Soutenance mémoire
Structure et organisation génomique des rhinovirus
Les RVH sont de petits virus de 24 à 30 nm de diamètre, nus, à capside icosaédrique et dont le génome est un ARN monocaténaire de polarité positive. Leur densité est d’environ 1.32 à 1.35g/cm², et leur coefficient de sédimentation varie de 150 à 160 Svedberg. Comme tous les virus nus, ils résistent bien dans le milieu extérieur, à l’alcool 70°, à l’éther, au déoxycholate de sodium et aux détergents. Ils se conservent plusieurs années à -20°C.
Structure de la capside virale
Le génome est contenu dans une structure protéique appelée capside. Cette dernière est formée de 60 protomères, chacun étant constitué de 4 protéines (VP1 à VP4). Les protomères sont quant à eux organisés en 12 pentamères. VP1, 2 et 3 (environ 250 résidus et 35 kDa chacune) sont localisées à la surface du virus tandis que la VP4 est localisée sur la face interne de la capside et interagit avec le génome (figure 3). Toutes les structures de RVH identifiées montrent qu’au niveau de chaque axe de symétrie d’ordre 5, existe une dépression ou « canyon » d’environ 2 nm de profondeur et 1,5 à 3,5 nm de largeur. Il a été montré que cette dépression constitue le site d’attachement aux récepteurs humains du rhinovirus [63]. A la base du canyon, se trouve une poche hydrophobe parfois occupée par un ligand lipidique et qui constitue le site de fixation de certains antiviraux. L’étude par microscopie électronique et par cristallographie des protéines de la capside des EV a permis d’obtenir la structure tridimensionnelle (Figure 3). Elle a permis de comprendre les différents rôles de la capside qui sont de protéger le génome viral des nucléases de l’environnement, reconnaître un récepteur cellulaire spécifique, porter à sa surface les déterminants antigéniques, contenir les informations pour l’encapsidation du génome viral et la maturation des virions, et libérer le génome viral dans les cellules hôtes infectées .
Génome virale
Le génome des Picornaviridae est constitué d’un fragment d’ARN simple brin de polarité positive d’environ 7-9 kb de longueur. L’ARN est dit « infectieux » parce qu’il peut être directement traduit en protéines virales nécessaires à la réplication dès sa libération dans la cellule. Cette organisation génomique est généralement conservée pour l’ensemble des représentants de cette famille bien que de légères différences existent entre les genres humains et animaux. Le génome des Picornavirus (Figure 4) peut être divisé en quatre parties distinctes: une longue région 5’ non traduite (5’NTR) d’environ 800 nt, un cadre de lecture ouvert unique (ORF) d’environ 6400 nt de long, une courte région 3’ non traduite de taille variable et une queue poly(A) à l’extrémité 3’NC.
La région 5’ non codante (5’NC) ou 5’ Untranslate Région (5’UTR)
La région 5’ UTR est essentielle à la réplication et à la traduction du génome viral. En effet, la partie 5’UTR contient deux motifs hautement conservés, la structure IRES, site de liaison des ribosomes, ainsi qu’une structure dite « feuille de trèfle » (« cloverleaf ») (figure 4). L’élément cloverleaf interagit avec 3CD et PCBP2 (PolyC Binding Protein 2) pour initier la synthèse des ARN génomiques de polarités positive et négative [65], et pour réguler des processus de traduction et de réplication [66]. Une petite protéine virale VPg (3B), est liée de manière covalente à l’extrémité 5′ du génome, mais semble être clivée au début du cycle de réplication à partir de l’ARN génomique. Cette protéine est impliquée dans l’amorçage du génome viral pour la réplication, mais des études récentes ont montré que sa présence n’influence pas la traduction ou la réplication [67, 68]. Ainsi, son clivage à partir de l’ARN génomique, peu après sa sortie dans le cytoplasme, reste toujours sans explication, et il a même été avancé que VPg pourrait être nécessaire pour la bonne encapsidation des ARN génomiques nouvellement synthétisés dans les particules puisque seule VPg contenue dans l’ARN viral est trouvée dans les virions [68].
La région 3’ non codante (3’NC) ou 3’ Untranslate Région (3’UTR)
Cette région non codante du côté 3’ a une taille variable en fonction des différents sérotypes; de 60nts pour le poliovirus à 100 nts pour les Coxsackievirus B. Elle possède une structure secondaire complexe (3 domaines en « épingle à cheveux») qui jouerait un rôle dans l’initiation de la réplication de l’ARN viral [69]. Cette région 3’UTR se termine par une séquence ou queue polyadénylée d’environ 75 nts qui semble jouer un rôle dans la réplication et dans l’infectivité de l’ARN génomique [70].
La phase ouverte de lecture
De taille relativement conservée chez les entérovirus, la phase de lecture code pour une polyprotéine d’environ 250 kD qui va être à son tour successivement clivée par différentes protéases pour générer 11 protéines virales dont 4 structurales et 7 non structurales. Elle est divisée en trois régions : P1, P2 et P3 qui sont les précurseurs des différentes protéines. La région P1 code pour la polyprotéine P1 qui donne dans l’ordre les protéines VP4, VP2, VP3 et VP1 qui formeront la capside. En effet, la polyprotéine P1, libérée du reste de la polyprotéine par la protéase 2A, sera clivée en VP0, VP3 et VP1 par la protéase 3C, et VP0 en retour donnera ultérieurement les protéines VP4 et VP2 lors de l’assemblage du virion [71]. Les régions P2 et P3 vont donner les protéines dites non structurales impliquées dans le clivage de la polyprotéine, dans la réplication du génome viral, et dans l’inhibition des fonctions cellulaires [72]. P2 est le précurseur des protéines 2A, 2B et 2C, et P3 le précurseur des protéines 3A, 3B, 3C et 3D.
– 2A est une protéase, libérée de manière autocatalytique de la polyprotéine virale [73]. Elle est ensuite impliquée dans le clivage protéolytique du précurseur 3CD, et participe également à la réplication de l’ARN viral [74, 75]. Au niveau cellulaire, 2A est responsable du « shut-off » de la synthèse des protéines cellulaires par clivage protéolytique de la protéine p220 constituant le facteur d’initiation de traduction eucaryotique 4G, (eIF4-G, pour eucaryotique initiation factor 4G).
– 2B semble jouer un rôle structural dans les complexes de réplication virale [76], dans le blocage des processus de sécrétion des protéines cellulaires au niveau du réticulum endoplasmique [77], et dans la perturbation de l’intégrité membranaire de l’appareil de Golgi .
– 2C interviendrait surtout au cours de l’initiation de la synthèse de l’ARN de polarité négative [79]. Elle contient le site de résistance à la guanidine, une drogue inhibant la réplication entérovirale.
– 3AB participe à la réplication [81]. 3A pourrait intervenir dans l’inhibition de la communication réticulum-Golgi [82], ainsi que dans l’effet cytopathique viro-induit [83]. 3B (VPg) est uridylée en VPg-pU(pU) et sous cette forme, participe directement à la réplication du génome viral en servant d’amorce à l’ARN polymérase-ARN dépendante même si cette hypothèse est remise en cause par de récentes études
– 3CD est impliquée dans les processus protéolytiques permettant la maturation des protéines structurales [84](, ainsi que dans la réplication virale [85]. 3C est la protéase majeure responsable des clivages au sein des précurseurs P2 et P3 [86]. Elle serait également responsable du clivage d’un certain nombre de protéines cellulaires telles que le facteur de transcription TFIIIC, la TATA-binding protein TBP, le facteur de transcription CREB et le facteur oct-1, avec comme conséquence directe l’inhibition de la transcription cellulaire assurée par les ARN polymérases I, II, et III [87]. 3D est l’ARN polymérase-ARN dépendante, responsable de la synthèse des ARN positifs et négatifs .
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Table des matières
INTRODUCTION
1ere Partie : Revue de la bibliographie
I. Rhinovirus humain (RVH)
I.1 Taxonomie et classification des Rhinovirus
I.1.1 Genre entérovirus
I.1.2. Classification des Rhinovirus basée sur le séquençage
I.1.3 Classification selon le type de récepteurs cellulaires
I.1.4. Classification selon la position de la structure CRE dans le génome
I.1.5. Evolution des rhinovirus
I.2. Structure et organisation génomique des rhinovirus
I.2.1. Structure de la capside virale
I.2.2. Génome virale
I.3. Cycle de multiplication virale
I.3.1. Récepteurs cellulaires
I.3.2. Attachement, pénétration, décapsidation
I.3.3. Traduction de l’ARN viral et maturation de la polyproteine
I.3.4. Réplication du génome viral
I.4. Epidémiologie et pathologie associées au rhinovirus
I.4.1. Epidémiologie et circulation
I.4.2. Pathologies associées au RVH
I.5. Diagnostics
I.5.1. Détection d’antigène et sérologie
I.5.2. Isolement des rhinovirus sur cellule
I.5.3. Méthodes moléculaires
I.6. Stratégies thérapeutiques et prévention
I.6.1 Stratégies thérapeutiques
I.6.2. Prévention
II. Virus Respiratoire Syncytial (VRS)
II.1.Taxonomie et classification des VRS
II.2.Structure et organisation du génome
II.2.1. Structure du virus
II.2.2. Organisation génomique et protéines virales
II.3.Cycle de multiplication virale
II.3.1. Attachement et pénétration du virus
II.3.2. Transcription et traduction
II.3.3. Réplication de l’ARN viral
II.3.4. Assemblage des virions
II.4.Epidémiologie et pathologie associées au VRS
II.4.1. Epidémiologie et circulation
II.4.2. Pathologie associées au VRS
II.5.1. Diagnostics
II.5.1. Méthodes de culture cellulaire
II.5.2. Détection d’antigène
II.5.3. Méthodes moléculaires
II.6.Stratégies thérapeutiques et prévention
II.6.1. Stratégies thérapeutiques
II.6.2. Prévention
2éme PARTIE : TRAVAUX DE THESE
I. Problématique
II. Objectifs du travail
III. Présentation des résultats
IV. Méthodologie
IV.1. Population d’étude
IV.1.1.Recrutement dans le cadre de la surveillance de la grippe
IV.1.2.Recrutement en pédiatrie
IV.2. Détection Virale par RT-PCR en temps réel
IV.2.1.Extraction des acides nucléiques
IV.2.2.Détection virale par RT-PCR en temps réel
IV.3. Caractérisation moléculaire par RT-PCR classique
IV.3.1.Caractérisation moléculaire des Rhinovirus
IV.3.2.Caractérisation moléculaire des virus respiratoire syncytial
IV.4. Séquençage et analyse des séquences
IV.5. Analyse statistique
V. Résultats
V.1. Epidémiologie moléculaire des RVH et des VRS
V.1.1. Données démographiques et cliniques
V.1.2. Patients et infections virales
V.1.3 Rhinovirus
V.1.3.1. Détection des Rhinovirus
V.1.3.2. Analyses phylogénétiques des RVH
V.1.4. Virus Respiratoire Syncytial Humain (VRS)
V.1.4.1. Détection des VRS
V.1.4.2. Analyses phylogénétiques des séquences VRS
V.2. Impact clinique en pédiatrie des RVH et VRS
V.2.1. Données démographiques et cliniques
V.2.2. Etiologie Virale des Infections respiratoires en Pédiatrie
V.2.3. Analyses phylogénétiques des RVH et des VRS
VI. Discussion Générale
Conclusion
