la précision nosologique de l’indication clinique, en « suspicion clinique précise et syndromes progéroïdes non spécifiques », nous avons alors obtenu un meilleur rendement diagnostic, de quasiment 40% pour le premier groupe, comme attendu. Puis, nous avons divisé la cohorte en 3 groupes : « suspicion clinique précise à l’exception des anomalies du tissu conjonctif » et « syndromes associés aux anomalies du tissu conjonctif » (les syndromes de Cutis Laxa et d’Ehlers Danlos) et « syndromes progéroïdes non spécifiques » ; après cette subdivision le rendement diagnostic était de 62%, 26% et 10% respectivement. Le rendement était plus faible pour les deux derniers groupes comme nous pouvions nous y attendre, soulignant toutefois la réduction importante du rendement diagnostic induite par les cas suspectés de syndromes associés aux anomalies du tissu conjonctif, pour lesquels il existe une superposition phénotypique importante, avec des formes (e.g. EDS hypermobile) qui n’ont pas de gène identifié à ce jour. En effet, les suspicions d’EDS représentaient environ 1/3 des cas index de notre cohorte (Figure 3 et données non montrées). Le consortium international a récemment défini 13 types d’EDS et listé 19 gènes causaux (28). Dans notre panel, nous analysons plus de 50% de ces gènes, dont les plus fréquents (11/19). En France, à ce jour, il n’y pas de panel diagnostic impliquant les 19 gènes. En Allemagne, le panel de Tübingen propose l’analyse de 90% de ces gènes (17/19). Ainsi notre panel représente l’offre la plus étendue pour le diagnostic moléculaire d’EDS en France, ce qui explique la part importante de prélèvements reçus pour cette indication dans notre laboratoire et pointe le manque d’offre de diagnostic moléculaire sur le territoire Français pour ces syndromes. Il est parfois difficile d’établir un diagnostic clinique certain car plusieurs symptômes sont communs à différents types d’EDS et il existe une variabilité phénotypique intra et inter familiale : un même patient peut présenter une forme chevauchante entre deux types d’EDS ou avec d’autres syndromes affectant le tissu conjonctif ; d’où l’intérêt d’offrir le panel le plus large possible comprenant les gènes impliqués dans ces pathologies associées à des signes de vieillissement prématuré. C’est pour cette raison également que, bien qu’aucun gène n’ait été identifié dans d’EDS hypermobile, nous avons accepté d’effectuer l’analyse pour cette indication chez les cas index qui nous ont été référés. Par ailleurs, de nombreux syndromes associés aux 82 gènes étudiés dans notre panel présentent certains signes cliniques communs (13,14,15,10,28,63). Nous rapportons 20 variants classés pathogènes ou probablement pathogènes chez des cas index adressés pour des syndromes différents. 9 d’entre eux n’ont jamais été décrits auparavant ; parmi ceux-ci, 4 sont des variants non-sens et 2 des variants décalant le cadre de lecture (frameshift). Nous avons pu classer ou reclasser certains de ces variants en pathogènes ou probablement pathogènes selon les données de la littérature, les bases de données génétiques et les informations cliniques des cas index, (Tableau 1, Annexe 2) : cela a été le cas pour les variants (c.2263C>T; p.(Arg755Trp)) et (c.2415_2419dup; p (Arg807fs113Ter)) du gène RECQL4 chez la patiente P2 atteinte de RTS, ainsi que les variants (c.546A>T; p.(Glu182Asp)) et (c.859C>T; p.(Arg287Ter)) du gène GORAB pour le patient P5 atteint de CL. En effet, bien que la plupart des variants pathogènes de GORAB (alias: SCYL1BP1) responsables du GO soient des non-sens, des variants faux-sens homozygotes ont déjà été associés au GO et semblent affecter les fonctions physiologiques de GORAB (64–67). Pour le cas index P7, nous avons aussi reclassé le variant ERCC6 (c.2291T>C; p.(Leu764Ser)) qui était associé à une délétion hétérozygote emportant tout le gène ERCC6. Le cas index présentait un tableau compatible avec un syndrome de Cockayne à début tardif. Ghai et al. avaient déjà rapporté l’association d’une délétion similaire à celle de notre cas index et d’un variant frameshift (68). Nous avons aussi ajusté la classification des variants suivants (Tableau 1) : le variant homozygote (c.1499G>T; p.(Gly500Val)) du gène ALDH18A1 du cas index P13 atteint de CL; le variant non-sens (c.1884_1891del; p.(Asp629Phefs16Ter)) de COL5A1 du cas index P14 atteint d’un cEDS. D’autres variants, quant à eux, étaient déjà classés pathogènes par le logiciel Intervar d’après la classification ACMG : un variant non-sens homozygote dans le gène PRDM5 (c.1036C>T; p.(Arg346Ter)) chez le patient P15 ayant un diagnostic clinique de syndrome de la cornée fragile, et un variant non-sens dans le gène WRN (c.2313T>A; p.(Cys771Ter)) associé chez le patient P8, atteint de WS, à un autre variant nonsens déjà décrit.

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