Structure et propriétés des protéines

Structure et propriétés des protéines 

Structure des protéines 

Les protéines sont des macromolécules constituées d’un enchaînement d’acides aminés unis par des liaisons peptidiques [1].

Les acides aminés

Chez l’Homme, ainsi que chez de nombreuses espèces, il existe vingt acides aminés différents qui composent les protéines. Un acide aminé est une substance organique contenant un carbone tétraédrique central (α) sur lequel sont fixés une fonction amine, une fonction acide carboxylique, un hydrogène et un groupement variable appelé chaîne latérale (R) .

Hormis la glycine pour laquelle R est un hydrogène, ce carbone est asymétrique pour tous les acides. Pour les acides aminés naturels, la configuration stéréochimique de ce centre chiral est en général L (nomenclature de Fischer). Les formes D des acides aminés sont extrêmement rares. A l’état naturel, les acides aminés possèdent une structure zwitterionique. Cela signifie que l’entité est globalement neutre alors que la fonction amine porte une charge positive (-NH3+ ) et la fonction acide carboxylique porte une fonction négative (-COO-). Ces acides aminés présentent différentes propriétés physicochimiques suivant la nature des chaînes latérales. Ils peuvent être polaires, hydrophobes, acides ou basiques.

La liaison peptidique 

La liaison entre deux acides aminés, appelée liaison peptidique,  Elle se forme par une réaction de condensation entre le groupe α-carboxyle d’un acide aminé et le groupe α-amine d’un autre acide aminé donnant lieu à une liaison amide. Il en résulte une chaîne d’acides aminés constituant des peptides ou des protéines suivant le nombre d’acides aminés impliqués. Le terme protéine désigne les chaînes polypeptidiques dont le nombre de résidus est supérieur à 100. Lorsque le nombre de résidus est inférieur à 50, on parle de peptides, entre 50 et 100, on parle indifféremment de peptides, de petites protéines ou de polypeptides. Les groupes libres situés aux extrémités opposées d’une chaîne peptidique sont appelés le groupe N-terminal pour le groupe amine et le groupe C-terminal pour le groupe carboxyle.

Il est convenu de numéroter les acides aminés d’une chaîne peptidique en allant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale. Du fait de la présence de nombreux groupements acido-basiques, la charge globale portée par une protéine dépend donc du nombre de résidus acides et de résidus basiques ainsi que du pH de la solution dans laquelle elle se trouve. Le pH pour lequel la protéine ne possède aucune charge nette correspond au point isoélectrique (pI) de la protéine.

Conformations des protéines 

Il a été montré que la liaison peptidique est plane en raison de la présence d’un système conjugué. Il n’existe donc que deux configurations possibles du groupe peptidique, les isomères trans et cis. En général, les groupes peptidiques sont dans la configuration trans. L’isomère cis est en effet très défavorisé par l’encombrement stérique des chaînes latérales. Cependant, les autres liaisons N-Cα et Cα-C (figure I 2) sont des liaisons simples à libre rotation. Il en résulte de nombreuses conformations (c’est-à-dire des repliements) ou structures tridimensionnelles possibles des protéines. Cependant, dans les conditions physiologiques, chaque protéine possède une seule conformation spécifique, appelée état natif.

La structure des protéines,  peut être définie selon quatre niveaux :
– La structure primaire (I) qui correspond à la séquence proprement dite de la protéine, c’està-dire à l’enchaînement des acides aminés.
– La structure secondaire (II) qui décrit le premier niveau de repliement de l’enchaînement peptidique. Elle est assurée par des interactions de type liaisons hydrogène entre les acides aminés voisins et se caractérise par une conformation répétitive localisée. Il existe deux types de structure secondaire : l’hélice α et le feuillet β.
– La structure tertiaire (III) correspond au repliement et à l’assemblage en domaine des différents éléments de la structure secondaire. Il s’agit de la structure tridimensionnelle de la protéine. Elle est stabilisée par des interactions hydrophobes, des liaisons hydrogène, des liaisons ioniques ou encore des ponts disulfures (S-S), véritable liaison covalente formée par oxydation entre les fonctions thiols de deux cystéines.
– La structure quaternaire (IV) concerne les protéines constituées de plusieurs chaînes polypeptidiques et correspond à l’association de celles-ci par des interactions semblables à celles établies à l’intérieur d’une chaîne polypeptidique, c’est-à-dire des interactions hydrophobes, des liaisons hydrogène et dans certains cas, des ponts disulfures.

La structure primaire d’une protéine détermine une conformation spatiale unique décrite par la structure tertiaire ou quaternaire. D’une façon générale, la fonction d’une protéine dépend de sa conformation et repose sur sa capacité à interagir avec une autre molécule (ligand) de manière spécifique. La fixation du ligand entraîne souvent un changement conformationnel dans la structure de la protéine qui est impliqué dans son mécanisme d’action.

Stabilité des protéines 

La structure finale des protéines est stabilisée par des interactions non covalentes entre les acides aminés, voire covalente avec la formation de ponts disulfures. La rupture de ces interactions aboutit à la perte de la conformation tridimensionnelle de la protéine. La protéine est dite alors dénaturée et ne peut plus assurer sa fonction biologique. Les facteurs pouvant provoquer la dénaturation d’une protéine sont :
– la chaleur qui engendre une agitation thermique des atomes de la macromolécule et provoque une rupture des interactions faibles, comme les liaisons hydrogène,
– des pH extrêmes qui modifient les charges des chaînes latérales des acides aminés et altèrent donc les liaisons ioniques et hydrogène,
– une forte force ionique,
– un solvant organique,
– des agents réducteurs de thiols qui permettent la rupture des ponts disulfures. Suivant certaines conditions douces de dénaturation, les protéines peuvent se replier spontanément et retrouver leur conformation native lorsqu’elles sont replacées dans des solvants adéquats comme un tampon au pH optimum de l’activité de la protéine.

Le protéome 

Les protéines sont indispensables aux processus biologiques et jouent de nombreux rôles sur la structure et sur le fonctionnement de l’organisme. Elles sont donc présentes aussi bien dans les fluides biologiques que dans les membranes, les tissus, les muscles… Par analogie avec le terme génome, le protéome désigne l’ensemble des protéines exprimées par le génome d’une cellule, d’un tissu ou d’un organe à un instant donné et dans un environnement donné. Le génome est constant alors que le protéome est dynamique. En effet, il varie selon le type de cellule, son environnement et son activité. Un gène peut coder pour plusieurs protéines. De plus, en raison des variations possibles de la séquence des 20 acides aminés, du nombre d’acides aminés et des conformations, il existe bien plus de protéines de que gènes dont le nombre est estimé entre 20 000 et 25 000. De plus, des modifications post-traductionnelles telles que des acétylations, des phosphorylations et des glycosylations peuvent avoir lieu et contribuent à l’immense diversité des protéines. En fonction de leurs activités biologiques, on distingue plusieurs grandes classes de protéines comme les enzymes, les protéines de régulation (hormones peptidiques), les protéines de structure, qui assurent la rigidité structurale de la cellule (collagène), les protéines de protection (immunoglobulines ou anticorps), les protéines de transport (hémoglobine) et les protéines contractiles qui participent à la contraction musculaire… Les protéines remplissent des fonctions beaucoup trop nombreuses pour qu’une liste ou une classification précise puisse être établie. Dans le cadre de cette étude, le plasma sanguin a été utilisé comme matrice réelle. A cet effet, seules seront détaillées les protéines contenues dans ce fluide biologique.

Table des matières

Introduction
Chapitre I : Analyse des protéines
I.1. Structure et propriétés des protéines
I.1.1. Structure des protéines
I.1.1.1.Les acides aminés
I.1.1.2. La liaison peptidique
I.1.1.3. Conformations des protéines
I.1.1.4. Stabilité des protéines
I.1.1.5. Le protéome
I.1.2. Les protéines du plasma sanguin
I.2. Méthodes analytiques pour l’identification de protéines
I.2.1. Méthodes électrophorétiques pour l’analyse de protéines
I.2.2. Digestion enzymatique
I.2.2.1. Les enzymes
I.2.2.2. Principe de la digestion enzymatique
I.2.2.3. La digestion sur gel et en solution
I.2.2.4. Digestion sur support d’enzymes immobilisées
I.2.2.5. Conclusion
I.2.3. Méthodes chromatographiques
I.2.3.1. Approches conventionnelles
I.2.3.2. Nanochromatographie
I.2.3.3. Chromatographie multidimensionnelle
I.2.4. Détection par spectrométrie de masse
I.2.4.1. Principe
I.2.4.2. Les sources d’ionisation
I.2.4.3. Les analyseurs
1.2.4.4. Identification des protéines par spectrométrie de masse en tandem
1.2.4.5. Quantification des protéines
I.2.5. Conclusion
I.3. Traitement de l’échantillon
I.3.1 Principe de l’extraction sur phase solide
I.3.2. Analogie avec la chromatographie liquide
I.3.3. Modes de couplage
I.3.3.1. Extraction en différé
I.3.3.2. Couplage en ligne de l’extraction avec l’analyse
I.3.4. Diversité des supports
I.3.4.1. Les supports hydrophobes
I.3.4.2. Les supports échangeurs d’ions
I.3.4.3. Les supports polaires
I.3.4.4. Les phases à accès restreint
I.3.4.5. Les supports d’affinité
I.4. Conclusion
I.5. Références
Chapitre II : Utilisation d’outils bioanalytiques pour l’analyse d’une protéine ciblée
II.1. Extraction sélective d’une protéine ciblée
II.1.1. Présentation des supports sélectifs
II.1.2. Principe de l’immunoextraction
II.1.2.1. Les immunoglobulines ou anticorps
II.1.2.2. Mode d’obtention des anticorps
II.1.2.3. L’immunoextraction
II.1.3. Développement d’un immunoadsorbant
II.1.3.1. Techniques et supports d’immobilisation
II.1.3.2. Apport en sélectivité
II.1.3.3. Capacité et rendements d’extraction
II.1.3.4. Analyse en ligne
II.1.4. Conclusion
II.2. Digestion sur réacteur enzymatique
II.2.1. Introduction
II.2.2. Les techniques d’immobilisation non covalentes
II.2.2.1. L’adsorption
II.2.2.2. Encapsulation dans un gel
II.2.3. Les supports d’immobilisation covalente en formats conventionnels
II.2.3.1. Introduction
II.2.3.2. Digestion sur supports particulaires d’enzymes immobilisées
II.2.3.3. Les supports monolithiques en format conventionnel
II.2.4. Les IMERs en formats miniaturisés
II.2.4.1. Supports particulaires
II.2.4.2. Les phases à tube ouvert
II.2.4.3. Les monolithes organiques en formats miniaturisés
II.2.4.4. Les monolithes de silice en formats miniaturisés
II.2.5. Conclusion
II.3. Analyse totale en ligne d’une protéine ciblée
II.4. Conclusion
II.5. Références
Chapitre III : Développement d’une méthode de digestion en ligne
III.1. Une protéine modèle, le cytochrome c
III.2. Mise au point de l’analyse par LC-MS/MS
III.2.1. Montage expérimental pour l’analyse des peptides
III.2.2. Digestion trypsique en solution – Rappel des essais préliminaires
III.2.3. Analyse du digestat trypsique par LC-MS/MS et identification du
cytochrome c.
III.2.3.1. Analyse du mélange peptidique
III.2.3.2. Identification du cytochrome c
III.2.3.3. Méthode de quantification du cytochrome c
III.2.4. Analyse d’un digestat à la pepsine et identification du cytochrome c
III.3. Développement d’un microréacteur de trypsine
III.3.1. Digestion en ligne sur un support commercial de trypsine immobilisée
III.3.1.1. Présentation du montage
III.3.1.2. Développement d’une procédure de digestion en ligne
III.3.2. Synthèse et évaluation de réacteurs de trypsine
III.3.2.1. Choix du support et principe du greffage covalent
III.3.2.2. Principe d’évaluation des performances des réacteurs enzymatiques
III.3.2.3. Evaluation des réacteurs enzymatiques
III.3.2.4. Digestion en ligne du cytochrome c sur l’IMER de trypsine
III.4. Synthèse et caractérisation du réacteur de pepsine
III.4.1. Préparation de l’IMER
III.4.2. Développement de la procédure de digestion
III.4.2.1. Digestion du cytochrome c
III.4.2.2. Comparaison à la digestion en solution
III.4.2.3. Comparaison des performances avec l’IMER de trypsine
III.4.2.4. Linéarité de la réponse
III.4.3. Caractérisation de l’IMER de pepsine
III.4.3.1. Répétabilité de la synthèse
III.4.3.2. Influence de la densité de greffage sur la digestion du cytochrome c
III.4.4. Application à un mélange
III.5. Conclusion
III.6. Références
Conclusion

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