Structure et composition des flavivivrus

Structure et composition des flavivivrus 

Les VZIK et VDEN sont constitués d’un génome d’ARN simple brin entouré d’une capside d’environ 30 nm de diamètre. Cette nucléocapside est elle-même recouverte d’une enveloppe lipidique et donne au virion mature l’aspect d’une particule sphérique lisse d’environ 50 nm de diamètre . Cette organisation structurale fait que ces virus sont très sensibles à de nombreux traitements tels que les lipases, des solvants lipidiques, des détergents et sont très efficacement inactivés par traitement à la betapropiolactone ou à une température supérieure à 56 °C.

Génome viral 

Les génomes des flavivirus sont des ARN simples brin d’environ 11 kb (Chambers et al., 1990). La majeure partie du génome consiste en un seul cadre de lecture ouvert qui code pour une polyprotéine d’environ 3400 acides aminés composant l’ensemble des protéines virales . Cet unique cadre de lecture est flanqué d’une région 5’ non codante d’environ 100 nucléotide et la région 3’non codante (3’NC) d’environ 500 et 700 nucléotides (Chambers et al., 1990).

Protéines virales 

Les virions matures contiennent trois protéines structurales. La protéine de la capside C, composant structural unique de la capside de symétrie icosaédrique, s’associe à l’ARN viral lors de l’encapsidation. La nucléocapside ainsi formée, est entourée d’une enveloppe composée de la protéine d’enveloppe E et de la protéine de membrane M associées aux lipides provenant de l’hôte cellulaire. Les virions immatures intracellulaires contiennent également la protéine prM, précurseur de M. Les protéines structurales C, prM/M et E du virion sont codées à l’extrémité 5’ du génome viral suivies des 7 protéines non structurales, dans l’ordre, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5 (Perera & Kuhn, 2008).

La protéine C
C’est une protéine d’environ 11 kDa chargée positivement. Par cette propriété, cette protéine neutraliserait les charges négatives de la molécule d’ARN viral, à laquelle elle est associée (Rice et al., 1985 ; Ma et al., 2004). Elle est la première protéine synthétisée et est essentielle dans l’assemblage et l’encapsidation de l’ARN génomique viral (Ferlenghi et al., 2001).

La protéine M
Deux formes de la glycoprotéine M ont été caractérisées : prM, contenue dans les virions intra-cellulaires immatures et précurseur de la protéine structurale M ; et la protéine M, contenue dans les virions extracellulaires matures. La glycoprotéine précurseur de la protéine M, prM est d’environ 26 kDa. La protéine prM joue un rôle dans l’assemblage et la morphogenèse des flavivirus. Le clivage de prM en M par les protéases de type furine du compartiment, trans-golgien permet aux virions de devenir infectieux (Perera & Kuhn, 2008).

La protéine E
La protéine E (environ 53 kDa) est la protéine majeure de structure. Elle est impliquée, à la fois, dans les processus d’attachement et d’entrée du virus dans la cellule (Lozach et al., 2005). La connaissance des différents épitopes (Heinz et al., 1990) et des ponts disulfures formés par les 12 cystéines parfaitement conservés chez les flavivirus (Nowak & Wengler, 1987), a permis de proposer un modèle de structure bidimensionnelle et tridimensionnelle pour l’ensemble des protéines E du genre (Rey et al., 1995). Ce modèle fait apparaître trois domaines antigéniques distincts A (domaine II), B (domaine III) et C (domaine I). Les propriétés antigéniques du domaine I seraient liées à la présence des ponts disulfures, en l’absence desquels la plupart des anticorps monoclonaux ne le reconnaissent plus (Heinz et al., 1990). Ce domaine est reconnu par les anticorps monoclonaux présentant les plus fortes activités de neutralisation et d’inhibition de l’hémagglutination. Le domaine III contient les sites de liaison aux récepteurs (Roehrig, 2003 ; Crill & Roehrig, 2001). De plus, les mutations responsables du changement de tropisme, affectant l’entrée virale, et responsables de modifications de virulence (Roehrig, 2003) y sont localisées. Le domaine II est formé par une boucle qui n’est maintenue par aucun pont disulfure ; en revanche, il porte pour de nombreux flavivirus un site de glycosylation. La protéine E du VDEN a 2 sites de glycosylation potentiels : Asn-67 (N67) et Asn-153 (N153). Ce dernier est conservé chez la plupart des flavivirus alors que l’Asn-67 n’est observé que chez le VDEN (Heinz et al., 2003). La glycosylation de ces sites jouerait un rôle dans l’attachement et l’entrée du virus dans la cellule (Scherret et al., 2001 ; Shirato et al., 2004 ; Lozach et al., 2005 ; Beasley et al., 2005; Bryant et al., 2007 ; Mondotte et al., 2007 ; Vasilakis et al., 2007).

La protéine NS1
La glycoprotéine non structurale NS1 (≈ 46 kDa) des flavivirus est essentielle à la réplication virale et peut être sécrétée dans le milieu extracellulaire (Noisakran et al., 2007). Cette glycoprotéine contient 2 ou 3 sites de glycosylations et 12 cystéines conservés qui forment des ponts disulfures (Mason et al., 1987). La protéine NS1 induit aussi la production d’anticorps chez l’homme (Heinz & Roehrig, 1990 ; Halstead, 2007).

La protéine NS3
La protéine NS3 est une protéine hautement conservée parmi les flavivirus. Seconde plus grande protéine virale (70 kDa), elle a trois fonctions, des activités de protéase en fusion ou non avec NS2B, d’hélicase et d’ARN tri-phosphatase (Hurrelbrink & McMnn, 2003). De ce fait, elle joue un rôle essentiel dans les clivages des précurseurs des protéines virales non structurales. Récemment une étude a montré que la NS3 est également impliquée dans le cycle de réplication viral (Patkar & Khun, 2008) .

La protéine NS5
La protéine NS5 est la plus grande (103 kDa) et la plus conservée des protéines des flavivirus. Elle a deux fonctions : une activité méthyltransférase à son extrémité N et une activité ARN polymérase-ARN dépendante à son extrémité C-terminal. Elle peut également ajouter une coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN génomique (Qi et al., 2008). La conservation de cette protéine et son rôle essentiel dans la réplication font qu’elle est une cible pour le développement de molécules antivirales (Malet et al., 2008).

Les protéines NS2 et NS4
Les régions du cadre de lecture comprises entre NS1 et NS3, et NS3 et NS5 donnent quatre petites protéines, NS2A (22 kDa), NS2B (14 kDa) et NS4A (16 kDa), NS4B (27 kDa), produites par l’activité protéolytique virale. La protéine NS2A est impliquée dans la formation du complexe de réplication (Chambers et al., 1989). La protéine NS2B s’associe avec NS3 pour former un complexe présentant une activité sérine protéase (Falgout et al., 1993). Les fonctions de NS4A et NS4B pourraient bloquer les voies de réponse aux interférons (Munoz Jordan et al., 2003). La protéine NS4B est aussi impliquée dans la réplication en interaction avec la protéine NS3 (Umareddy et al., 2007).

Cycle viral 

Les VZIK et VDEN se répliquent dans des cellules de mammifères (cellules de rein de chien : PDK, cellules de rein de singe vert : Vero) ou d’insectes (cellules de moustique Aedes pseudoscutellaris clone 61 : AP61, cellules de moustique Aedes albopictus : C6/36). Le cycle viral comprend plusieurs étapes, dont l’adsorption et la pénétration du virion dans la cellule, la réplication du génome viral, la synthèse et la maturation des protéines virales, et la formation et le relargage des virions (Qi et al., 2008).

Adsorption et pénétration

L’adsorption du virus se fait par interaction de la protéine E avec un récepteur cellulaire de l’hôte par endocytose (Gollins & Porterfield, 1986 ; Ng & Lau, 1988) ou par fusion de la membrane cellulaire au site d’attachement du virion (Hase et al., 1989). Les cellules dentritiques (DC) myéloïdes interstitielles sont les premières cibles du VDEN inoculé par le moustique à travers l’épiderme. La lectine de surface DC-specfic ICAM-3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN ou CD209) a été décrite comme récepteur d’attachement au VDEN via la reconnaissance de la glycoprotéine E de l’enveloppe virale (Navarro-Sanchez, et al., 2003 ; Lozach et al., 2005).

Réplication virale
Après pénétration dans la cellule et décapsidation, la réplication de l’ARN viral est initiée et un brin complémentaire, de polarité négative, est synthétisé. Celui-ci sert alors de matrice pour l’amplification des brins positifs, qui sont traduits ou encapsidés (Brinton, 1986 ; Westaway, 1987).

Table des matières

INTRODUCTION
A. GENERALITES
A. 1. RAPPELS SUR LES FLAVIVIRUS ZIKA ET DENGUE
A. 1. 1. CLASSIFICATION
A. 1. 2. CYCLE ECOLOGIQUE
A. 1. 2. 1. Vecteurs
A.1. 2. 2. Hôte
A.1.2.3. Cycle de transmission
A.1.2.3.1. Cycle sauvage
A.1.2.3.2. Cycle domestique
A.1.3. STRUCTURE ET COMPOSITION DES FLAVIVIVRUS
A.1.3.1. Génome viral
A.1.3. 2. Protéines virales
A.1.2.2.1. La protéine C
A.1.2.2.2. La protéine M
A.1.2.2.3. La protéine E
A.1.2.2.4. La protéine NS1
A.1.2.2.5. La protéine NS3
A.1.2.2.6. La protéine NS5
A.1.2.2.7. Les protéines NS2 et NS4
A.1.4. CYCLE VIRAL
A.1.4.1. Adsorption et pénétration
A.1.4.2. Réplication virale
A.1.4.3. Traduction et maturation des protéines virales
A.1.4.4. Assemblage et relargage des virions
A.1.5. EVOLUTION DES FLAVIVIVRUS
A.1.6. DIAGNOSTIC, TRAITEMENT ET PREVENTION
A.1.6.1. Diagnostic
A.1.6.1.1. Isolement et identification du virus
A.1.6.1.2. Le séro-diagnostic
A.1.6.1.3. Le diagnostic moléculaire
A.1.6.2. Traitement
A.1.6.3. Prévention
A.1.6.3.1. Lutte anti-vectorielle
A.1.6.3.2. Développement de vaccins
A.2. GENERALITES SUR LE VIRUS ZIKA
A.2.1. HISTORIQUE DU VIRUS ZIKA
A.2.2. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DU VIRUS ZIKA
A.2.3. MANIFESTATIONS CLINIQUES DU VIRUS ZIKA
A.2.4. SITUATION DU VIRUS ZIKA AU SENEGAL
A.3. GENERALITES SUR LE VIRUS DE LA DENGUE
A.3.1. HISTORIQUE DU VIRUS DE LA DENGUE
A.3. 2. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DU VIRUS DE LA DENGUE
A.3.3. MANIFESTATIONS CLINIQUES
A.3.3.1. La fièvre de dengue classique
A.3.3.2. La fièvre hémorragique de dengue et le syndrome choc
A.3.4. SITUATION DU VIRUS DE LA DENGUE AU SENEGAL
B – EVOLUTION MOLECULAIRE DU VIRUS ZIKA EN AFRIQUE DE L’OUEST
B.1. MATERIEL ET METHODES
B.1.1. MATERIEL
B.1.1.1. Cellules AP61
B.1.1.2. Virus
B.1.2. METHODES
B.1.2.1. Plan général de l’étude
B.1.2.2. Extraction d’ARN du virus Zika
B.1.2.3. Transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne du virus Zika
B.1.2.3.1. RT-PCR des génomes partiels
B.1.2.3.1.1. RT avec le Kit Superscript II
B.1.2.3.1.2. RT avec le kit Promega
B.1.2.3.1.3. PCR des génomes partiels
B.1.2.3.2. RT-PCR des génomes complets
B.1.2.4. Séquençage
B.1.2.5. Analyse phylogénétique
B.1.2.6. Recombinaison
B.1.2.7. Analyse phylodynamique
B.1.2.8. Analyse de migration
B.2. RESULTATS
B.2.1. ANALYSE DES ALIGNEMENTS DE SEQUENCES DU VIRUS ZIKA
B.2.2. ANALYSE PHYLOGENETIQUE DU VIRUS ZIKA
B.2.3. ANALYSE DES SOUCHES RECOMBINANTES DU VIRUS ZIKA
B.2.4. PHYLODYNAMIQUE DU VIRUS ZIKA
B.2.5. ANALYSE DE MIGRATION DU VIRUS ZIKA
B.3. DISCUSSION
B.4. CONCLUSION
C – DEVELOPPEMENT DE METHODES DE DETECTION MOLECULAIRES DU VIRUS ZIKA
C.1. MATERIEL ET METHODES
C.1.1. MATERIEL POUR LA RT-PCR QUALITATIVE ET QUANTITATIVE
C.1.1.1. Cellules Véro
C.1.1.2. Virus
C.1.2. METHODES
C.1.2.1. Plan général de l’étude
C.1.2.2. Méthodes RT-PCR qualitative
C.1.2.2.1. Construction des amorces pour la RT-PCR qualitative
C.1.2.2.2. Amplification par RT-PCR qualitative
C.1.2.2.3. Evaluation de la méthode RT-PCR qualitative
C.1.2.2.3.1. Spécificité
C.1.2.2.3.2. Seuil de détection
C.1.2.2.3.2.1. Titrage du virus Zika par la méthode des plages
C.1.2.2.3.2.2. Détermination du seuil de sensibilité
C.1.2.2.3.3. Répétabilité
C.1.2.3. Méthodes RT-PCR quantitative
C.1.2.3.1. Choix des amorces et de la sonde
C.1.2.3.2. Principe et conditions de la RT-PCR temps réel
C.1.2.3.3. Evaluation de la méthode RT-PCR quantitative
C.1.2.3.3.1. Spécificité
C.1.2.3.3.2. Seuil de détection
C.1.2.3.3.2.1. Préparation d’ARN standard
C.1.2.3.3.2.1.1. Transcription
C.1.2.3.3.2.1.2. Quantification de l’ARN synthétique
C.1.2.3.3.2.2.3. Détermination du seuil de détection
C.1.2.3.3.3. Répétabilité
C.2. RESULTATS
C.2. 1. RESULTATS RT-PCR QUALITATIVE
C.2.1.1. Choix des amorces
C.2.1.2. Evaluation de la méthode RT-PCR qualitative
C.2.2. RESULTATS RT-PCR QUANTITATIVE
C.2.2.1. Choix des amorces
C.2.2.2. Spécificité de la méthode RT-PCR temps réel
C.2.2.3. Seuil de détection de la méthode RT-PCR temps réel
C.3. DISCUSSION
C.4. CONCLUSION
D – VARIABILITE MOLECULAIRE DU VIRUS DE LA DENGUE 2 AU COURS DE SON INTERACTION AVEC LE MOUSTIQUE AEDES AEGYPTI
D.1. MATERIEL ET METHODES
D.1.1. MATERIEL
D.1.1.1. Cellules AP61
D.1.1.2. Virus
D.1.1.3. Moustiques
D.1.1.4. Souches bactériennes
D.1.2. METHODES
D.1.2.1. Plan général de l’étude sur le virus de la dengue
D.1.2.2. Infections expérimentales intrathoracique et orale des moustiques avec le virus de la dengue 2
D.1.2.2.1. Infection intrathoracique des moustiques
D.1.2.2.2. Infection orale des moustiques
D.1.2.3. Extraction d’ARN du virus de la dengue
D.1.2.4. RT – PCR de la région codante de la protéine E du virus de la dengue
D.1.2.5. Clonage de l’insert codant pour la protéine E du virus de la dengue
D.1.2.5.1. Préparation de milieux de culture
D.1.2.5.2. Préparation de bactéries compétentes
D.2.5.3. Clonage de la région codante de la protéine E du virus de la dengue 2 selvatique
D.1.2.5.4. Minipréparations
D.1.2.5.5. Séquençage et analyse
D.2. RESULTATS
D.2.1. REPLICATION DU VIRUS DENGUE 2 AU COURS DE SON PASSAGE EXPERIMENTAL PAR VOIE INTRATHORACIQUE ET ORAL CHEZ LE MOUSTIQUE AEDES AEGYPTI
D.2.2. VARIATIONS DE LA PROTEINE E DU VIRUS DENGUE 2 AU COURS SON PASSAGE INTRATHORACIQUE ET ORALE CHEZ LE MOUSTIQUE AEDES AEGYPTI
D.2.2.1. Analyse des séquences des domaines I et II de la protéine E du virus dengue 2
D.2.2.2. Analyse du domaine III de la protéine du virus dengue 2
D.3. DISCUSSION
D.4. CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE

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