Structures des chaines glycanniques des glycoproteines

Les glucides et glycoconjugues

Les glucides presentent la plus importante complexite, surtout en termes de variations structurales qui n’a pas d’egale dans les autres classes de polymeres biologiques. Du point de vue chimique, les sucres sont des polyhydroxy-cetones ou polyhydroxy-aldehydes. Les monosaccharides ont une formule generale du type CxH2xOx avec un nombre d’atomes de carbone de la chaine principale qui peut varier de trois a dix unites. Une caracteristique generale des sucres est que l’un des atomes de carbone porte une fonction cetonique ou aldehydique. Pour les structures a cinq (pentoses) et six atomes de carbone (hexoses), la condensation intramoleculaire est a l’origine de la structure cyclique (furanose ou pyranose) qui est la forme predominante en solution.

La cyclisation donne naissance a un nouveau centre chiral dans la molecule, le carbone anomere C1, qui peut avoir deux configurations appelees α ou β. Ce carbone anomere peut se condenser avec un des hydroxyles d’un deuxieme monosaccharide pour donner un disaccharide. Ainsi, l’addition de monomeres donne lieu a la formation de structures dont la complexite augmente considerablement avec le nombre de residus. Les structures les plus simples, lineaires ou branchees, sont formees par l’addition de deux a cinq monomeres et sont nommees en utilisant les prefixes di-, tri-, tetra- et pentasaccharides. Le terme oligosaccharides, concerne des molecules qui contiennent une vingtaine de monosaccharides. Les polysaccharides quant a eux, renferment plus de 20 residus et presentent une structure plus complexe. (Figure 1).

Relations structure-fonction

Les glucides presentent un potentiel important et exclusif qui resulte de leurs capacites a creer des structures de grande complexite, incluant des points de ramification a partir des simples monomeres. Par exemple un simple monosaccharide comme le glucose peut se lier par son carbone anomere (de facon α ou β) avec les cinq hydroxyles d’un deuxieme glucose, donnant naissance a onze isomeres structuraux differents. Par contre, deux acides amines differents peuvent se lier seulement de deux facons differentes. Les variations structurales engendrees par un tel type de molecules sont enormes. La structure des glycannes (oligosaccharides, glycoconjugues, polysaccharides) depend donc fortement de leur composition. Par ailleurs, la presence des liaisons glycosidiques induit une flexibilite structurale et conformationnelle considerable. La consequence directe de cette variabilite structurale est la grande diversite dans leurs roles et leur localisation dans les organismes vivants permettant le renforcement structural, l’accumulation d’energie, la reconnaissance moleculaire, la croissance, le developpement, la defense, l’ancrage et le ciblage.

La glycosylation cellulaire

Les glycannes couvrent la surface de toutes les cellules composant un organisme multicellulaire ayant la capacite de se differencier et de former des tissus[14]. La glycosylation est une modification essentielle des proteines et des lipides chez les levures et les eucaryotes superieurs. Elle affecte la resistance a la proteolyse, la solubilite, la stabilite, la structure et le turnover des proteines ainsi que leur immunogenicite[15]. Elle reste l’evenement post-traductionnel principal et le plus complexe de la maturation des proteines. La glycosylation consiste en une succession de reactions enzymatiques se deroulant chez les eucaryotes principalement dans le reticulum endoplasmique (RE) et dans l’appareil de Golgi. La partie glycosylee de la glycoproteine module non seulement ses proprietes physicochimiques mais possede egalement des fonctions specifiques dans la cellule, telles que les interactions ligand-recepteur ou encore le controle de la qualite du repliement des proteines[16]. Les glycosyltransferases font preuve par leurs nombreux substrats, d’une tres grande diversite fonctionnelle. Elles catalysent la liaison covalente de mono- ou polysaccharides sur differents substrats, en des sites bien definis. L’examen des banques de donnees suggere que 70% des proteines sont potentiellement des cibles de la glycosylation[17]. Concernant les lipides, plus de 200 structures glycanniques differentes ont ete identifiees [18].

La glycopathologie L’importance biologique des glycannes en pathologie peut se definir a trois niveaux :

– Leurs modifications structurales et quantitatives qui sont a l’origine de diverses situations pathologiques.

– Les pathologies engendrees par des defauts genetiques de la glycosylation.

– Le devenir des glycannes, normalement exprimes par les tissus, comme cibles de reactions immunitaires.

Le premier point est illustre par le cancer. En effet, les glycanes des cellules tumorales subissent des modifications profondes[4]. Les consequences fonctionnelles de ces alterations sont encore mal connues, mais il y a des elements indiquant qu’elles permettent aux cellules tumorales d’echapper au systeme immunitaire. Par ailleurs, elles pourraient etre responsables de la perte d’inhibition de contact et favoriseraient la proliferation. Il est important de noter que les cellules tumorales ne se mettent pas a exprimer des structures glycanniques anormales ; elles expriment le plus souvent des structures qui ne sont pas habituellement exprimees dans le tissu ou la tumeur se developpe et qui sont souvent des reminiscences de structures foetales. Leur etude structurale s’est averee tres fructueuse constituent des marqueurs diagnostiques, voire pronostiques de certains cancers[19]. L’un des exemples le plus etudie est le disaccharide Galβ(1,3)GalNAc- egalement appele antigene de Thomsen-Friedenreich ou antigene TF, ou encore antigene T. Cet antigene n’est generalement pas exprime par les cellules humaines normales car il est recouvert par un ou deux residus d’acide sialique.

En revanche, il constitue un marqueur important en cancerologie, car il est exprime dans 85% des tumeurs affectant les tissus epitheliaux[20]. D’autre part, l’augmentation de l’expression de certains glycannes, notamment les epitopes sialyl-Lewis X (sLex) et sialyl-Lewis a (sLea) dans les cellules cancereuses, augmente leur potentiel metastatique en raison de l’augmentation de leurs interactions avec les cellules endotheliales par le biais de la selectine E[21]. D’autres pathologies chroniques, comme l’arthrite rhumatoide est un exemple ou les glycannes semblent jouer un role important[22]. En effet, les patients atteints de cette maladie ont des immunoglobulines G (IgG) presentant une glycosylation anormale avec un defaut de galactosylation dans la region Fc, appelees formes IgG-G0, qui leur permet d’interagir avec le systeme du complement a travers la lectine ≪ mannose-binding protein ≪ MBP ≫ du collagene. Ceci suggere que l’inflammation chronique de la membrane synoviale est causee par la presence des glycoformes IgGG0 dans l’articulation affectee et de leur activation du complement[23].

Les niveaux d’activite des proteines MBP et IgG-G0 sont en correlation avec le moment de l’apparition de la maladie[24]. Le deuxieme point concerne des syndromes ou la glycosylation des glycoproteines est alteree. Ces syndromes, appeles ≪ Carbohydrate-Disorders of Glycosylation ≫ (CDG), sont generalement caracterises par une hypoglycosylation des glycoproteines seriques[25]. Il s’agit de maladies genetiques relativement rares dont les causes ne sont pas encore totalement elucidees. Au moins seize formes de CDG ont ete identifiees cliniquement, avec des alterations de la N-glycosylation. Les formes les plus severes affectent lourdement le systeme nerveux central. Si nous prenons en compte que la glycosylation est un evenement post-traductionnel qui affecte les proprietes et les fonctions proteiques et lipidiques d’une cellule, il est aise de comprendre pourquoi elle a un impact considerable sur de nombreux processus biologiques[2]. Ces dernieres annees en plus des alterations de la N-glycosylation, un large eventail de phenotypes lies a d’autres defauts de la glycosylation ont ete incorpores aux CDGs, comprenant l’exostose multiple hereditaire[26], le syndrome progeroide[27] et les dystrophies musculaires[28]. Des centaines de genes sont impliques dans la construction des glycoconjugues[1], ce qui suggere qu’un grand nombre de defauts potentiels dans les voies de biosynthese peut mener a des situations pathologiques de type CDG.

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela rapport gratuit propose le téléchargement des modèles gratuits de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

TABLE DES MATIERES
LISTE DES TABLEAUX
LISTES DES FIGURES
LISTE DES ABREVIATIONS.
INTRODUCTION GENERALE
1.Introduction
2.Objectifs
2.1 Objectif principal
2.2 Objectifs secondaires
2.3 Hypothese de travail.
EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE
1.Les glucides et glycoconjugues
1.2 Relations structure-fonction
1.3 La glycosylation cellulaire
1.4 La glycopathologie
1.5 Les glycoconjugues
1.5.1 Les glycoproteines
1.5.2 Les differents types de glycosylation
1.5.2.1 La N-glycosylation
1.5.2.2 La O-glycosylation
1.5.2.3 La C-glycosylation
1.6 Structures des chaines glycanniques des glycoproteines
1.6.1 Structure des N-glycannes
1.6.2 Structure des O-glycannes de type mucine
1.6.3 Structure des glycannes des glycolipides
1.7 Fonctions des glycannes des glycoproteines
2.Biosynthese des glycoproteines
3.Catabolisme des glycoproteines
3.1 Degradation des N-glycosylproteines
3.2 Degradation des O-glycosylproteines
4.Les enzymes de la glycosylation
4.1 Les glycosidases
4.2 Les glycosyltransferases
4.3 La fucosylation
4.3.1Le Fucose et son role biologique
4.3.2 Les fucosyltransferases
4.4 La sialylation
4.4.1 Les acides sialiques et leurs roles biologiques
4.4.3 Les sialyltransferases
4.4.4 Les sialidases
5.Glycoconjugues et cancers
6.Les oligosaccharides des glycoproteines et la migration cellulaire
6.1 Les Integrines comme recepteurs de matrice extracellulaire
6.2 Structure des integrines
6.3 Integrines dans le Cancer humain
6.4 Integrines et migration cellulaire.
6.5 Participation de l’integrine α3β1 a la motilite de cellules.
7.Methodes d’analyses des monosaccharides et glycoproteines
7.1 Determination de la composition centesimale en monosaccharides par methodes colorimetriques
7.1.1 Dosage des oses neutres et acides uroniques
7.1.1.1 Dosage des monosaccharides neutres
7.1.1.2 Dosage des acides uroniques
7.1.2 Dosage des osamines
7.1.3 Dosage des acides sialiques
7.1.3.1 Dosage des acides sialiques conjugues
7.1.3.2 Dosage des acides sialiques libres
7.2 Purification des glycoproteines
7.2.1 Methodes de relargage
7.2.2 Methodes chromatographique par immunoaffinite
7.3 Preparation de glycopeptides membranaires
7.4 Methodes d’analyse des glycoproteines
7.4.1. Detection de glycoproteines
7.4.1.1. Methode de fixation et coloration
7.4.1.2 Methode de detection par affinite
7.4.1.2.1 Methode aux Lectines
7.4.1.2.2 Methode Enzymatique
7.4.1.2.3 Methode basee sur des anticorps
7.5 Procedes de liberation des glycannes
7.5.1 Methodes chimiques
7.5.1.1 Hydrazinolyse
7.5.1.2 Coupure alcaline
7.5.2 Methodes enzymatiques
7.5.2.1 Coupure par les peptide-N-glycosidases
7.5.2.2 Coupure par les endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidases
8.La spectrometrie de masse appliquee a l’etude de biomolecules
8.1 Generalites sur la spectrometrie de masse
8.1.1 Le detecteur
8.1.2 Les sources d’ionisation
8.1.3 Les analyseurs
8.1.4 La spectrometrie de masse en tandem
8.2 Spectrometrie de masse MALDI-TOF
8.2.1. Introduction
8.2.2 La matrice MALDI
8.2.3 Le mecanisme d’ionisation MALDI
8.2.3.1 Excitation des molecules de matrice
8.2.3.2. Emission des ions en phase gazeuse
8.2.3.3 Ionisation des molecules en phase gazeuse
8.2.4 L’analyseur a temps de vol
8.2.4.1 Le MALDI-TOF lineaire
8.2.4.2 Le MALDI-TOF avec reflecteur et extraction retardee
8.2.5 La fragmentation en MALDI-TOF
8.2.5.1 Le PSD ou ≪ Post Source Decay ≫.
8.2.5.2 Analyse en PSD
8.3 La fragmentation proteo-oligosaccharidique
8.3.1 Nomenclature des fragments peptidiques
8.3.2 La fragmentation des oligosaccharides
8.3.2.1 Nomenclature de fragmentation des polysaccharides
8.3.2.2 Les fragmentations des polysaccharides a haute et basse energie
8.3.2.3 La determination de la sequence et du motif de branchement des polysaccharides.
8.3.2.4 La determination des isomeries de position
8.4 Strategies pour la caracterisation des proteines N-glycosylees par spectrometrie de masse
8.4.1 Analyse des glycoproteines entieres
8.4.1.1 Techniques de separation et de concentration
8.4.1.2 Analyse directe sur gel de polyacrylamide et membrane de PVDF
8.4.2 Analyse de glycoproteines entieres par spectrometrie de masse
8.4.3 Analyse MS des N-glycannes des peptides deglycosyles.
8.4.4 Detection des glycannes grace aux ions diagnostiques
8.4.5 L’analyse MS des glycopeptides
8.5 Sequencage et localisation des points de branchement des glycannes parMS
EXPOSE DES TRAVAUX REALISES
1.Methodologies et resultats
1.1 Etude des mucoproteines
1.1.1 Type de l’etude
1.1.2 Prelevements
1.1.3 Methodes de dosage des mucoproteines
1.1.4 Resultats
1.1.5 Dicussion
1.2 Dosage du fucose
1.2.1 type de l’etude
1.2.2 Prelevements
1.2.3 Methode de dosage du fucose
1.2.4 Resultats
1.2.5 Discussion
1.3 Dosage de l’acide sialique
1.3.1 Type de l’etude
1.3.2 Methode de dosage
1.3.3 Resultats
1.3.4 Discussion
1.4 Etude par spectrometrie de l’integrine α3β1
1.4.1 Type d’etude
1.4.2 Methodes
1.4.3. Protocole d’etude
1.4.3.1 Culture cellulaires
1.4.3.2 Chromatographie d’affinite
1.4.3.3 Electrophorese sur gel SDS-PAGE et immunodetection des sous-unites α3 et de β1
1.4.3.4 Analyse des chaines des Glycannes
1.4.3.5 Digestions par les Glycosidases
1.4.3.6 Extraction des sucres
1.4.3.7 Spectrometrie de masse MALDI-TOF MS
1.4.3.8 Analyse des integrines par ELISA
1.4.4 Resultats
1.4.5 Discussion
CONCLUSION GENERALE ET PESPECTIVES
Conclusion
Perspectives
ANNEXES.
Annexe 1
Annexe 2
Annexe 3.
Annexe 4
RÉFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
RESUME