Structure des protéines de la famille Girdin

Présentation du modèle d’étude

Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster, de son nom commun drosophile ou mouche à fruit, est un organisme largement étudié et possédant une génétique hautement malléable, ce qui en fait un modèle puissant pour la compréhension des mécanismes moléculaires liés aux maladies humaines. En effet, il a été estimé que plus de 75% des gènes associés aux maladies humaines ont des orthologues fonctionnels chez la drosophile (Reiter et al., 2001). On retrouve beaucoup de similitudes entre les drosophiles et les vertébrés au niveau du développement puisque les mécanismes biologiques fondamentaux sont très bien conservés au cours de l’évolution (Johnston, 2002). D’autres aspects intéressants du modèle sont que le génome de Drosophila melanogaster a été entièrement séquencé depuis l’année 2000 (Adams et al., 2000), qu’il existe souvent plusieurs gènes homologues ou paralogues chez l’humain par rapport à un seul orthologue chez la drosophile (ce qui élimine la redondance fonctionnelle) et qu’il s’agit d’un modèle peu coûteux à entretenir. De plus, beaucoup d’outils génétiques puissants ont été élaborés au fil du temps chez la drosophile (Johnston, 2002) et il existe d’énormes banques de lignées de drosophiles accessibles de partout dans le monde comme le Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University (B.D.S.C), le Vienna Drosophila Resource Center (VDRC) ou le Kyoto Stock Center (DGGR) afin de favoriser les découvertes scientifiques avec la drosophile.

Embryogenèse

Au cours de ce projet de recherche, nous nous sommes concentrés sur l’étude du développement embryonnaire de la drosophile. L’embryogenèse s’étale sur environ 21-24 heures à 25 C et est divisée en 17 stades (figure 1.2 A). Comme chez la plupart des insectes, le développement de D. melanogaster débute avec une succession de divisions nucléaires dans un cytoplasme commun sans nouvelle membrane cellulaire (sans cytodiérèse). Les premières divisions nucléaires sont coordonnées, faisant en sorte que les noyaux se divisent simultanément en un cycle. Chez la drosophile, il y a 13 cycles de divisions nucléaires qui s’effectue au cours des stades 1 à 4, débutant par une fusion pronucléaire (stade 1) et se terminant par la formation du blastoderme syncytial (stade 4). La cellularisation du blastoderme (stade 5) marque le début des divisions cellulaires asynchrones et se fait par l’invagination de la membrane plasmique de l’oocyte le long des sillons. Le blastoderme cellulaire est formé environ 3 heures après la fertilisation et est composé à cette étape de 6000 cellules longeant la périphérie du zygote (Hales et al., 2015). La gastrulation (stades 6-7) sert à spécifier les 3 feuillets embryonnaires de l’animal (mésoderme, endoderme et ectoderme) et est caractérisée par des décisions cellulaires et changements de forme qui amènent les cellules à se déplacer en groupes à différentes régions de l’embryon. Aux stades 8 à 10 se produit l’extension graduelle de la bande germinale, composée d’une couche interne mésodermique et externe ectodermique, le long du côté dorsal de l’embryon. Au stade 11, la bande germinale se divise en segments et l’invagination des fosses trachéales débute (Campos-Ortega et Hartenstein, 1985). À ce stade commence aussi la rétractation de la bande germinale qui se termine au stade 13, suivi de la fermeture dorsale de l’intestin moyen et de l’épiderme (stades 13-15). La fermeture dorsale est le processus d’élongation de l’ectoderme latéral de l’embryon le long de l’axe dorso-ventral jusqu’à ce que la surface dorsale de l’embryon soit couverte. Alors que la segmentation de l’épiderme se termine, l’involution de la tête commence (stade 15). Au stade 16, un dépôt de cuticule et des denticules avancés sont visibles, les organes du système gastrique et les organes sensoriels apparaissent et le patron musculaire somatique de la larve se distingue (Campos-Ortega et Hartenstein, 1985). Finalement, le stade 17 est caractérisé par la trachée qui se remplie d’air et par la complétion de l’organogenèse. Le stade 17 se termine par l’éclosion de l’embryon en premier stade larvaire.

Les jonctions intercellulaires La structure des tissus épithéliaux est générée et maintenue par des forces d’adhésion entre les cellules médiées par les complexes jonctionnels. Le complexe jonctionnel des cellules épithéliales des vertébrés comprend différentes structures dont les jonctions serrées (JS) ou zonula occludens (ZO) ainsi que les jonctions adhérentes (JA) qui incluent les zonula adherens (ZA) (Franke, 2009). Ces structures jonctionnelles sont conservées chez la drosophile, mais ce sont les jonctions septées (JSep) qui jouent le rôle fonctionnel des JS. Les JS et la ZA forment une ceinture autour de l’apex des cellules, leur permettant de se relier en un feuillet continu (Tepass, 2012). Plus précisément, les JS, situées en position apicale par rapport à la ZA (ou en position basale par rapport à la ZA pour les JSep chez la drosophile), scellent l’espace intercellulaire pour contrôler la diffusion d’ions ou de molécules à travers le feuillet épithélial. La ZA sépare la membrane apicale de la membrane basolatérale et forment des complexes d’adhésion cellule-cellule cruciaux pour l’embryogenèse et l’homéostasie des tissus (Harris et Tepass, 2010). En effet, la ZA s’associe aux faisceaux de filaments d’actine parallèles à la membrane plasmique (Hull et Staehelin, 1979) et la contraction de ces faisceaux d’actine par interaction avec la myosine II mène à la constriction apicale typiquement observée lors de la morphogenèse épithéliale durant le développement (Yonemura, 2011). C’est au cours de la cellularisation de l’épithélium du blastoderme que les ZA commencent à s’assembler sous forme de « spots » ou punctum adherens (PA) (Tepass et Hartenstein, 1994). Les PA sont retrouvés aux stades de développement précoces des jonctions et sont transformées en ZA dans les cellules épithéliales hautement polarisées (Yonemura et al., 1995).

Un complexe protéique faisant partie intégrale des JA est le groupe Nectines/Echinoid. Les Nectines modulent l’adhésion cellule-cellule et facilitent l’établissement de la polarité apico-basale en liant la région cytoplasmique d’Afadine, une protéine de liaison à l’actine qui ancre les Nectines au cytosquelette d’actine (Campbell et al., 2017). Cette interaction Nectine-Afadine est essentielle jonctions cellule-cellule et affaiblit les JA (Sato et al., 2006). Les cadhérines sont des récepteurs d’adhésion homophiles et transmembranaires. Dans les cellules épithéliales, la E-Cadhérine (E-Cad; DE-cadhérine chez la drosophile) est une composante centrale et essentielle de la ZA (Takeichi, 1991). Comme toutes les cadhérines, E-Cad possède des répétitions de cadhérine conservées au niveau du domaine extracellulaire avec des sites de liaison au Ca2+ qui stabilisent la structure d’E-Cad. Ces sites modulent les interactions homotypiques avec les autres molécules de cadhérine exprimées à la surface des cellules voisines (engagement en trans) (Coopman et Djiane, 2016). Les E-Cad peuvent aussi interagir en cis avec d’autres molécules d’E-Cad via leur domaine cadhérine extracellulaire. Puisque leur liaison est faible, il y a multimérisation des E-Cad pour renforcir l’adhésion cellule-cellule. Chez la drosophile, le gène shotgun (shg) encode la DE-Cad (Tepass et al., 1996). Les E-Cadhérines possèdent une queue cytoplasmique hautement conservée qui interagit avec un groupe défini de protéines cytoplasmiques nommées caténines via son domaine carboxy-terminal de liaison aux caténines (CBD) (Van Roy et Berx, 2008).

Les E-Cadhérines peuvent donc se lier indirectement aux microfilaments d’actine et au cytosquelette de microtubules via leur liaison à des protéines adaptatrices cytoplasmiques dont les principales sont la caténine p120 et la β-Caténine β-Cat; Armadillo (Arm) chez la drosophile (Van Roy et Berx, 2008; Desai et al., 2013). La p120 caténine contribue à la stabilisation d’E-Cad en inhibant son endocytose et en favorisant sa liaison aux microtubules (Davis et al., 2003; Shahbazi et al., 2013). Toutefois, la fonction de p120-caténine est dispensable chez Drosophila melanogaster, suggérant que p120 n’est pas un composant essentiel des ZA comme les cadhérines et les autres caténines (Myster et al., 2003). La β-Cat, elle, se lie à l’-Caténine (-Cat) pour former le complexe cadhérine-caténine (CCC), l’unité fonctionnelle centrale des ZA (figure 1.5), et réorganiser le cytosquelette d’actine en régulant la machinerie de l’acto-myosine (Perez-Moreno et Fuchs, 2006; Bertocchi et al., 2017). L’-Cat peut lier à la fois la β-Cat et les filaments d’actine lorsque les cellules sont sous tension (Buckley et al., 2014), mais il reste à déterminer si la réorganisation de l’actine est due à la liaison 10 directe de l’-Cat aux filaments d’actine, à l’activation d’-Cat par la tension et/ou via d’autres partenaires de la β-Cat pouvant se lier à l’actine (Kourtidis et al., 2017).

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Table des matières

Résumé
Abstract
Tables des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations et acronymes
Remerciements
Chapitre 1 – Introduction
1.1 Présentation du modèle d’étude Drosophila melanogaster
1.1.1 Le cycle de vie
1.1.2 Embryogenèse
1.1.3 Système UAS-GAL4
1.2 Les épithéliums
1.3 Les jonctions intercellulaires
1.4 La polarité apicobasale
1.4.1 Le domaine apical
1.4.1.1 Le module Par
1.4.1.2 Le module Crb
1.4.2 Le domaine basolatéral
1.4.2.1 Le module Scrib
1.4.2.2 Le groupe Yrt
1.4.3 Relation entre les déterminants apicaux et basolatéraux
1.5 La protéine Girdin
1.5.1 Présentation de la famille Girdin
1.5.2 Structure des protéines de la famille Girdin
1.5.3 Fonctions de Girdin
1.5.3.1 Liaison aux protéines G
1.5.3.2 Girdin et les voies de signalisation
1.5.3.3 Remodelage du cytosquelette d’actine
1.5.3.4 Régulation des microtubules
1.5.3.5 Régulation du transport vésiculaire
1.5.3.6 Girdin et les jonctions intercellulaires
1.5.3.7 Girdin et la polarité épithéliale
1.6 Polarité épithéliale et le cancer
1.6.1 Dérégulation de la polarité et TEM
1.6.2 Rôles des déterminants de la polarité dans le cancer
1.6.2.1 Les déterminants du domaine apical et la progression tumorale
1.6.2.2 Les déterminants du domaine basolatéral et la progression tumorale
1.6.3 Girdin et progression tumorale
1.7 Hypothèse et objectifs
Chapitre 2 – Matériel et méthodes
2.1 Immunobuvardage de type « Western Blot »
2.2 Immunoprécipitation
2.3 Essai phosphatase
2.4 Préparation de cuticule
2.5 Fixation de cellules S2, embryons et ovaires de drosophile
2.6 Immunofluorescence sur cellules S2, embryons et ovaires de drosophile
2.7 Microscopie, imagerie cellulaire et traitement des images
2.8 Génétique des drosophiles
2.9 Extraction d’ADNg de drosophiles
2.10 Anticorps
Chapitre 3 – Exploration de la relation fonctionnelle entre girdin et les principaux déterminants du domaine basolatéral
3.1 girdin et lgl
3.2 Girdin et Yrt
Chapitre 4 – Précision des mécanismes par lesquels Girdin régule le domaine basolatéral
4.1 Girdin et les JA un rôle commun dans la polarité épithéliale?
4.2 Girdin et aPKC
4.3 Girdin et Crb
4.4 Girdin et Baz
Chapitre 5 – Discussion et conclusion
5.1 Discussion
5.1.1 Girdin et les déterminants basolatéraux
5.1.2 La polarité, Girdin et les JA
5.1.3 Girdin et les déterminants apicaux
5.2 Perspectives
5.3 Conclusion
Bibliographie