Stratégie d’obtention des anticorps anti-ETAR et protocoles

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Biodistribution d’ETAR et d’ETBR

Dans des conditions physiologiques normales, les récepteurs des ET sont distribués dans de nombreux tissus, cependant avec des niveaux d’expression différents. Schématiquement, dans le système vasculaire, alors qu’ETAR est présent à la surface des cellules musculaires lisses73, ETBR est principalement localisé au niveau des cellules endothéliales et dans une moindre mesure est exprimé dans les cellules musculaires lisses et les macrophages73, 74. Cette distribution n’est pas exhaustive, les récepteurs des ET étant présents dans de nombreux autres types cellulaires, comme indiqué Figure 6.

Modifications post-traductionelles des récepteurs des endothélines

Les récepteurs aux ET sont sujets à diverses modifications post-traductionnelles dont la N-glycosylation, la palmitoylation et la phosphorylation. Celles-ci sont principalement localisées au niveau des domaines N-terminale et C-terminaux d’ETAR et d’ETBR (Figure 5).
Des sites de N-glycosylation ont été identifiés dans la partie N-terminale d’ETAR et d’ETBR75, 76. Par ailleurs, des études de mutagénèse dirigée ont permis de mettre en évidence cinq sites potentiels de palmitoylation dans la queue C-terminale d’ETAR et trois dans la queue C-terminale d’ETBR77-79. Le degré de palmitoylation des récepteurs sur ces sites aurait une influence sur leurs couplages aux protéines G ainsi que sur les voies de signalisation déclenchées en aval, telles que l’activation de la phospholipase C (PLC) et des mitogen-activated protein kinases (MAPK) mais interviennent également dans l’ancrage de la queue C-terminale à la membrane77, 78, 80. Enfin, 15 sites de phosphorylation ont été découverts pour ETAR et 13 pour ETBR, principalement localisés dans la queue C-terminale des récepteurs78, 79. Ces phosphorylations peuvent notamment être réalisées par des kinases (les GRK) qui sont connues pour affecter le fonctionnement du récepteur. Nous reviendrons plus précisément sur ces phosphorylations dans la partie A. 3.
Toutes ces modifications post-traductionnelles des récepteurs aux ET sont autant de mécanismes de modulation de l’activité de ces récepteurs.
De plus, il a été montré qu’ETBR était clivé à son extrémité N-terminale par une métalloprotéase entre les résidus R64 et S65 et que ce clivage serait dû à la liaison de l’agoniste ET-1. Les deux isoformes du récepteur obtenues sont conservées dans de nombreuses espèces81. Cependant, il semblerait que les formes entière et tronquée du récepteur soient également présentes après production d’ETBR dans un système d’expression acellulaire, ceci indifféremment en présence ou en absence d’agoniste, ce qui met en doute l’hypothèse de clivage précédemment formulée82. Les auteurs ont de surcroit confirmé que la délétion observée se situait du côté N-terminal d’ETBR.

Dimérisation des récepteurs des endothélines

Comme c’est le cas pour de nombreux RCPG83, ETAR et ETBR sont capables de former des dimères ou des oligomères (Figure 7) qui influenceraient la liaison du ligand ainsi que l’activation du récepteur, sa désensibilisation et la transduction du signal84-86. L’oligomérisation de ces récepteurs a été mise en évidence dans des systèmes de co-expression des récepteurs par des expériences de co-immunoprécipitation et de FRET, toutefois cette dimérisation n’a pas été démontrée dans les cellules exprimant naturellement les récepteurs des ET.
La formation des dimères ne serait pas induite par le ligand mais serait constitutive84, 85, 87. Une étude plus ancienne laissait penser que l’ET-1 pouvait ponter entre eux ETAR et ETBR88 cependant, la modélisation de la structure d’ETBR réalisée par J. Lättig et ses collaborateurs va à l’encontre de cette théorie puisque le ligand viendrait se loger au cœur du récepteur19. Par ailleurs, il a été décrit qu’un motif PDZ présent en C-terminal d’ETAR ainsi que les segments tans-membranaires 2 et 4 du récepteur seraient impliqués dans l’homodimérisation du récepteur et son hétérodimérisation avec ETBR86. L’homodimérisation d’ETBR, tout comme la liaison d’ET-1, impliquerait quant à elle le premier segment trans-membranaire du récepteur89. Les conséquences de la dimérisation d’ETAR et d’ETBR sur la signalisation en aval sont encore mal définies. Une étude reposant sur l’utilisation de peptides correspondant aux extrémités C-terminales des récepteurs, supposées être constituées de trois hélices α qui servent de point d’ancrage lors de la dimérisation, a permis d’élucider certains points. Alors que dans une lignée exprimant uniquement ETAR l’expression du peptide correspondant à la troisième hélice d’ETBR conduit à l’augmentation de la signalisation par ET-1, au contraire, dans les cellules exprimant exclusivement ETBR, l’utilisation du même peptide a un léger effet antagoniste. La modélisation de la liaison semble indiquer que le peptide se lierait à la deuxième et à la troisième boucle intracellulaire d’ETAR90. Diverses études ont mis en évidence l’existence de voies de signalisation croisées. En effet il a été démontré dans certains cas que l’utilisation d’un antagoniste spécifique d’ETAR n’abolissait pas entièrement la contraction induite par le récepteur, mais qu’un antagoniste spécifique d’ETBR était nécessaire à une relaxation totale des vaisseaux. Un antagoniste sélectif d’ETAR et d’ETBR pouvait lui aussi induire cette relaxation. Ces résultats vont dans le sens de l’interaction ETAR/ETBR91, 92. Les effets de l’hétérodimérisation sur l’activité des récepteurs sont plus larges puisque l’internalisation plus lente de l’hétérodimère, en comparaison à celle d’ETBR, pourrait avoir des conséquences fonctionnelles importantes, ETBR étant crucial à l’élimination d’ET-1 de la circulation.
Il a également été suggéré qu’ETBR pouvait former des hétérodimères avec d’autres récepteurs comme le récepteur D3 de la dopamine93 et l’AT1R de l’angiotensine94 (Figure 7).

Signalisation de l’axe endothéline

Voies de signalisation associées à l’axe endothéline 

La transmission du signal extracellulaire des ET aux cibles intracellulaires est extrêmement complexe : l’activation des récepteurs des ET aboutit en effet à divers processus cellulaires par l’interaction et la régulation d’un large réseau de protéines de signalisation. Aussi, le but de cette partie n’est pas d’apporter une vue exhaustive des voies de signalisation de l’axe endothéline, mais plutôt d’en souligner la richesse et la complexité. Une attention plus particulière sera ici portée aux voies PLC et MAPK ERK1/2 qui ont fait l’objet d’une partie de mes études.

Couplage de ETAR et ETBR aux protéines G

La liaison des ET à leurs récepteurs ETAR et ETBR (appartenant à la grande famille de RCPG) conduit à l’activation de nombreuses fonctions cellulaires médiées par des voies de signalisation complexes qui sont dépendantes ou indépendantes des protéines G hétérotrimériques. Les récepteurs des ET sont généralement décrits comme couplés aux protéines G Gq, Gi, G12/13 et plus rarement à Gs96, 97. Le couplage de ETAR et ETBR aux protéines G met en jeu les boucles intracellulaires I2 et I398. Selon les modèles cellulaires, ce couplage est variable entre les deux récepteurs et peut être modulé par des modifications post-traductionnelles du récepteur, comme la palmitoylation99.
La stimulation des récepteurs aux ET peut également causer l’activation de voies de signalisation indépendantes des protéines G, mais dépendante de la ß-arrestine 32 (ß-arr)100, 101.

Couplage des récepteurs des ET à la voie PLC

ETAR et ETBR, via leur couplage à Gq/G11 ou à Gi, activent les PLC. Cette voie de signalisation conduit à la formation d’inositol trisphosphate (IP3) et de diacyglycérol (DAG) à partir de phophatidylinositol bisphosphate (PIP2). L’IP3 active des récepteurs canaux qui lui sont spécifiques, localisés dans la membrane du réticulum endoplasmique ou sarcoplasmique. La liaison de l’IP3 à ses récepteurs induit leur ouverture, ce qui conduit à la libération du calcium stocké dans le réticulum vers le cytosol. Cette augmentation rapide du Ca2+ cytosolique est impliquée dans la régulation des activités enzymatiques de nombreuses enzymes, en particulier les différentes kinases associées à la contraction des cellules musculaires lisses102, 103. Par ailleurs, le DAG est un activateur de la PKC104. En effet, le DAG, conjointement au Ca2+ et à la phosphatidylsérine (PS), active les protéines kinases C (PKC)105, 106, une famille de kinases à activité Ser/Thr possédant un très grand nombre de substrats. Dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), l’activation de la PKC par l’ET-1 participe à la régulation de la synthèse protéique107, de la prolifération cellulaire108, 109 et de la contraction110.

Couplage des récepteurs des ET aux GTPases de la famille Rho

Les récepteurs des ET, via leur couplage aux protéines G G12/G13, sont capables d’activer les petites protéines G de la famille Rho dont les principaux représentants sont RhoA, Rac et CDC42. L’activation de ces petites GTPase se fait par l’intermédiaire de facteurs d’échange nucléotidiques spécifiques de cette classe de protéines G appelés RhoGEF. Certaines formes de RhoGEF, comme p115RhoGEF, interagissent et sont activées par les protéines G G12 et G13111. Une fois activé, RhoGEF catalyse l’échange du GDP/GTP au niveau de la protéine G de type Rho, ce qui conduit à son activation. Ces GTPases de la famille Rho ont pour rôle majeur de contrôler le fonctionnement du cytosquelette d’actine et les diverses fonctions qui lui sont associées telles que la contraction, l’adhésion et la migration cellulaire112. Cette régulation fait intervenir plusieurs protéines kinases dont la RhoKinase (ROCK) qui est activée par RhoA ou la P21 Activated protein Kinase (PAK) activée par Rac et CDC42.

Couplage des récepteurs des ET à la voie adénylyl cyclase (AC)

Les AC sont des enzymes qui, à partir de l’ATP, produisent de l’AMP cyclique (AMPc), second messager qui, via la PKA (pour protéine kinase A) ou la protéine Epac (pour Exchange protein directly activated by cyclic AMP), est impliqué dans la régulation de multiples fonctions cellulaires. L’activité des AC est régulée par les sous-unités des protéines G (s,i ou le dimère). ETAR et ETBR sont généralement 34 couplés via Gi à l’inhibition des AC. Cette voie favorise la contraction des muscles lisses par ET-1114. La stimulation des AC par les ETR a été décrite115-118. Généralement la production d’AMP cyclique par les ET ne résulte pas du couplage direct d’ETR à Gs, mais à la production d’un médiateur dont le récepteur est couplé à Gs. En effet, des études119, 120 suggèrent que l’ET-1 stimule la production des prostaglandines, dont les récepteurs, via Gs, stimulent la production d’AMPc. Ce même mécanisme est également fonctionnel dans les cellules musculaires lisses pulmonaires et l’AMPc produit est impliqué dans la régulation des gènes dont l’expression est dépendante de CRE (pour Cyclic AMP Responsive Element)121.

ET et le signal calcique

Le calcium joue un rôle important en contribuant au contrôle des fonctions cellulaires impliquées dans la prolifération, la contraction, la migration, la survie et l’angiogenèse. Sa concentration intracellulaire est régulée par les récepteurs membranaires (RCPG et RTK, pour récepteurs à activité tyrosine kinase) qui déclenchent différents mécanismes. ET-1 est un excellent contracturant des muscles lisses grâce à la grande diversité des voies mises en jeu, parmi lesquelles l’augmentation de la concentration du calcium intracellulaire ([Ca2+]i). ET-1 augmente [Ca2+]i via l’activation de la voie PLC (A. 3. 1. b.), mais aussi via les canaux voltage-dépendants (VOC) et indépendants (TRP), par échangeur Na+/H+, les canaux ROC (receptor-operated Ca2+ channel)122.

ET et monoxyde d’Azote (NO)

Le NO participe à de nombreuses fonctions, en particulier il intervient dans la régulation du tonus vasculaire mais également dans la signalisation neuronale et dans les mécanismes de défense immunitaire20. Dans le système vasculaire, au niveau des cellules endothéliales, ET-1, via ETBR, active la NO-Synthase (eNOS), augmentant la libération du NO123, 124. NO, au niveau musculaire, active le groupement hème de la guanylate cyclase soluble, induisant la production de GMP cyclique (GMPc) qui provoque une réduction en [Ca2+]i et l’activation de la protéine kinase G (PKG). Activée, la PKG phosphoryle la sous-unité régulatrice de la myosine phosphatase (MYPT1) qui à son tour inhibe la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine et provoque ainsi l’arrêt du cycle de l’actomyosine et donc la relaxation des cellules musculaires lisses (CML)20. Par ailleurs, le NO semble avoir un effet inhibiteur sur la synthèse d’ET-1, en inhibant la transcription de la prépro-ET-120.

Voie des MAP kinases La famille des MAPK

Cette famille est composée de 4 sous-familles : ERK1 /2 (MAPK3/1), p38 (MAPK11-14), JNK (MAPK 8-10) et ERK5 (Big MAPK1 ou MAPK7) (Figure 9). Les membres de cette grande famille sont des Ser/Thr kinases impliquées dans la régulation de facteurs de transcription et dans la phosphorylation de protéines et enzymes du cytoplasme et du noyau. Les MAPK interviennent dans la prolifération, la survie, l’apoptose, la différenciation, la migration ou encore l’inflammation. Elles sont activées par une myriade de stimuli incluant hormones, facteurs de croissance, stress, cytokines… Leur activation est consécutive à une double phosphorylation au niveau d’un motif Thr-X-Tyr situé dans leur boucle d’activation.
Le module ERK1/2
Cette voie de signalisation est la première à avoir été élucidée et elle est une des plus étudiées126. Elle joue un rôle important dans la transmission de divers stimuli extracellulaires puisqu’elle se trouve activée en aval de RCPG, de RTK et également de canaux ioniques et permet l’intégration de ces différents stimuli.
L’initiation de la cascade de signalisation des MAPK ERK1/2 commence généralement par l’activation de la GTPase monomérique, Ras. Quatre isoformes de Ras sont décrites : H-Ras, N-Ras, K-Ras4A et K-Ras4B127. Lorsqu’elle est activée, Ras recrute à la membrane la MAPKKK (ou MAP3K) Raf (Raf-1, B-Raf, A-Raf) où elle va être activée par phosphorylation. L’activation de Raf est un phénomène complexe pouvant faire intervenir différentes protéines kinases comme la PKC, Src, PAK (pour p21-activated kinase) et la protéine kinase B (akt) mais aussi son interaction avec d’autres protéines telles que KSR (pour kinase suppressor of Ras) ou RKIP (pour raf kinase inhibitory protein)128. Une fois activée, Raf active la MAPKK MEK1/2 en la phosphorylant sur deux résidus sérine. MEK1/2 fait partie de la famille des protéines kinases à double spécificité, caractérisée par une double activité Ser/Tyr kinase, par opposition à la majorité des protéines kinases qui sont soit des Ser/Thr kinases soit des Tyr kinases. A leur tour MEK1/2 phosphorylent ERK1/2 sur les résidus Thr/Tyr contenus dans le motif TEY situé dans leur boucle d’activation. Cette double phosphorylation est nécessaire au maintien d’une configuration stable du domaine kinase129. ERK1/2, qui sont des Ser/Thr kinases, peuvent ensuite transmettre des signaux en phosphorylant, de façon spécifique, de très nombreuses protéines, de nature cytoplasmique, nucléaire, et même localisées dans les organelles130 (Figure 10). ERK peut par exemple réguler RSK, MNK1/2, TSC2 et cPLA2 dans le cytosol. Les kinases ERK peuvent également être transloquées dans le noyau où elles phosphorylent un ensemble de facteurs de transcription tels que ELK-1, c-Fos et c-Myc, associés à la prolifération cellulaire ou à d’autres fonctions physiologiques ou pathologiques130.
ET-1 active les MAPK ERK1/2 dans les CMLV par une signalisation indépendante de la protéine tyrosine kinase Src et du Ca2+, mais dépendante de Ras et Raf et de la PI3K131, 132. Au contraire, dans d’autres types cellulaires la signalisation Src/Ca2+ est indispensable80. Dans les cellules musculaires lisses utérines de rate, la PI3K contribue à l’activation de ERK1/2 par le récepteur ETAR133, alors que dans les cellules de léiomyome utérin, la PI3K n’intervient pas134, 135. Ces résultats soulignent une fois de plus la grande variabilité de signalisation entre différentes cellules, en réponse à un même stimulus.

ETR et la transactivation des RTK

La signalisation de l’axe endothéline est rendue encore plus complexe par l’existence de voies de signalisation croisées. Diverses études ont en effet mis en évidence l’existence de « cross-talk » ou communications entre les deux récepteurs des ET dans la circulation systémique et les muscles lisses non vasculaires91. De surcroît ETAR et ETBR, comme d’autres RCPG, sont capables de transactiver des RTK136, 137. Historiquement, ce type de transactivation a pour la première fois été mis en évidence en 1996 lorsque A. Ulrich et ses collaborateurs ont découvert que II induisait la phosphorylation d’un RTK, le récepteur du facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor receptor, EGFR), et la phosphorylation de ERK1/2 en aval136. Ce type de signalisation croisée a été observé dans différents types cellulaires. C’est la tyrosine kinase Src qui permet la transactivation de RTK tels que l’EGFR138 et le récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) VEGFR3139. Une étude a montré qu’une deuxième phase d’activation des ERK1/2 38 induite par ET-1 dépendait de Gi et de l’activation d’une métalloprotéase et du récepteur à l’EGF (epidermal growth factor)140. La transactivation d’EGFR a également été observée via l’activation par ET-1 de la protéase ADAM17, qui clive le précurseur membranaire de l’EGF pour produire de l’EGF soluble, qui va activer son récepteur, l’EGFR141.
Ces processus de transactivation dans la voie de ERK occupent une place importante dans les cancers, nous y reviendrons par la suite.

ETR et protéines d’interaction autres que les protéines G

Il est à présent largement admis que l’interaction physique et fonctionnelle des RCPG ne se cantonne pas aux protéines G mais s’étend à un ensemble d’autres protéines appelées GPCR-interactiong proteins (GIP). Les GIP conduisent les RCPG à activer des voies de signalisation indépendamment de leur couplage aux protéines G. L’oligomérisation des RCPG, traitée plus en amont (A. 2. 4.), souligne d’ailleurs l’existence de domaines d’interaction protéine-protéine tel que le domaine PDZ, présent en région C-terminale. Ces GIP qui régulent le trafic, la signalisation, la pharmacologie et la désensibilisation des récepteurs jouent un rôle important dans la formation de grands complexes fonctionnels appelés « réceptosomes »142.
La Jun activation domain binding protein 1 (Jab1) a par exemple été identifiée comme partenaire des récepteurs des ET. Cette protéine interagit avec l’extrémité C-terminale des récepteurs ETAR et ETBR et induit leur ubiquitination et leur dégradation143. Cet effet de Jab1 a pour conséquence de réduire l’activation des MAP kinases ERK1/2 en réponse à ET-1.
Parmi les GIP, les ß-arr sont les plus étudiées. L’activation d’un RCPG induit la translocation de la ß-arr du cytoplasme vers la membrane plasmique, où elle interagit avec le récepteur suite à la phosphorylation de celui-ci par des protéines kinases (PKC, PKA ou GRK), conduisant à son découplage des protéines G144. S’en suit l’internalisation du récepteur, détaillée en A. 3. 2. Si les ß-arr ont dans un premier temps été décrites pour leurs propriétés de désensibilisation et d’internalisation du récepteur, on sait aujourd’hui qu’elles remplissent également un rôle important dans la médiation du signal puisqu’elles jouent un rôle de protéines échafaudage, impliquées dans l’organisation de complexes signalétiques sophistiqués, notamment dans le cas de la voie des MAPK145-147. De plus, des expériences de migration cellulaire ont montré que l’expression de la ß-arr2 était essentielle à la migration de CML aortiques de rat, aspect fondamental du remodelage vasculaire par ET-1/ETAR148. Ces résultats montrent bien que les ß-arr sont des acteurs à part entière de la signalisation. Elles sont en effet également impliquées dans les phénomènes de transactivation des RTK décrits plus haut et il a été montré qu’elles intervenaient dans l’activation de la voie ß-caténine par ET-1149. Par ailleurs, la ß-arr est requise pour l’activation de NF-κB par ET-1/ETAR dans les cellules ovariennes cancéreuses150.
L’interaction physique et fonctionnelle des ß-arr avec les RCPG (indépendamment des protéines G) a ouvert une nouvelle voie pour la pharmacologie des RCPG et l’émergence de la notion de ligands dits biaisés. Ces ligands sont des agonistes ou des antagonistes capables de moduler sélectivement les effets dépendants ou indépendants des protéines G induits par des RCPG. Une seule étude suggère l’existence de ligands biaisés pour les récepteurs ET. Dans cette étude le bosentan semble se comporter comme un antagoniste biaisé non compétitif vis-à-vis du recrutement de la ß-arr par ETAR147. Toutefois, cette conclusion semble contradictoire avec le fait que le bosentan est par ailleurs décrit comme un antagoniste compétitif pour la liaison de l’ET-1 au récepteur ETAR.

Internalisation et désensibilisation des récepteurs des endothélines

L’internalisation, le recyclage et la dégradation sont autant de processus qui permettent une régulation fine de la signalisation des RCPG d’un point de vue temporel comme spatial. En effet, la désensibilisation d’un RCPG, suite à la liaison de son ligand, est un processus indispensable pour éviter une sur-stimulation qui entrainerait des dommages irréversibles pour la cellule. Par ailleurs il est important que les récepteurs soient sensibles à des stimuli faibles, les concentrations en ligand circulant étant la plupart du temps extrêmement réduites.
On distingue trois voies d’internalisation distinctes pour les RCPG : une voie dépendante de la clathrine151 ; une voie dépendante de la cavéoline152; une voie indépendante de la clathrine et de la cavéoline. Dans le cas des récepteurs des ET, la voie la plus décrite est la voie dépendante de la clathrine. Sous l’effet de la liaison des ET, ETAR et ETBR se trouvent rapidement internalisés par un processus mettant en jeu différents partenaires. Il s’agit de la famille des G protein–coupled receptor kinases (GRK), des ß-arr (les arrestines 2 et 3, respectivement appelées ß-arr1 et ß-arr2), de la dynamine et de la clathrine.
Ce processus d’internalisation des RCPG a été largement décrit, notamment dans le cas du récepteur ß2-adrénergique153. Le RCPG occupé par son agoniste est phosphorylé de façon spécifique sur des résidus sérine et thréonine par les GRK (Figure 11). N.J. Freedman et ses collaborateurs ont démontré, entre autres par des expériences de co-immunoprécipitation, que les ETR étaient préférentiellement phosphorylés par GRK2154, qui bloquerait la protéine G avant de phosphoryler le récepteur155. La phosphorylation du récepteur peut également être due à l’action d’une PKC ou d’une PKA125. La phosphorylation du récepteur conduit à la liaison et à l’activation des ß-arr. Il semblerait qu’ETAR soit préférentiellement désensibilisé par la ß-arr2148. Ainsi, le récepteur se trouve stériquement découplé de sa protéine G et dirigé vers les puits recouverts de clathrine (clahrine-coated pits, CCP)156.
Les récepteurs ETAR et ETBR internalisés sont dirigés vers les endosomes précoces avant de poursuivre des voies intracellulaires différentes157. Ces endosomes précoces sont discriminables par les marqueurs Rab5 et EEA1 (pour early endosome antigen 1). Contrairement à ETAR, ETBR est ensuite dirigé vers les endosomes tardifs, puis vers les lysosomes de dégradation157, 158 (Figure 11). Cette voie de dégradation d’ETBR et de son ligand, comme nous l’avons vu précédemment, constitue une voie importante dans la clairance de l’ET-1. En effet, on estime que 80% de l’ET-1 circulant dans les poumons y est retenue et éliminée par endocytose d’ETBR55, 159. Au contraire, ETAR est lui dirigé vers les endosomes de recyclage157. Des études supplémentaires de mutagénèse, consistant à remplacer la queue C-terminale d’un récepteur par l’autre, ont permis de mettre en évidence que le signal de recyclage d’ETAR se trouvait dans cette portion du RCPG160. Plus précisément, le recyclage du récepteur serait possible grâce à un domaine PDZ161. L’absence de ce motif chez ETBR expliquerait que le récepteur suive une voie de dégradation suite à son internalisation.

Table des matières

INTRODUCTION
A. Le système endothéline
1. Les endothélines
1. 1. Découverte de l’endothéline
1. 2. Structure des endothélines
1. 3. Biodistribution des endothélines
1. 4. La biosynthèse des endothélines
1. 5. Régulation de la biosynthèse et de la libération des endothélines
1. 6. Dégradation et clairance de l’endothéline
2. Les récepteurs des endothélines
2. 1. Découverte et structure des récepteurs des endothélines
2. 2. Biodistribution d’ETAR et d’ETBR
2. 3. Modifications post-traductionelles des récepteurs des endothélines
2. 4. Dimérisation des récepteurs des endothélines
3. Signalisation de l’axe endothéline
3. 1. Voies de signalisation associées à l’axe endothéline
3. 2. Internalisation et désensibilisation des récepteurs des endothélines
4. Rôles physiologiques et physiopathologiques de l’axe endothéline
4. 1. Rôle de l’axe endothéline dans le tonus vasculaire
4. 2. Rôle de l’axe endothéline dans le muscle cardiaque
4. 3. Rôle de l’axe endothéline dans les voies respiratoires
4. 4. Rôle de l’axe endothéline dans l’homéostasie rénale
4. 5. Rôle de l’axe endothéline dans l’embryogénèse
4. 6. Rôle de l’axe endothéline dans d’autres organes
5. Les récepteurs aux endothélines, cibles pharmacologiques
B L’axe endothéline dans la carcinogénèse
1. Expression de l’axe endothéline dans les cancers
2. Implication de l’axe endothéline dans la progression tumorale
2. 1. Prolifération
2. 2. Survie
2. 3. Migration et invasion
2. 4. Transition épithélio-mésenchymateuse et cellules souches tumorales
2. 5. Métastase
2. 6. Angiogenèse et lymphangiogenèse
2. 7. Inflammation et système immunitaire
2. 8. Ostéogenèse
2. 9. Douleur
3. L’axe endothéline, cible de la thérapie anticancéreuse
3. 1. Impact des modulateurs pharmacologiques de l’axe endothéline sur la progression tumorale
3. 2. Essais cliniques autour de l’axe endothéline dans le cancer
C. Immunothérapie anti-cancéreuse
1. Les traitements contre le cancer
1. 1. Les traitements de routine
1. 2. L’immunothérapie dans le traitement des cancers
2. Généralités sur les anticorps
2. 1. Les anticorps en quelques dates
2. 2. Structure des anticorps
2. 3. Les différentes classes d’anticorps
2. 4. Interaction de l’anticorps avec son antigène
3. Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique
3. 1. Des débuts de la sérothérapie au développement des anticorps monoclonaux
3. 2. De l’anticorps murin à l’anticorps humain
4. Mécanismes d’action des anticorps monoclonaux utilisés en oncologie
4. 1. Pharmacocinétique, pharmacodynamique et biodistribution
4. 2. Effets dépendants du fragment Fab
4. 3. Effets dépendants du fragment Fc
5. Ingénierie des anticorps thérapeutiques en oncologie
6. Anticorps monoclonaux thérapeutiques
6. 1. Les anticorps monoclonaux en oncologie
6. 2. Limitations toxiques des anticorps monoclonaux thérapeutiques
6. 3. Les récepteurs des endothélines : futures cibles des AcM en oncologie ?
OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE
PARTIE RESULTATS ETAR
A. Implication de l’axe ET-1/ETAR dans la carcinogenèse, exemple des cancers de l’ovaire et de la prostate
1. Axe ET-1/ETAR et progression tumorale
2. Cancers de l’ovaire et de la prostate : deux enjeux de santé publique
3. Axe ET-1/ETAR et cancer de l’ovaire
4. Axe ET-1/ETAR et cancer de la prostate
5. La thérapie : les traitements actuels, leurs limites et les nouvelles cibles moléculaires
B. Stratégie d’obtention des anticorps anti-ETAR et protocoles
1. Production des anticorps polyclonaux anti-ETAR
1. 1. Mise en place et caractérisation des outils cellulaires
1. 2. Le concept de l’immunisation génique couplée à l’électrotransfert
1. 3. Protocole d’immunisation génique
2. Production des anticorps monoclonaux anti-ETAR
2. 1. Choix des souris
2. 2. Mise au point du test de criblage des hybridomes
2. 3. Obtention des anticorps anti-ETAR par fusion cellulaire
C. Caractérisation des anticorps monoclonaux anti-ETAR
1. Les anti-ETAR reconnaissent spécifiquement le récepteur A humain des endothélines
2. Un des anti-ETAR inhibe la liaison de l’endothéline à ETAR
D. Perspectives
PARTIE RESULTATS ETBR
A. Le mélanome
1. Epidémiologie du mélanome
2. Types de mélanomes
3. Facteurs de risque du mélanome
4. Progression du mélanome
5. Les différents stades de développement du mélanome
6. Physiopathologie
6. 1. Développement des mélanocytes et axe endothéline
6. 2. Etiologie du mélanome
7. Les traitements du mélanome
B. Choix d’un AcM ciblant ETBR : du rendomab-B1 au rendomab-B4
C. ARTICLE
D. Conclusion et perspectives de l’article du rendomab-B4
DISCUSSION GENERALE – CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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