Soutenance mémoire
Stress Oxydatif et Homéostasie Redox
Généralités
Le stress oxydatif (ou stress oxydant) est défini comme étant un déséquilibre entre la production des dérivés réactifs de l’oxygène, ou ROS (Reactive Oxygen Species), et les défenses antioxydantes d’un organisme ou d’une cellule [1]. Ce concept a été introduit pour la première fois par Helmut Sies dans le chapitre introductif de son livre ‘Oxidative Stress’ publié en 1985 [2] et revu en 1991. Les publications dans ce nouveau domaine de l’époque se succèdent et s’affinent, le livre Antioxidant and Redox Regulation of Genes est paru en 1999. Quant aux articles scientifiques, ils sont publiés initialement dans différents journaux scientifiques en biologie et en enzymologie, et ensuite dans des journaux scientifiques dédiés qui ont vu le jour grâce au développement de la recherche dans ce domaine. Ainsi nous comptons actuellement plusieurs journaux spécialisés dont : Free Radical Research (depuis 1985), Free Radical Biology and Medicine (depuis 1987), Redox Reports (depuis 1999), Antioxidants & Redox Signaling (depuis 1999) et plus récemment Redox Biology (depuis 2013). Le nombre important de publications et articles scientifiques atteste de l’intérêt en ce domaine. Ce chiffre est en croissance continue depuis les années 1980 (Figure 1).
La définition initiale du stress oxydatif comme étant un déséquilibre a été ensuite mise à jour et complétée pour inclure les effets de ce déséquilibre, c’est à dire la perturbation de la signalisation et du contrôle redox et/ou des dégâts moléculaires. De nos jours, une définition plus large est acceptée pour englober toute perturbation de l’homéostasie redox puisque des teneurs en ROS inférieures aux niveaux physiologiques sont connues pour avoir elles aussi des effets délétères. Ceci provient du fait que les ROS jouent paradoxalement un rôle important en tant que messagers secondaires permettant la transduction de signal [3], [4].
Les dérivés réactifs de l’oxygène
Il est difficile actuellement de lire un journal médical sans rencontrer la notion des dérivés réactifs de l’oxygène ou de leurs implications dans diverses pathologies. La première mention de l’appellation « Reactive Oxygen Species » (ROS) remonte à 1977. Il n’est guère étonnant que le nombre d’articles s’intéressant à ces espèces, leurs spéciations, leur chimie et leurs rôles biologiques soit très élevé, rendant quasi impossible de trouver des revues pouvant résumer toutes les années de travaux de recherche sur les ROS. Mais, peu importe l’article ou la revue traitant le sujet, en évoquant les ROS, plusieurs types d’espèces sont souvent regroupés dans cette famille, à savoir des radicaux libres et des espèces non radicalaires.
Qu’est-ce qu’un radical libre ?
Les électrons occupent des régions de l’espace définies comme « orbitales ». Ainsi, un radical libre peut être défini comme étant une espèce chimique capable d’exister d’une manière indépendante et possédant un ou plusieurs électrons non appariés sur son orbitale externe [5]. La présence d’un électron non apparié confère à l’espèce une réactivité accrue vu la tendance naturelle de l’électron libre à s’apparier avec un autre électron [6]. La grande majorité des molécules biologiques sont non radicalaires. Il a été même longtemps considéré que les radicaux libres ne pouvaient pas exister dans les systèmes biologiques vu leur réactivité et par conséquence leur durée de vie réduite. La présence des radicaux libres a été démontrée pour la première fois dans un système biologique en 1954 [7].
Les espèces les plus impliquées
L’oxygène est un élément chimique présent naturellement dans tous les organismes et jouant une variété de rôles très importants. La structure de la couche de valence de cet élément (s2p4) fait qu’il est actif d’un point de vue redox dans les conditions physiologiques et participe ainsi à de nombreuses fonctions vitales. L’oxygène est présent sous des degrés d’oxydation allant de 0 pour le dioxygène O2 à -1 pour le peroxyde d’hydrogène H2O2. Les ROS proviennent essentiellement de réactions successives de réduction du dioxygène. Dans les cellules, plus de 95% de l’oxygène consommé par la mitochondrie est réduit directement en eau au niveau de la chaîne de transport d’électrons par la cytochrome C oxydase, sans production de ROS. Alternativement, une quantité minoritaire d’oxygène est réduite par des réactions successives avec ajout d’un seul électron, menant à la formation séquentielle de l’ion radicalaire superoxyde O2• – puis du peroxyde d’hydrogène H2O2. Le peroxyde d’hydrogène est en suite dismuté pour donner l’ion hydroxyle HO– et le radical hydroxyle HO• . Cette dismutation est connue sous le nom de la réaction de Fenton, réaction catalysée par un métal (Cu, Zn, Mn,…). La réaction de réduction du radical hydroxyle se termine par le gain d’un électron et d’un proton, menant à la formation de l’eau. Dans une cellule, cette dernière étape se déroule par l’interaction du radical hydroxyle avec une biomolécule telle que l’ADN, une protéine, un lipide ou une petite molécule, initiant ainsi une chaîne de réactions.
Quelles sont les sources de ROS ?
Les mitochondries
La consommation en oxygène des mitochondries représentent 85 à 90% de la consommation d’une cellule en oxygène. Cet oxygène est réduit essentiellement en eau, alors qu’une réduction partielle de l’oxygène mène à la formation de ROS. Les mitochondries possèdent leur propre système d’élimination des ROS qui sera détaillé plus loin. Cependant il a été démontré que les mitochondries produisent les ROS à des niveaux plus importants que leur élimination, ce qui conduit à un excédent de 1 à 3% de l’oxygène consommé suite à ce métabolisme incomplet [9], [10]. Ainsi il n’est guère étonnant que ces organites soient le site principal de la production des ROS. Il faut noter également que les mitochondries de différents tissus diffèrent dans leurs activités spécifiques et dans les enzymes qui participent au métabolisme. La production des ROS varie donc selon la disponibilité de l’oxygène dans les tissus et organes où ces mitochondries sont situées [11].
La consommation d’oxygène par les organismes vivants a été démontrée par Antoine Lavoisier qui écrit en 1789 [12]:
« … en général, la respiration n’est qu’une combustion lente de carbone et d’hydrogène, qui est semblable en tout à celle qui s’opère dans une lampe ou dans une bougie allumée et, sous ce point de vue, les animaux qui respirent sont de véritables corps combustibles qui brûlent et se consument. »
Les peroxysomes
Les peroxysomes constituent un autre site de génération de ROS dans la cellule. Ces organites omniprésents dans les cellules eucaryotes sont entourés d’une membrane simple et ne contiennent pas d’ADN. Identifiés en 1966 [22], les peroxysomes doivent leur nom à leur rôle fonctionnel en tant que sites importants du métabolisme du peroxyde d’hydrogène H2O2 . Ces organites varient remarquablement selon le type et l’environnement de la cellule, et peuvent avoir différentes formes et fonctions [23]. Initialement considérés comme une déchèterie cellulaire, les peroxysomes constituent réellement des organites actifs impliqués dans plusieurs processus cellulaires, qui vont de la régulation à la réponse cellulaire aux conditions de stress (xénobiotiques, cadmium, peroxyde d’hydrogène) [24]. La β oxydation des acides gras reste une des fonctions les plus conservées chez tous les organismes, de la levure à l’Homme [25] et constitue la source principale de production d’H2O2 au niveau des peroxysomes. Une autre espèce de ROS produite dans ces organites est l’ion radicalaire superoxyde O2• – . Deux sources de production de superoxyde ont été identifiées, la première se situe dans la matrice peroxysomale et s’agit de la xanthine oxydase qui catalyse l’oxydation de la xanthine en acide urique [26]. La deuxième source de superoxyde est associée à lamembrane peroxysomale, et plus spécifiquement au niveau de la chaine de transport d’électrons du peroxysome où trois polypeptides membranaires du peroxysome ou PMP (PMP18, PMP29 et PMP32) ont été identifiés comme sources de O2 • – [27]. Etant donné que le peroxysome constitue un environnement très oxydant menant à la génération de ROS, cet organite est doté tout comme la mitochondrie d’un système d’élimination des ROS qui comprend plusieurs enzymes dont la superoxyde dismutase, la catalase, la peroxyrédoxine et la glutathion peroxydase.
Le réticulum endoplasmique
Le réticulum endoplasmique est l’organite cellulaire où s’effectue principalement la maturation des protéines. Ceci comprend leurs repliements, leurs translocations et l’acquisition de modifications post-traductionnelles, tous indispensables à leurs fonctionnements. Dans le cas du repliement oxydatif, des ponts disulfure sont formés entre les résidus cystéines participant ainsi à l’établissement de la structure tridimensionnelle de la protéine, dite structure tertiaire. Cette opération est accomplie par l’action de la protéine disulfure isomérase (PDI) qui oxyde les résidus cystéines concernés. La PDI est régénérée par l’oxydoréductine-1 du réticulum endoplasmique (ERO1), l’oxygène étant l’accepteur final d’électrons, générant ainsi du peroxyde d’hydrogène H2O2 .
|
Table des matières
Introduction générale
Partie I : Contexte scientifique et technologique
I. Chapitre I : Stress Oxydatif et Homéostasie Redox
I.1 Généralités
I.2 Les dérivés réactifs de l’oxygène
I.2.1 Les espèces les plus impliquées
I.2.2 Quelles sont les sources de ROS ?
I.3 Les autres espèces réactives
I.3.1 Les RNS : les dérivés réactifs de l’azote
I.3.2 Les RSS : les dérivés réactifs du soufre et du sélénium
I.3.3 Les RCS : les dérivés réactifs du chlore
I.3.4 Les espèces contenant du carbone
I.4 Stress oxydatif ou homéostasie redox ?
I.4.1 Quels dégâts résultent du stress oxydatif ?
I.4.2 L’implication des ROS dans les pathologies et le vieillissement
I.4.3 ROS signalisation/défense immunitaire
I.4.4 Discussion
I.4.5 Les familles de protéines impliquées dans l’homéostasie redox
I.4.6 Les petites molécules impliquées dans l’homéostasie redox (exemple du glutathion)
II. Chapitre II : Les techniques mises en œuvre
II.1 La Protéomique
II.1.1 Généralités
II.1.2 L’approche ascendante ou bottom-up
II.1.3 L’approche descendante ou top-down
II.1.4 Comparaison des deux approches bottom-up et top-down
II.2 Les modifications post-traductionnelles
II.2.1 La protéomique redox et les modifications sur la cystéine
II.3 La quantification par spectrométrie de masse
II.3.1 Les méthodes de quantification en protéomique
II.3.2 La quantification des PTMs : défis et considérations générales
II.3.3 Discussion
II.4 Détection et quantification des modifications redox sur les cystéines
II.4.1 Considérations générales
II.4.2 La quantification des modifications redox sur les cystéines : Etat de l’art
II.5 Autres techniques pour la caractérisation des cystéines
II.6 Discussion
Partie II : Résultats et discussions
III. Chapitre III : OcSILAC, une stratégie analytique redox basée sur un marquage métabolique
III.1 Introduction
III.2 Le protocole de la stratégie OcSILAC
III.3 Les différentes étapes de la mise en place du protocole
III.3.1 La souche utilisée pour la mise au point : ΔTRR1
III.3.2 Le marquage SILAC
III.3.3 L’extraction des protéines
III.3.4 L’alkylation des cystéines libres
III.3.5 La réduction des cystéines oxydées
III.3.6 Le marquage à la biotine HPDP
III.3.7 L’enrichissement des cystéines oxydées
III.4 L’analyse nanoLC-MS
III.5 Traitement des données générées par OcSILAC
III.5.1 Préparation des données
III.5.2 Estimation des rapports de niveaux d’expression des protéines et des rapports des cystéines oxydées et réduites
III.5.3 Estimation des pourcentages des formes oxydée et réduite dans chacune des souches étudiées
III.6 Pour aller plus loin, le fractionnement subcellulaire
III.6.1 Vérification du blocage des cystéines libres
III.6.2 Etude de la possibilité d’oxydations non spécifiques dues au protocole modifié
III.6.3 Contrôle de l’efficacité du fractionnement subcellulaire
III.7 Conclusion
IV. Chapitre IV : OcSILAC – Résultats et Discussions
IV.1 Application du protocole OcSILAC au modèle de levure ΔTRR1
IV.1.1 Article en cours de soumission
IV.1.2 Commentaires
IV.2 Une première application du protocole OcSILAC avec fractionnement subcellulaire : cas du cancer anaplasique de la thyroïde
IV.2.1 Introduction
IV.2.2 Résultats et discussions
IV.3 Conclusion
V. Chapitre V : OxiTMT, une stratégie analytique redox basée sur un marquage chimique
V.1 Introduction
V.2 OxiTMT : le concept
V.3 La mise au point du protocole OxiTMT
V.4 Application du concept OxiTMT à l’étude d’une culture d’Escherichia coli traitée par un agent oxydant : article en cours de soumission
V.5 Commentaires et conclusion
Conclusion générale
