Substances antimicrobiennes produites par les bactéries lactiques

Substances antimicrobiennes produites par les bactéries lactiques

Substances antimicrobiennes produites par les bactéries lactiques

Parmi les principales contributions des bactéries lactiques à un produit alimentaire c’est de préserver ses qualités nutritives et organoleptiques tout en prolongeant sa durée de conservation et aussi en contrôlant la croissance des germes de détérioration et/ou pathogènes. Ceci est assuré par la production de diverses substances inhibitrices durant la fermentation telles que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, le dioxyde de carbone, le diacétyle, la reutérine, la reutéricycline, les bactériocines et d’autres substances telles que l’éthanol, les acides gras, l’acétoïne et les composés antifongiques (propionate, phényl-lactate, hydroxyphényl-lactate, dipeptides cycliques et acides gras) (Messens et De Vuyst, 2002 ; Theron et Lues, 2011 ; Evranuz et Chandan, 2012 ; Reis et al., 2012 ; Cizeikiene et al., 2013). Ces composés antimicrobiens spécifiques agissent comme conservateurs des aliments et se montraient efficaces au fil du temps avec certaines applications empiriques qui remontent à environ 6000 av. J.-C. (von Mollendorff et al., 2016). Ces composés, qui s’avèrent d’une grande utilité pour l’homme, sont en fait produits par les bactéries lactiques afin d’éliminer tout autre microorganisme qui peut entrer en compétition avec elles pour l’utilisation des sources de carbone. – Acides organiques La production des acides organiques par les bactéries lactiques est le principal atout pour la conservation des aliments. Durant la croissance, les sucres sont essentiellement convertis en acide lactique (CH3– CH(OH)–COOH) qui exerce la plus grande partie de l’activité inhibitrice contre les microorganismes. Quand l’acide lactique est produit, le pH diminue et les acides organiques (ou petits acides gras) deviennent non dissociés (Reis et al., 2012 ; Salminen, et al., 2012). Ces acides non dissociés sont la principale caractéristique antimicrobienne des bactéries lactiques. Il a été démontré que les petits acides gras non dissociés ciblent et pénètrent dans les membranes bactériennes et provoquent l’accumulation d’anions d’acides faibles dans le cytoplasme ce qui affecte les processus métaboliques. L’inhibition de croissance a lieu par conséquent et les microorganismes finissent par mourir. 7 Un antibiotique de dernier recours est un antibiotique qui est généralement utilisé quand les antibiotiques les plus courants ne sont plus utiles. Il est considéré comme une solution de dernier recours. 8 ANSM : L’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé. Étude bibliographique 10 Les bactéries lactiques homofermentaires facultatives produisent également des acides autres que l’acide lactique (par exemple les acides acétique et formique) dans certaines conditions de croissance telles que l’absence de glucose et la présence d’autres sucres fermentescibles. Aucun de ces acides ne possède une activité antimicrobienne aussi forte que celle de l’acide lactique vu leur faible concentration (Salminen, et al., 2012). D’autres acides organiques peuvent également être produits par certaines bactéries lactiques mais avec des concentrations largement plus faibles, il s’agit de :  L’acide benzoïque (C6H5-COOH) qui est le conservateur le plus utilisé dans l’industrie· alimentaire, il est produit par différentes espèces lactiques et sa production dépend de la souche et la température d’incubation. Cet acide a principalement une activité antifongique (Schnürer et Magnusson, 2005 ; Yu et al., 2016).  L’acide propionique (CH3-CH2-COOH) qui peut être produit par les bactéries lactiques· hétérofermentaires mais seulement en traces. L’acide propionique interagit avec la membrane cellulaire pour neutraliser le gradient électrochimique des protons, mais son effet dépend souvent de la diminution du pH causée par l’acide lactique. Cet acide a tout comme l’acide benzoïque une activité antifongique et affecte les membranes fongiques à des valeurs de pH inférieures à 4,5 et inhibe également l’absorption des acides aminés. L’acide propionique peut également être efficace pour contrôler la croissance et réduire la viabilité des bactéries à Gram positif et à Gram négatif (Ray et Ray, 2004). – Reutérine et Reutéricycline La reutérine (β-hydroxypropionialdehyde) est une substance antimicrobienne produite par certaines souches de Lb. reuteri lors de la fermentation anaérobique du glycérol (Langa et al., 2014). Il a été rapporté que la reutérine peut être aussi produite par d’autres espèces telles que Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. collinoides et Lb. coryniformis (Schutz et Radler, 1984 ; Claisse et Lonvaud-Funel, 2000 ; Martin et al., 2005). La reutérine a un large spectre d’activité dirigé contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif (y compris les entéropathogènes) et aussi contre les levures, les champignons, les protozoaires et les virus (Talarico et al., 1988 ; Langa et al., 2014). Son activité antimicrobienne contre une large gamme de microorganismes est attribuée à un mélange de monomères hydratés et de dimères cycliques de l’aldéhyde β-hydroxypropionique (Salminen et al., 2012). Certains auteurs ont montré que l’activité antimicrobienne de la reutérine peut être améliorée en présence des bactériocines ou du diacétyle (Arqués et al., 2014 ; Langa et al., 2014). Une autre substance antimicrobienne a également été isolée et nommée reutéricycline, elle présente aussi un large spectre antibactérien contre différentes espèces y compris Lactobacillus sp., Bacillus subtilis, B. cereus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus et Listeria innocua (Gänzle et al., 2000 ; Höltzel et al., 2000 ; Gänzle, 2004). La reutéricycline a été initialement identifiée comme antibiotique produit par Lb. reuteri (Höltzel et al., 2000). Étude bibliographique 11 L’effet bactériostatique ou bactéricide de la reutéricycline a été attribué à son activité en tant qu’ionophore protonique sur les bactéries cibles. Son spectre d’action inclut une large gamme de microorganismes de détérioration alimentaire et/ou pathogènes (Gänzle, 2004 ; Cherian et al., 2014).

Classe I : Peptides synthétisés par voie ribosomique subissant des modifications posttraductionnelles RiPP (PM < 10 kDa)

Cette classe comprend tous les peptides qui subissent une modification enzymatique lors de la biosynthèse, aboutissant à des molécules avec des acides aminés et des structures rares qui ont un impact sur leurs propriétés comme pour la lanthionine, les hétérocycles, tête-à-queue cyclisation et la glycosylation (Alvarez-Sieiro et al., 2016). La majorité des RiPP sont produits sous forme de peptides précurseurs linéaires d’environ 20 à 110 acides aminés avec un peptide de structure en partie centrale, une séquence de reconnaissance en extrémité C-terminale et un peptide leader en extrémité N-terminale qui sert à la reconnaissance par les enzymes et le transporteur membranaire. Ce peptide leader est fusionné avec le peptide fonctionnel et le garde inactif jusqu’à la maturation (Osbourn et al., 2014 ; Rai et Bai, 2014). 9 RiPP : de l’anglais Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides Peptides synthétisés par voie ribosomique subissant des modifications post-traductionnelles.  PM : Poids moléculaire.* Étude bibliographique 14 – Classe Ia (lanthipeptides de types I, II, III et IV) Les lanthipeptides tels que la nisine sont des peptides possédant des acides aminés inhabituels tels que la lanthionine (Lan) ou la β-méthyl lanthionine (MéLan) (Ortega et van der Donk, 2016) (figure 2). Les lanthipeptides subissent des modifications post-traductionnelles (MPT), et généralement les gènes impliqués dans le processus de maturation sont situés sur le même opéron. Les lanthipeptides sont subdivisés en quatre types sur la base de la voie de biosynthèse responsable de la formation de l’anneau thioéther (Knerr et van der Donk, 2012). Cependant seulement les types I (LanB et LanC modifiés) et II (LanM modifié) peuvent être considérés comme lantibiotiques. Les types III et IV ont aucune activité antimicrobienne connue et ne sont pas traités dans cette classification (Alvarez-Sieiro et al., 2016). Un grand nombre de lantibiotiques sont produits par les bactéries lactiques. Parmi eux, la nisine est la mieux étudiée, il s’agit d’un lantibiotique de type I produit par Lactococcus lactis (De Vuyst, 1994 ; Ceylan et Mol, 2015). L’opéron responsable de la biosynthèse de la nisine se compose de 11 gènes (Zhou et al., 2006) (figure 3). Les promoteurs des opérons nisABTCIP (biosynthèse et immunité) et nisFEG (immunité) sont contrôlés par le système à deux composants NisRK qui répond à la concentration de la nisine dans un système typique de Quorum Sensing10 (Lubelski et al., 2008). Ce mécanisme de Quorum Sensing a été également démontré pour les lantibiotiques de type II. La maturation des lantibiotiques est un processus qui met en jeu plusieurs réactions enzymatiques. La nisine A est synthétisée sous la forme d’un prépeptide inactif NisA, consistant en une séquence leader Nterminale attachée à un fragment peptidique. Ce précurseur est modifié par la NisB déshydratase qui déshydrate par phosphorylation-élimination la sérine et la thréonine avec l’intermédiaire du glutamylARNt-dépendante (Garg et al., 2013 ; Ortega et al., 2015). La Cyclase NisC favorise l’attaque nucléophile11 réversible de type Michael du groupement thiol d’une cystéine à un résidu déshydraté en extrémité N-terminale formant ainsi les anneaux méthyl-lanthionines (Lubelski et al., 2008 ; Yang et van der Donk, 2015). Le précurseur entièrement modifié est ensuite transporté avec la NisT et activé avec la protéase NisP (Lubelski et al., 2008). La lipoprotéine NisI qui peut se lier à la nisine A, et le complexe transporteur ABC12 (ATP binding cassette) multi-protéine NisFEG, qui expulse la nisine A de la cellule, comprennent le système d’auto-immunité pour la nisine A. Le système de régulation à deux composantes qui est responsable de la régulation positive de l’opéron de la nisine est composé d’une histidine kinase (NisK) et d’un régulateur de réponse (NisR). La nisine A sert de peptide signal qui active ce système de régulation (Perez et al., 20

Table des matières

Sommaire
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
1. Introduction
1.1. Généralités sur les bactéries lactiques
1.2. Classification des bactéries lactiques
1.3. Le genre Enterococcus…
– Historique
– Taxonomie et Physiologie des entérocoques
– Habitat des entérocoques
– Propriétés probiotiques des entérocoques
– Effets indésirables des entérocoques
1.4. Substances antimicrobiennes produites par les bactéries lactiques
– Acides organiques
– Reutérine et Reutéricycline
– Peroxyde d’hydrogène (H2O2)
– Dioxyde de carbone (CO2
– Diacétyle (2,3-butanedione
– Peptides antimicrobiens (Bactériocines
1.5. Classification des bactériocines des bactéries lactiques
1.5.1. Classe I
– Classe Ia (lanthipeptides de types I, II, III et IV
– Classe Ib (Peptides cycliques tête-à-queue
– Classe Ic (Sactipeptides
– Classe Id (Peptides linéaires contenant de l’azole ou l’azoline)
– Classe Ie (Glycocines
– Classe If (Peptides lassos
1.5.2. Classe II : bactériocines non modifiées (PM < 10 kDa)
– Classe IIa. Ou bactériocines de type pédiocine-like
– Classe IIb (bactériocines à deux peptides
– Classe IIc (Bactériocines sans séquence leader
– Classe IId (Bactériocines à peptide unique non pédiocine-like)
1.5.3. Classe III
1.6. Les bactériocines des entérocoques
1.7. Génomique et bases de données des bactériocines
2. Matériel et méthodes
2.1. Souches lactiques et conditions de culture
2.2. Purification et conservation des souches
2.3. Sélection de la meilleure souche bactériocinogène
– Méthode de Fleming et al. (1975)
– Méthode de Tagg et McGiven (1975) (Méthode de diffusion en puits
– Dosage de l’activité inhibitrice des bactériocines par microtitration
2.4. Identification de la souche bactériocinogène Enterococcus sp. GHB21
– Identification biochimique avec les galeries API 20 Strep
– Identification avec les cartes d’identification VITEK 2
– Identification moléculaire
2.5. Cinétique de croissance bactérienne et de biosynthèse des bactériocines
– Conditions statiques
– Fermenteur
2.6. Purification partielle par adsorption-désorption
2.7. Détermination du poids moléculaire des bactériocines d’Enterococcus sp. GHB 10. Étude génétique des bactériocines produites par E. faecium GHB21
3.10.1. Déterminisme génétique par curage de l’ADN plasmidique
– Extraction de l’ADN plasmidique d’E. faecium GHB21
– Essais de curage des plasmides d’E. faecium GHB21
– Sélection des variants curés
– Caractérisation des variants
3.10.2. Screening des gènes d’entérocines et déterminisme génétique par PCR
– Analyse de l’ADN total et du profil plasmidique de la souche E. faecium GHB21
– Recherche des gènes de structure d’entérocines chez la souche E. faecium GHB21
– Localisation des déterminants génétiques des entérocines EntA, EntB et EntP
3.10.3. Clonage, séquençage et annotation des séquences géniques
– Alignement des séquences entiA-GHB21, entAi-GHB21, entB-GHB21 et entF-GHB21
– Annotation des séquences clonées et prédiction de la structure 2D des peptides
3.10.4. Prédiction et modélisation de la structure 3D des peptides prédits
4. Conclusion et perspectives
5. Références bibliographiques
Annexes

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