Structure biochimique des molécules et gènes HLA

Structure biochimique des molécules et gènes HLA

Typage HLA B27

La technique utilisée est l’amplification de l’allèle HLA-B27 par PCR-SSP (SequenceSpecific Primers) : L’ADN génomique a été purifié en utilisant un kit commercial d’extraction d’ADN selon les instructions du manufacturer (wizard® Genomic DNA purification kit, Promega, WI, USA). L’exon 2 du gène HLA-B27 a été amplifié en utilisant les amorces d’oligonucléotides décrits par Sayer et al. 1999. L’amorce sens HLA27s (5’-GTGGGCTACGTGGACGACACGCT-3’) et l’amorce anti-sens HLA27as (5’-GTCAGT CTGTGCCTTGGCCTTGC-3’) permettent d’amplifier un fragment de 150-paires de bases (Pb) d’une région de l’exon 2. Comme contrôle interne, nous avons utilisé l’amorce G6PDs sens (5’-GGA GAT GGT GCAGAA CCT CAT GG-3’) et l’amorce G6PDas anti-sens (5’-CCA GAC ACA GCATCT GCA GTA GG-3’) permettant d’amplifier un fragment de 739-pb du gène G6PD (glucose-6-phosphate déshydrogénase). Ces amorces étaient synthétisées par GibcoBRL, France. La PCR-SSP conventionnelle du HLAB27 a été réalisée dans un volume final de 50 µl contenant 25 µl du tampon PCR Master Mix 2x (50 unités/ml de Taq DNA polymérase dans un tampon de réaction, pH 8,5, 400 µM de chaque dNTP, 3 mM MgCl2) (GibcoBRL, Life technologies, France), 2,5 µl de chaque amorce HLA-B27 (10 µM), 2,5µl de chaque amorce G6PD (10 µM), 10 µl d’eau stérile DNase-free et 5 µl d’ADN génomique purifié à partir du sang des patients. La PCR a été réalisée dans un thermocycleur TechGene PCR System thermocycler (Cambridge, UK), en utilisant un cycle initial de dénaturation à 95˚C pendant 5 min; deux cycles à 95˚C pendant 45 s, puis 72˚C pendant 1 min; suivi de 30 cycles à 95˚C pendant 45 s, 60˚C durant 40 s, puis 72˚C pendant 45 s, et une extension finale à 72˚C pendant 7 min. 20 µl des produits de PCR ont été séparés sur un gel d’agarose à 2% dans un tampon TBE (Tris–Borate–EDTA), le Bromure d’ethidium a été utilisé pour visualiser l’ADN par un transilluminator à ultraviolets. Le gel a été photographié et analysé pour l’expression du HLA-B27. Un marqueur de taille 100-bp (GibcoBRL, Life technologies, France) a été utilisé pour comparer les tailles des produits de PCR. Un exemple de résultats du test HLA-B27 par la PCR-SSP est montré dans la figure ci-dessous pour 8 patients.

LE SYSTEME HLA B27

Le HLA-B27 est un marqueur sérologique, recherché au niveau de la surface cellulaire des lymphocytes. Il représente une famille de 25 allèles (B*2701 à B*27023), aussi appelés sous-types, codant pour 23 protéines différentes qui diffèrent par la position de 24 acides aminés [2]. Le polymorphisme de HLA B27 est dû à la substitution de différents nucléotides codant pour la région présentatrice d’antigène (PBR : peptide binding region) à l’origine de différents allèles [3,4]. Les sous-types B27 diffèrent par des substitutions d’un ou plusieurs acides aminés correspondant à des variations des exons 2 et 3. Ceux-ci codent respectivement pour les domaines α1 et α2 de la molécule HLA B27. Tableau II. Le mécanisme moléculaire qui parait générer et maintenir le polymorphisme de HLA-B27 est la recombinaison intra allélique ou la conversion génique. Toutefois, la mutation ponctuelle est un mécanisme également important dans cette variabilité [5, 6,9]. Tableau III Le HLA B27 est présent chez 80% à 90% des sujets atteints de spondylarthropathies contre 5% à 7% chez la population caucasienne sans pathologies auto-immunes [7]. La variabilité des allèles de B27 dûe au changement de quelques acides aminés a un impact pathogénique important [10] : C’est l’exemple des allèles B*2718 et B*2723 qui changent au niveau de la pochette B par la position de Cystéine en 67. La pathogénie de ces allèles reste inconnue, mais il importe de remarquer que la mutation de Cystéine 67 en Serine en B*2705 HLA-B*2705 est clairement associé à la spondylarthrite ankylosante (SPA) et aux spondylarthropathies (SA) dans l’ensemble des régions géographiques, sauf sans doute dans les populations du Sénégal et de la Gambie [15,16,17]. B*2705 comprend les types B*27052, B*27053 et B*27054 qui diffèrent par des substitutions silencieuses d’un seul nucléotide. Le sous-type B*2713 est identique à B*27052, à l’exception d’une base (C changée en A) dans la région de l’exon 1 codant pour le peptide signal. Cette différence amène une substitution de Alanine en Glutamine en position 20 [20]. La structure de la protéine B*2713 est donc identique à celle de B*27052, B*27053 et B*27054. Si la modification du peptide signal est sans effet, il est ainsi probable que ce soustype serait associé à la spondylarthrite ankylosante (SPA) et aux spondylarthropathies (SA). HLA-B*2701 est un sous-type très rarement observé dans les populations caucasiennes, asiatiques, de métis hispano-indien et africaines d’Amérique. Ce sous-type a été associé à une SA dans une seule famille dans une étude menée par Taurog J en Oxford en 1998 [21]. Il diffère des autres par sa capacité à lier la glutamine ou l’arginine en P2 du peptide, alors que les autres ne peuvent se lier qu’à l’arginine [22]. La substitution du résidu 74 (tyrosine au lieu d’acide aspartique) se trouvant juste à l’extérieur de la poche B est sans doute à l’origine de la sélectivité particulière de B*2701 [22] Tableau II. HLA-B2702 est présent chez 4 à 10% des individus positifs pour B27 issus d’Europe du nord. Ces proportions atteignent 20% dans la péninsule ibérique (Espagne et Portugal) et vont jusqu’à 55% dans les populations sémites (Arabes et Juifs) [11, 23, 24, 25]. HLA-B*2703 et HLA-B*2717 diffèrent de B*2705 par la substitution d’un seul acide aminé : une tyrosine en position 59 substituée par une histidine pour B*2703 et par une phénylalanine pour B*2717 [26,27]. Tableau II. Les nouvelles méthodes d’étude génétique notent que tous les gènes HLA-B27 ne prédisposent pas forcément au risque élevé de développer la spondylarthrite ankylosante (par exemple, HLA-B*2706 et HLA-B*2709 n’y sont pas associés). transgénique chez des rats, aide au développement de maladies mais, expose moins aux arthrites [14].

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela chatpfe.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

INTRODUCTION
BUT DE L’ETUDE
MATERIELS ET METHODES
I- Le type d’étude
II-La population cible
1- Critères d’inclusion
2- Critères d’exclusion
III- Echantillon
IV- Variables étudiées
V- Déroulement de l’étude
VI- Saisie et analyse des données
VII- Considérations éthiques
VIII- Typage HLA B27
RESULTATS
I- Caractéristiques générales de la population étudiée
II- Caractéristiques démographiques
1- L’âge
2- Le sexe
III- Incidence du marqueur HLA B27
DISCUSSION
I- Rappel du système HLA
II- Fonction du système HLA
III- Structure biochimique des molécules et gènes HLA
Iv- Le système HLA B27
V- Répartition géographique de HLA B27 dans le monde
VI- Pourquoi établir le typage HLA B27 dans la population générale
CONCLUSION
ANNEXES
RESUMES
BIBLIOGRAPHIE