SURVEILLANCE CYTOPLASMIQUE DES ARN : LA VOIE DU NONSENSE-MEDIATED MRNA DECAY (NMD)

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Fidélité de l’initiation de la transcription

La faible spécificité de sélection du TSS par le PIC conduit à la production d’isoformes des transcrits et peut avoir un rôle régulateur pour l’expression des gènes (Arribere & Gilbert, 2013; Malabat et al, 2015). En effet, le choix d’un site alternatif de démarrage de transcription peut avoir plusieurs conséquences :
– Le transcrit peut avoir conservé le site de démarrage de la traduction (codon AUG) mais avec une extrémité 5’ non traduite différente (5’ UTR). Dans ce cas l’efficacité de traduction et donc le niveau d’expression du gène sera impacté (Arribere & Gilbert, 2013).
– Le TSS alternatif peut avoir généré un autre codon AUG, dans la même phase de traduction mais en aval du premier, qui conduirait à la production d’une protéine tronquée (Arribere & Gilbert, 2013).
– Le TSS sélectionné peut être en amont de la phase ouverte de lecture du gène et créer un petite phase ouverte de lecture dite uORF qui fera du transcrit généré une cible pour la dégradation liée au contrôle qualité des ARNm (Malabat et al, 2015).
– Enfin, les TSS alternatifs peuvent être situés en amont ou en aval de sites de terminaison précoce (de type « NNS », voir plus loin) et ainsi conduire, selon les conditions de croissance, à une transcription abortive ou normale (Voir Partie I.3).

Architecture de la chromatine au niveau des promoteurs

L’information génétique de la cellule est codée dans le noyau, au niveau de l’ADN qui est lui-même empaqueté dans la chromatine au sein des chromosomes (Figure 5).
Ainsi, le premier niveau de compaction de l’ADN est son enroulement autour des octamères d’histones, pour former les structures appelées nucléosomes. Chez S. cerevisiae, les histones sont au nombre de 5 : H1, H2A, H2B, H3 et H4. L’histone H1 a un rôle très limité dans l’initiation de la transcription (il intervient plutôt dans la régulation de la compaction de la chromatine au cours de la sporulation), mais les quatre autres sont présents en deux copies au sein de la structure du nucléosome (Rando & Winston, 2012). Les protéines d’histones (de 11 à 23 kDa) ont la particularité d’avoir un domaine de repliement nommé « histone fold » à l’extrémité C-terminale, indispensable à l’interaction entre histones pour former la structure du nucléosome. Ces protéines ont également une queue N-terminale, exposée à l’extérieur du nucléosome et qui sont la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles (Rando & Winston, 2012) (Voir paragraphe 3).
Pour initier la transcription, l’ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription doivent accéder à l’ADN empaqueté dans la chromatine. Les nucléosomes constituent donc une première barrière physique à l’assemblage de la machinerie de transcription au niveau du promoteur. Les modifications de la chromatine ont alors un fort impact sur la transcription des gènes et les promoteurs géniques présentent une architecture bien particulière de leur chromatine (Hahn & Young, 2011; Rando & Winston, 2012).
Les promoteurs géniques ont une organisation de la chromatine bien spécifique, qui diffère selon leur niveau et fréquence d’expression. Tous les promoteurs géniques se caractérisent par une région pauvre en nucléosome, appelée NFR pour « Nucleosome Free Region », qui est nécessaire à l’assemblage du PIC. Cette NFR est entourée de deux nucléosomes spécifiques, le nucléosome situé juste en amont (-1) étant la cible des régulations transcriptionnelles, et le nucléosome situé au niveau du TSS (+1) qui doit être décalé pour l’initiation transcriptionnelle (Rando & Winston, 2012; Cairns, 2009; Venters & Pugh, 2008).

Régulations transcriptionnelles à l’étape d’initiation

On oppose la transcription basale, de faible niveau et nécessitant la machinerie d’initiation minimale, à la transcription activée faisant intervenir des régulateurs transcriptionnels divers. La régulation de la transcription a majoritairement lieu au niveau de l’initiation de la transcription, et est réalisée de différentes façons :
• Par le recrutement de co-activateurs transcriptionnels et de GTF au niveau des promoteurs : il a été observé que l’activation de l’expression des gènes est corrélée à une augmentation du niveau de GTF et de facteurs de transcription sur les régions promotrices ainsi que sur les séquences régulatrices UAS pour « Upstream Activating Sequences » (sites ciblés par les facteurs de transcription, en amont du PIC) (Hahn & Young, 2011).
• Par des changements conformationnels de la machinerie de transcription pour augmenter son activité : ce type de régulation s’effectue par l’intermédiaire du complexe Médiateur. Ce complexe de 25 sous-unités protéiques joue un rôle d’intermédiaire entre les régulateurs transcriptionnels et les GTF. Il permet effectivement une intégration de divers signaux de facteurs de transcription, qui se traduit par un changement conformationnel et a des conséquences directes sur la formation du complexe de pré-initiation (stimulation du recrutement de l’ARN pol II, stabilisation du PIC…) (Hahn & Young, 2011).
• La modification de la structure de la chromatine : la modification de la chromatine peut avoir lieu par des modifications chimiques au niveau des queues d’histones composant le nucléosome. Ces modifications chimiques peuvent être des méthylations, acétylations, phosphorylations et ubiquitinylations des queues d’histones. Elles sont apposées ou retirées par des enzymes spécifiques, qui peuvent être recrutées par des facteurs de transcription (Hahn & Young, 2011; Rando & Winston, 2012; Millar & Grunstein, 2006).
L’acétylation a globalement un impact positif pour la transcription, puisqu’elle neutralise les charges sur les queues d’histones et diminue ainsi leur interaction avec l’ADN au sein des nucléosomes. Cependant, l’ensemble des marques de modification de la chromatine constitue un code histone complexe, qui peut avoir un effet négatif ou positif pour l’expression génique (Rando & Winston, 2012).
A côté des modifications d’histone, des remodelages de la chromatine sont aussi régulateurs pour l’initiation de la transcription. Ils sont permis par des complexes de remodelage dont l’activité dépend de la présence d’ATP et qui peuvent soit expulser des histones, soit les faire glisser d’une position à une autre.

Mécanisme d’élongation transcriptionnelle

Pour la transition entre l’initiation de la transcription et son élongation, le complexe de transcription doit quitter la région promotrice. Ce phénomène s’appelle le dégagement du promoteur (« promoter clearance »). Dans les premiers temps de l’élongation, la bulle de transcription formée en fin d’initiation reste à sa position initiale et s’étend en taille au fur et à mesure de l’extension de l’ARN transcrit. Lorsque le transcrit a atteint la taille de 17 bases environ, l’extrémité 5’ de l’ARN se dés-hybride de l’ADN matrice et pourra ensuite entrer dans le tunnel de sortie de la polymérase II. L’hybride ARN-ADN aura finalement une longueur d’environ 8 nucléotides (Hahn, 2004; Luse, 2013).
Pour le dégagement du promoteur, l’ARN pol II doit par ailleurs perdre ses interactions avec les facteurs d’initiation de la transcription et l’ADN du promoteur. Cette transition est favorisée par la marque S5P du CTD. Cette phosphorylation va également permettre de recruter les facteurs nécessaires à l’ajout de la coiffe (guanosine modifiée et méthylée ajoutée en 5’) sur l’ARN naissant, afin d’augmenter sa stabilité et permettre le recrutement d’autres facteurs. Après la synthèse d’environ 30 bases d’ARN, l’ARN pol II quitte le PIC et le promoteur. Les GTF et co-activateurs transcriptionnels restent pour la plupart associés à la région promotrice constituant un échafaudage qui permet une ré-initiation rapide de la transcription. Seuls les facteurs TFIIB et TFIIH devront être recrutés à nouveau avec l’ARN pol II (Hahn, 2004; Luse, 2013).
Au début de la phase d’élongation, la polymérase II fait une pause et s’accumule en aval du TSS. Cette pause joue un rôle clé car elle permet d’effectuer un contrôle-qualité du transcrit (notamment de l’ajout de sa coiffe) avant de passer à l’élongation productive (Jonkers & Lis, 2015).
Il a été montré que même si la polymérase II est très processive in vitro sur de l’ADN nu, elle n’est pas très efficace pour transcrire une matrice ADN empaquetée dans la chromatine. Plusieurs facteurs d’élongation (EF) vont donc être recrutés au niveau du complexe de transcription pour faciliter le processus dynamique de l’élongation et en réguler sa vitesse.
Etant modulaires, les EF vont pouvoir interagir à la fois entre eux, avec le CTD de la polymérase et avec l’ARN naissant (Battaglia et al, 2017; Jonkers & Lis, 2015). L’état de phosphorylation du CTD joue un rôle clé dans leur recrutement. Les kinases Ctk1 et Bur1 sont en effet recrutées par la phosphorylation S5P du CTD (cette modification va être progressivement enlevée par la phosphatase Ssu72 au cours de l’élongation). Ces kinases vont pouvoir à leur tour phosphoryler la sérine 2 du CTD ainsi que la protéine Spt5 comprise dans le complexe DSIF (en association avec Spt4) pour permettre leur fonction de plate-forme moléculaire pour le recrutement d’autres EF. Parmi ces EF, on compte notamment les complexes Paf, FACT et le facteur d’élongation Spt6. D’autre part, DSIF va aider à prévenir les pauses de l’ARN pol II en cours d’élongation, en coopération avec le facteur d’élongation TFIIS qui va intervenir en cas de blocage de l’enzyme sur sa matrice (Battaglia et al, 2017; Meinhart et al, 2005; Jonkers & Lis, 2015; Hahn, 2004). Les EF sont interdépendants, et coopèrent dans le but ultime de permettre la progression de la polymérase à travers la barrière physique représentée par la chromatine, ainsi que le repositionnement des nucléosomes pour refermer la chromatine après son passage. Pour cela des modifications de la chromatine vont être nécessaires.

Modifications co-transcriptionnelles de la chromatine

La polymérase en cours d’élongation doit déplacer les nucléosomes pour accéder à la matrice d’ADN. Les gènes fortement transcrits seront d’ailleurs caractérisés par un espacement inter-nucléosomal plus petit sur la région codante. Si la transcription est très forte, on observera même une diminution d’occupation des nucléosomes sur la région codante (Rando & Winston, 2012). Ces remodelages de la chromatine sont permis par la coopération de plusieurs facteurs de modification de la chromatine, dont le recrutement est orchestré par les modifications du CTD de la polymérase II.

Rôle complexe de la méthylation par Set1 apposée en cours d’élongation

Set1 est une histone-méthyl transférase appartenant au complexe COMPASS qui est recruté au cours de la transcription. Set1 interagit directement avec la polymérase par la phosphorylation en sérine 5 du CTD, mais elle possède également un domaine de reconnaissance à des motifs sur l’ARN. D’autre part, son action est dépendante de la présence du facteur d’élongation Paf et d’une mono-ubiquitinylation de la lysine 123 de l’histone H2B. Le profil de méthylation généré par Set1 varie suivant la région transcrite avec un gradient de méthylation H3K4 le long des gènes activement transcrits. En effet, la région 5’ en amont du TSS correspondant au moment de l’initiation de la transcription, est ciblée par une triméthylation H3K4. Cette modification est une marque de la transcription active et est notamment reconnue par le domaine PHD des complexes Histone-acétyl transférase (HAT) Nua3, Nua4, Hbo1 et SAGA. Ces complexes régulent positivement la transcription génique car ils permettent une acétylation de la chromatine au niveau des promoteurs. En revanche, les di-méthylations seront plutôt présentes en 5’ mais en aval du TSS (correspondant à l’élongation précoce) et sont lues par le chromo-domaine de la protéine Set3 comprise dans le complexe Set3C également constitué des deux histone-déacétylases (HDAC) Hos1 et Hst1. Ce complexe a à la fois un rôle positif et négatif pour la transcription génique. En effet, il a été montré qu’il permet de contrôler la cinétique d’induction des gènes (Kim et al, 2012), mais il est généralement connu pour son effet répresseur sur la transcription (van Werven et al, 2012). Les mono-méthylations sont plutôt distribuées dans le corps de la région transcrite (Woo et al, 2017; Rando & Winston, 2012; Millar & Grunstein, 2006).

Coopération de l’HMT Set2 avec les facteurs d’élongation pour refermer la chromatine après le passage de la polymérase

Set2 est une HMT H3K36 qui se lie aux marques S5P et S2P du CTD. Elle est à l’origine d’une tri-méthylation H3K36me3 sur le corps des gènes activement transcrits. Sa fonction principale est le recrutement du complexe Rpd3S par le chromo-domaine d’un de ses constituants Eaf3, conduisant ainsi à une déacetylation par l’HDAC Rpd3. La marque H3K36me3 est également liée par le complexe ISW1. Ces deux complexes sont à l’origine d’une déacetylation et d’un remodelage, importants après le passage de la polymérase II pour refermer la structure de la chromatine et la rendre incompétente pour une initiation transcriptionnelle (Woo et al, 2017; Rando & Winston, 2012; Millar & Grunstein, 2006).
Ea3f entre également dans la composition du complexe NuA4, et deux composants de NuA3 (Nto1 et Pdp3) reconnaissent également la méthylation H3K36me3. Cela suggère que Set2 pourrait aussi avoir un rôle opposé, pour le recrutement d’HAT pendant la transcription (Woo et al, 2017).

Contrôle nucléaire conduisant à la dégradation des transcrits cryptiques

Le système de contrôle de la transcription pervasive en aval de l’initiation transcriptionnelle fait intervenir la voie de terminaison Nrd1-Nab3-Sen1, ou NNS, qui est également utilisée pour la terminaison des snoRNA.
Cette terminaison est permise par les facteurs Nrd1 et Nab3 qui reconnaissent spécifiquement des petites séquences sur l’ARN transcrit (GUAA/G pour Nrd1 et UCUUG pour Nab3). L’état de phosphorylation du CTD est déterminant dans le recrutement du complexe NNS. En effet, Nrd1 interagit directement avec le CTD S5P via son domaine CID. Le gradient de phosphorylation du CTD impacte donc fortement le choix de la voie utilisée pour la terminaison de la transcription, avec une marque S5P qui favorisera plutôt la terminaison NNS, tandis que la marque S2P favorisera la terminaison CPF-CF (Gudipati et al, 2008).
Nrd1 et Nab3 forment un complexe avec l’hélicase ADN Sen1 qui, en interaction avec l’ARN natif et grâce à une hydrolyse d’ATP, conduit à une dissociation du complexe de transcription de la matrice ADN. Le facteur Nrd1 échangera ensuite son interaction avec le CTD pour interagir avec le facteur Trf4 appartenant au complexe Trf4-Air2-Mtr4 (TRAMP) (Tudek et al, 2014). La polyadénylation du transcrit par le complexe TRAMP permet d’en faire une cible pour la dégradation par l’exosome nucléaire (Figure 9) (Porrua et al, 2016, 2012; Colin et al, 2011).
L’exosome est un complexe protéique permettant la maturation et la dégradation des ARN de l’extrémité 3’ à l’extrémité 5’. Le cœur de l’exosome est composé d’une structure en anneau ou « PH ring » formée par les sous-unités Rrp41, Rrp42, Rrp43, Rrp45, Rrp46 et Mtr3. L’anneau est stabilisé par une coiffe protéique ou « S1-KH cap » contenant les sous-unités Rrp4, Csl4 et Rrp40 qui participe à la fixation à l’ARN et la reconnaissance des substrats. Cette coiffe permet à l’ARN de passer à travers le tunnel formé par l’anneau, en se positionnant à son entrée. En plus de ces sous-unités structurales, l’exosome contient des sous-unités catalytiques représentées par les exonucléases. Dis3 (ou Rrp44) est commune, chez la levure bourgeonnante, aux exosomes nucléaire et cytoplasmique, alors que Rrp6 qui est spécifique à l’exosome nucléaire (Revues par Sloan et al, 2012; Kilchert et al, 2016) (Figure 10).

Surveillance cytoplasmique des ARN : la voie du Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)

Les lncARN qui ont échappé au contrôle nucléaire de la transcription pervasive sont exportés vers le cytoplasme. Ces ARN pervasifs peuvent y être délétères : s’ils s’accumulent et entrent dans un cycle traductionnel, ils sont susceptibles de mobiliser les ribosomes ou leurs produits de traduction peuvent être toxiques, par exemple s’ils saturent les machineries de surveillance des protéines mal repliées. Cependant, le fait qu’ils ne possèdent pas de longues phases codantes mais seulement de très courtes phases ouvertes aléatoires en font des cibles privilégiées pour le contrôle-qualité cytoplasmique constitué par la voie du « Nonsense-mediated mRNA Decay » (NMD).
La voie du NMD intervient après l’export des ARN transcrits vers le cytoplasme et est couplée à la traduction par les ribosomes. On peut distinguer au moins 4 étapes successives pour la traduction : l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage des ribosomes. Pendant l’initiation de la traduction, la petite sous-unité ribosomale (40S) se lie à l’ARNt spécifique à la méthionine et à l’ARNm. Après sélection du triplet AUG ou codon START d’initiation de la traduction sur l’ARNm, cette petite sous-unité est rejointe par la grosse sous-unité ribosomale (60S) pour former le ribosome fonctionnel (80S). Pendant la phase d’élongation, le ribosome utilise les ARNt pour lire les codons de l’ARNm et ajouter les acide-aminés successifs à la chaîne peptidique naissante. La terminaison de la traduction comprend la reconnaissance d’un codon STOP sur la séquence de l’ARNm, la libération du peptide synthétisé et la dissociation du ribosome pour son recyclage (Dever et al, 2016).
L’absence d’une capacité codante suffisante de l’ARN traduit, une rétention d’intron, ou encore la présence d’une uORF, notamment, peuvent conduire à la reconnaissance d’un codon STOP précoce PTC pour « Premature Termination Codon » par le ribosome, et à un défaut de terminaison traductionnelle.
Chez la levure, le modèle du faux 3’ UTR a été proposé pour expliquer comment les codons PTC sont distingués des codons STOP normaux. Dans ce modèle, la terminaison normale de la traduction fait intervenir une interaction entre la protéine liée à la queue poly-A, (PAPB, Pab1 chez la levure), et le facteur eRF3 lié au ribosome en cours de terminaison. Or, lorsqu’un PTC est présent, le ribosome en cours de terminaison est éloigné de la PAPB dont la concentration locale est donc plus faible que pour un ARNm normal. Upf1, une hélicase constituant l’un des facteurs centraux du NMD, peut alors, en association avec ses régulateurs Upf2 et Upf3, entrer en compétition favorable avec PAPB pour interagir avec eRF3 (Amrani et al, 2004; Brogna & Wen, 2009). Par ailleurs, la région en amont du codon STOP semble aussi jouer un rôle dans la sélection de cibles du NMD puisque, pour un 3’ UTR de taille donnée, des transcrits avec une courte phase ouverte de lecture seront préférentiellement reconnus par Upf1 (Decourty et al, 2014).

Développement d’un système rapporteur pour l’étude des mécanismes d’interférence transcriptionnelle

Pour répondre aux problématiques soulevées par les résultats précédents, ma thèse a d’abord consisté à essayer de mettre au point un système permettant de reproduire le phénomène d’interférence transcriptionnelle au niveau d’un gène rapporteur. L’idée était en effet de pouvoir quantifier l’expression d’un gène régulé par interférence transcriptionnelle sans obligation de mesure de l’abondance de l’ARNm, pour réaliser des tests phénotypiques après association du gène rapporteur à différentes combinaisons de promoteurs géniques et cryptiques. Nous souhaitions également utiliser le système pour réaliser des cribles génétiques.

Système rapporteur CUP1

Le premier des deux systèmes rapporteurs construit est une association du gène CUP1 à une combinaison de promoteurs sens et antisens différents, afin de pouvoir observer les conséquences de phénomènes d’interférence transcriptionnelle sur la résistance cellulaire au cuivre. Ce système présente l’avantage de permettre une réponse phénotypique graduelle aux régulations transcriptionnelles en jouant sur la concentration en cuivre dans le milieu, et donc de mieux détecter de faibles variations du niveau d’expression du gène rapporteur. Pour s’affranchir d’une déplétion de Nrd1 qui est néfaste pour les cellules, la copie du gène CUP1 du système rapporteur a été mutée pour supprimer les sites de terminaisons NNS en antisens. Cette construction peut de plus être intégrée dans le génome au niveau du locus CUP.
Afin de vérifier que cette construction permette de reproduire et d’étudier le phénomène d’interférence transcriptionnelle, j’ai associé ce système rapporteur aux promoteurs sens et antisens d’un gène connu pour sa régulation par ce phénomène, le gène CPS1. Ce gène codant pour une carboxypeptidase vacuolaire est associé à un CUT antisens initié en 3’. En l’absence de NRD1, l’allongement de son transcrit antisens au-delà du TSS de CPS1 conduit à une forte répression de l’expression du gène (Figure 17).

Table des matières

INTRODUCTION
I. LA TRANSCRIPTION GENIQUE
1. INITIATION DE LA TRANSCRIPTION
2. ELONGATION DE LA TRANSCRIPTION
3. TERMINAISON DE LA TRANSCRIPTION
II. LA TRANSCRIPTION PERVASIVE
1. CONTROLE DE L’INITIATION DE LA TRANSCRIPTION PERVASIVE
2. CONTROLE NUCLEAIRE CONDUISANT A LA DEGRADATION DES TRANSCRITS CRYPTIQUES
3. SURVEILLANCE CYTOPLASMIQUE DES ARN : LA VOIE DU NONSENSE-MEDIATED MRNA DECAY (NMD)
4. MISE EN EVIDENCE DES TRANSCRITS PERVASIFS DANS LA CELLULE
III. ROLES DE LA TRANSCRIPTION PERVASIVE
1. FONCTIONNALITE EN TRANS
2. FONCTIONNALITE EN CIS
IV. PROJET DE THESE
RESULTATS
I. DESCRIPTION DES MECANISMES D’INTERFERENCE TRANSCRIPTIONELLE CHEZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. RESULTATS PRECEDENTS
2. DEVELOPPEMENT D’UN SYSTEME RAPPORTEUR POUR L’ETUDE DES MECANISMES D’INTERFERENCE TRANSCRIPTIONNELLE
II. ROLE DE PHENOMENES D’INTERFERENCE TRANSCRIPTIONNELLE LIES A LA TRANSCRIPTION
ANTISENS DANS LA REGULATION NATURELLE DE L’EXPRESSION GENIQUE (MANUSCRIT DE L’ARTICLE)
DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
MATERIELS ET METHODES
BIBLIOGRAPHIE

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