Structure et stabilité des protéines

Afin de bien comprendre les fonctions rattachées aux protéines, il est primordial de comprendre les niveaux de structures et les forces dominantes qui régissent le repliement. En fait, l’architecture tridimensionnelle des protéines est complexe et étroitement liée à la fonction. Tout d’abord, le comportement et la structure sont déterminés par la composition chimique d’une enzyme qu’on appelle la structure primaire. La structure primaire est en fait la séquence des différents résidus d’acides aminés qui forme le polymère protéique. Les différentes chaines latérales de ces résidus ainsi que le squelette fait de liaisons peptidiques sont à l’ origine des différentes forces et contraintes qui sont à la base de la structure des protéines (Campbell, 1999). Des interactions faibles entre des dipôles, des ponts hydrogène, des interactions électrostatiques et la force hydrophobe expliquent le repliement spécifique adopté par les protéines. Dans une protéine, la formation de ponts hydrogènes ou de ponts salins permet d’abaisser l’ enthalpie par la neutralisation de dipôles ou de charges, permettant la formation de structures périodiques. Ces interactions peuvent imposer deux types de conformations spéciales, l’une de type hélicoïdal et l’autre en feuillet plissé. Elles sont  appelées structures secondaires et impliquent une répétition de la localisation dans l’espace du squelette du polymère peptidique. L’effet entropique qui est dominé par l’effet hydrophobe défavorise l’interaction entre l’ eau et le polypeptide déplié. C’est en fait l’aversion de l’eau envers l’état dénaturé (qui expose des résidus non polaires) qui stabilise l’état plié, natif des protéines et des enzymes (Berg et al. , 1991). La force hydrophobe a un effet déterminant au niveau de la structure des protéines. Ces forces tiennent leur nom d’une minimalisation du contact des substances non polaires, chaînes latérales hydrophobes, et l’eau (Nicholls et al. , 1991).

Pour mieux comprendre, il faut savoir que les molécules d’eau qui bordent la cavité constituée de groupements non polaires doivent s’orienter pour recréer un réseau de liens hydrogènes qui inclut la cavité. Cette orientation forcée des molécules d’eau décroit le désordre, car le nombre de ponts hydrogènes que l’eau peut former à la surface d’une région non polaire (hydrophobe) ainsi que le niveau de liberté de ces molécules d’eau est moindre que ceux qui sont accessibles dans l’eau pure. En ce qui concerne la structure, il est aussi possible de distinguer deux autres niveaux structuraux, soit tertiaires et quaternaires.

Le niveau tertiaire implique la formation d’une intercalation des éléments de structures secondaires qui permet de cacher un maximum de résidus non polaires, en atteignant un niveau de compacité quasi-cristallin. Les protéines et enzymes peuvent aussi être constituées de plusieurs chaînes polyp,eptidiques en interaction. Chacune de ces chaînes est considérée comme une sous-unité et l’assemblage constitue la structure quaternaire . L’hémoglobine est un exemple de protéine constituée de plusieurs sous-unités.

Certaines questions d’ordre assez fondamentales s’imposent lorsqu’on aborde la question de la structure des protéines. Est-ce que la structure native d’une protéine et ses propriétés est déterminée uniquement par sa séquence? Est-ce que le repliement est un processus opérant au fur et à mesure que la protéine est synthétisée? Est-ce que le mécanisme de repliement est fondé sur la réorganisation jusqu’ à l’ atteinte d’un minimum énergétique? En fait, le dogme d’Anfinsen suggère que seule la séquence détermine le repliement d’une protéine (Klumpp et Baumeister, 1998). Cependant, la possibilité d’obtenir un repliement très similaire par deux séquences d’ acides aminés différentes n’est pas surprenante. D’ailleurs, plusieurs protéines présentant un très faible degré d’identité adoptent un repliement semblable. Cela suggère que le repliement n’ est pas strictement déterminé par l’identité des résidus d’ acides aminés reliés les uns aux autres.

Certains résidus et certains motifs doivent nécessairement favoriser des interactions particulières à un repliement de manière à servir d’ encrage au processus de repliement. Ainsi, le paradoxe de Levinthal suggère que si la séquence d’ acides aminés explore l’ensemble des possibilités conformationnelles permises par sa chaîne polypeptidique, elle devrait essayer au moins  10¹⁴³ conformations possibles avant d’atteindre sa structure finale (Zwanzig et al. , 1992). Cela nécessiterait un temps supérieur à l’âge de l’univers, cependant le repliement des protéines est un processus quasi instantané. Il est donc impensable que toutes les possibilités soient explorées, ce qui suggère que le repliement doit s’effectuer par un cheminement préférentiel, un chemin ou « paysage énergétique » (HartI et Hayer., 2009).

Les enzymes lipolytiques

De manière générale, les enzymes lipolytiques font partie de la grande famille des hydrolases. Elles catalysent des réactions en lien avec différents substrats, tels que les phospholipides, les lipides et le cholestérol et sont connues par leur chimiosélectivité et énantiosélectivité. Dans la nature, elles sont ubiquitaires et se retrouvent dans les trois règnes du vivant jouant différents rôles physiologiques. Elles sont notamment impliquées dans la digestion chez les mammifères (lipases  pancréatiques permettant l’ absorption des lipides). D’ailleurs, elles sont de plus en plus reliées à certaines maladies par leur implication dans l’ absorption du cholestérol et le transfert des lipides entre les tissus (Kuranobu et al. , 2015). L’hyperlipémie congénitale est une maladie connue pour son lien avec les lipoprotéines: Elle pourrait survenir à cause d’ une carence en lipoprotéine lipase (Brunzell, 2014). L’implication au niveau des maladies est souvent la première idée qui vient en tête. Cependant, elles sont également connues par leur implication dans l’utilisation de sources de carbone et détoxification chez les microorganismes. Les bactéries synthétisent différents types d’ enzymes lipolytiques telles que les carboxylestérases et les lipases. De manière générale, elles catalysent l’hydrolyse des triglycérides afin d’ utiliser le glycérol relâché en tant que source d’ énergie suite à la conversion au niveau de la glycolyse.

Les lipases 

Les lipases (EC 3.1 .1.1) sont uniques dans leur genre par leur caractère versatile. Elles catalysent une panoplie de réaction avec des triglycérides; plus particulièrement, elles sont impliquées dans l’hydrolyse, la transestérification, l’interestérification, l’ alcoolyse et l’ acidolyse (Gandhi, 1997). Les réactions d’hydrolyse et de transestérification catalysées par des lipases ont été largement étudiées pour leur potentiel d’ application industrielle (Gandhi, 1997).

De plus, elles catalysent des réactions sur une large gamme de substrats. Les différences se trouvent au niveau de la longueur et de la saturation des chaînes d’ aliphatiques des triglycérides.

Au niveau de la structure, les lipases adoptent le repliement α/β hydrolase qui consiste en un noyau formé de feuillets bêta typiquement parallèles, mais qui pourraient aussi être mixtes. Ce dernier est bardé d’hélices alpha. Typiquement, les lipases possèdent une triade catalytique qui consiste en une Ser positionnée dans le coude nucléophile et d’un résidu acide (I’Asp ou le Glu) et une His (Ollis et al. , 1992; Nardini, 1999). Le niveau d’homologie est assez faible en ce qui concerne les lipases. Cependant, ce type de structure (α/β hydrolase) et la triade catalytique sont notamment adoptés par la majorité des enzymes lipolytiques. Il est donc intéressant de remarquer que cet échafaudage solide est possiblement à la base de l’ évolution de différents types de fonctions chez les enzymes lipolytiques. Le coude nuc1éophile est aussi bien conservé. Ce motif est typiquement formé d’un pentapeptide conservé GXSXG au niveau duquel la sérine est présentée (Arpigny et Jaeger, 1999; Nardini et al. , 1999).

Table des matières

CHAPITRE 1 INTRODUCTION
1.1 Les enzymes
1.2 Structure et stabilité des protéines
1.3 Les enzymes lipolytiques
1.4 Les lipases
1.5 Principes d’enzymologie
1.6 Détection de l’ activité lipase
1.7 Applications industrielles des lipases
1.8 Synthèse de biodiésel
1.9 Projet de recherche
CHAPITRE II
DEVELOPMENT OF A HIGH THROUGHPUT LIQUID STATE ASSAY FOR LIPASE ACTIVITY USING NATURAL SUBSTRATES AND RHODAMINE 
2.1 Contribution des auteurs
2.2 Résumé de l’article
2.3 Premier article scientifique
Abstract
Introduction
Materials and methods
Chemical and reagents
Liquid reaction mixture preparation
Activity assay and fatty acids standard curve
Colorimetric assay using p-nitrophenyl ester
Results and discussion
Determination of lipase activity using fluorescence from RhB olive
oil emulsions
RhB-OOe lipase activity detection under various conditions
Determination oflipase activity using RhB-OOe method
Conclusion
Acknowledgments
References
CHAPITRE III
CHARACTERIZATION OF A NOVEL ALKALOPHILIC LIPASE FROM ANEURINIBACILLUS THERMOAEROPHILUS: LID HETEROGENEITY AND ASSIGNMENT TO FAMILY 1.5
3.1 Contribution des auteurs
3.2 Résumé de l’article
3.3 Deuxième article scientifique
Abstract
Introduction
Materials and methods
Cloning of PCR products
Expression, purification and tag cleavage of recombinant LipA T
In silico analysis
Circular dichroism spectroscopy
Fluorescence spectroscopy
Dynamic light scattering analysis
Enzyme activity measurement
Lipase thermal stability measurements
Effect of metal ions
Biodiesel synthesis assay
Results and discussion
Production and purification of LipA T enzyme
Biophysical characterisation of LipA T
Enzymatic characterization
Potential industrial application: Biodiesel synthesis
In silico characterization
Conclusion
Acknowledgments
Declaration of interest
Funding information
Author contribution statement
References
CHAPITRE IV
DISCUSSION

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