Stratégie de rappel hétérologue : prime-boost pour générer une immunité cellulaire protectrice

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STRUCTURE DU VIRUS EBOLA

Le virus Ebola est un virus enveloppé d’apparence filamenteuse, dont le génome est constitué d’ARN monocaténaire, linéaire de polarité négative, non segmenté. La longueur de la particule virale est d’environ 0,8 à 4 μm, son diamètre est de 80nm. Le génome de chaque virion a une longueur d’environ 19kb et code pour sept protéines structurelles et une protéine non structurelle. L’ordre des gènes est le suivant : 3′ – leader – NP – VP35 – VP40 – GP/sGP

CYCLE DE REPLICATION VIRALE

Le cycle de réplication du virus Ebola comporte onze étapes. L’initiateur du cycle est le phénomène d’attachement, puis survient l’internalisation, la transcription, la réplication et la libération de virions. Ces étapes correspondent à un processus viral unique et atypique du virus Ebola. Le virus Ebola, par ses spicules et sa glycoprotéine (GP) se lie à des récepteurs des cellules de l’hote (Takada et al., 2000 ; Kondratowicz et al., 2011). Ensuite, le virus est internalisé dans un macropinosome, puis traité dans un compartiment endosomal contenant la cystéine protéase (Nanbo et al., 2010 ; Carette et al., 2011 ; Côté et al., 2011). Ces protéases digèrent la GP qui est alors stimulée pour initier la fusion entre les membranes virales et les endosomes (White et al., 2012). Après la fusion, la nucléocapside virale est libérée dans le cytoplasme, où le génome est répliqué (Miller et al., 2012), puis se produit la transcription. L’ARNm codant GP sont amenés vers le réticulum endoplasmique (RE), où la GP est synthétisée, et sera modifié avec des sucres N-liés et trimérisés. La GP est en outre modifiée dans l’appareil de Golgi et livré à la membrane plasmatique dans des vésicules sécrétoires (Muhlberger et al., 2007). À la membrane plasmatique, le complexe de ribonucléoprotéine (ARN ainsi que la nucléoprotéine (NP) et les protéines virales associées assemblent avec les protéines associées à la membrane (protéines de la matrice VP24 et VP40, et GP), et les virions obtenus bourgeonnent à partir de la surface cellulaire (Noda et al., 2002). Les formes non structurelles du GP, y compris GP soluble (sGP), sont également sécrétées (figure 4).

REPONSE IMMUNITAIRE DANS LA MALADIE A VIRUS EBOLA[ PMC FREE ARTICLE ] [  PUBMED ]

Plusieurs mécanismes immunologiques seraient impliqués dans la pathogenèse de l’infection par le virus Ebola impliquant une réponse immunitaire innée et adaptative :
– la dérégulation de l’immunité innée, impliquant une inhibition de la réponse aux IFN de type I et II, une sécrétion non conforme des cytokines / chimiokines, une altération fonctionnelle des cellules dendritiques et des NK
– la dérégulation de l’immunité adaptative impliquant à la fois la réponse immunitaire à médiation cellulaire et humorale (Figure 6)

Immunité innée

L’infection à EBOV va induire des dysfonctionnements des cellules de l’immunité innée.

Les Cellules Présentatrices d’Antigène

❖ Monocytes / macrophages
L’attachement et l’entrée des virions par les CPA vont induire la production de plusieurs médiateurs inflammatoires dans les premières heures d’exposition au virus Ebola ; c’est-à-dire avant l’expression génique du virus. Ce qui aura pour conséquence la production massive et dérégulée des cytokines et chimiokines qui désorienteront et désorganiseront la réponse immunitaire innée et aura des conséquences dramatiques sur l’hôte pendant et après la pathologie si le malade survit (Figure 6b) (Baize et al., 2002).
❖ Cellules dendritiques
Les cellules dendritiques immatures fonctionnent comme des sentinelles du système immunitaire. L’infection de ces cellules par le virus EBOLA va engendrer leur dysfonctionnement. Ce qui aura pour conséquence le manque d’initiation de la réponse immunitaire adaptative et facilitera la réplication virale systémique non contrôlée (Figure 6c)

IFN de type I et II

La réponse aux IFN de type I et II est l’un des premiers et principaux mécanismes innés impliqués dans la réponse immunitaire antivirale. Celle-ci suggère une protection pendant l’infection par le virus EBOLA. L’infection par le virus Ebola va induire l’altération de la production d’IFN de type I par les cellules infectées et empêcher la protection des cellules non infectées. Quant’ à l’INF de type II, leur production sera altéré par le virus Ebola empêchant ainsi l’activation des CPA (figure 6a) (Mahanty et al., 2003).

Cellules tueuses naturelles (NK)

Les cellules NK jouent un rôle crucial avec leur capacité à réguler la cytotoxicité protectrice directe et à induire une réponse immunitaire adaptative en favorisant la maturation des cellules dendritiques. L’infection par le virus EBOLA va induire une apoptose massive de la NK et altérer l’aide à la maturation de la cellule dendritique . Ainsi, la perte massive de cellules NK dans le sang aura un impact sur la défaillance de la clairance des cellules infectées mais également va être partiellement responsable des signaux de maturation déséquilibrés pour les cellules dendritiques (figure 6d) (Fuller et al., 2007).

Immunité Adaptative

L’infection par EBOV va induire le dysfonctionnement des cellules d’immunité adaptative.

Réponse Cellulaire

L’infection par le virus Ebola induit le disfonctionnement des CPA empêchant ainsi la stimulation des lymphocytes T et l’induction de la réponse adaptative. L’interaction inappropriée des cellules dendritiques / lymphocytes T va induire l’apoptose des cellules T, bloquant ainsi toute fonctionnalité (Mahanty et al., 2003 ; Bosio et al., 2003 ; Warfield et al., 2011 ; Wong et al., 2012).

Réponse humoraleMoreover, death and hemorrhage were associated with elevated  thrombomodulin and ferritin levels.

La production d’anticorps représente la meilleure corrélation de la protection pendant l’infection par le virus Ebola. Chez des survivants, des réponses humorales robustes, caractérisées par des taux d’IgM et d’IgG précoces et croissants ont été observées pendant la phase aigüe de l’infection, suivies par la disparition des marqueurs de réplication virale circulante. Mais les protéines virales notamment GP soluble (sGP) et de GP glycosylé, vont contrôler les anticorps et entrainer ainsi la propagation du virus (figure 7a) (McElroy et al ; Warfield et al., 2005 ; Wong et al., 2012).

Apoptose lymphocytaire

Lors de l’infection par le virus EBOLA, nous avons remarqué une lymphopénie dans les cas fatals. Ceci est le résultat d’une apoptose massive des lymphocytes T et des cellules NK (Baize et al., 1999). Ces types cellulaires n’étant cependant pas infectés par le virus, plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer ce phénomène :
– des dysfonctionnements d’activation des DC (figure 7),
– la production de médiateurs solubles comme l’oxyde nitrique NO ayant des effets pré-apoptotiques,
– l’activation des voies des récepteurs de mort induites par leur ligand FasL et TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)
– ou encore les interactions avec les protéines virales comme la GP pourraient être impliquées (Mahanty et al., 2003 ; Geisbert et al., 2003 ; Hensley et al., 2002).
Ces interactions inappropriées induisent une apoptose des cellules T, bloquant ainsi leur fonctionnalité. Ce qui aboutira à un effondrement marqué de la réponse immunitaire adaptative (Falasca et al., 2015).

PHYSIOPATHOLOGIE

Le virus Ebola étant extrêmement virulent, il est nécessaire de le manipuler dans des structures adaptées avec des mesures de biosécurité maximale (niveau de confinement 3 voire 4). La figure 8 nous présente les mécanismes physiopathologiques et immunologiques de l’infection par le virus EBOLA.

Entrée virale

Le virus pénètre l’organisme soit à travers une muqueuse, une brèche sur la peau, ou par insertion parentérale ; et cible premièrement les CPA (cellules dendritiques et les macrophages) privilégiées du fait de l’expression de facteurs d’adhérence comme les récepteurs DC-SIGN ou Tyro3. La réplication précoce du virus Ebola au sein des CPA va inhiber la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, permettant ainsi la diffusion du virus au sein de l’organisme ;ce qui va déclencher par la suite une réaction inflammatoire inappropriée, contribuant à la pathogénicité du virus Ebola (Bray et al., 2005 ; Geisbert et al., 2003).

Diffusion virale

Du fait de l’incapacité du système immunitaire inné à exercer son activité antivirale, par inhibition de l’IFN de type I principalement, le virus va infecter la plupart des cellules immunitaires. Les cellules dendritiques infectées vont survivre plus de 6 jours, permettant la diffusion du virus vers les ganglions lymphatiques régionaux, puis dans la circulation sanguine, pour ensuite atteindre le foie, la rate et d’autres organes. Au fur et à mesure de la diffusion virale, la réplication intense du virus Ebola va entrainer une réponse inflammatoire systémique incontrôlée, délétère pour l’hôte, contribuant à l’issue fatale de la maladie (Villinger et al., 1999), ayant pour conséquences :
– Dysfonctionnement gastro-intestinal
– Anomalies de la coagulation
– Atteinte de l’intégrité vasculaire (Yang et al., 2000)
– Hypotension et défaillance multiviscérale (Bray et al., 2015 ; Geisbert et al., 2003)

Aspects cliniques de la maladie à virus Ebola

Le tableau ci-dessous illustre les différentes phases cliniques de la maladie à virus Ebola. Tableau II : Phases cliniques de la maladie à virus Ebola (Mupapa et al., 1999; Feldmann et al., 2012 ; OMS, 2016)

DIAGNOSTIC

La manipulation du virus Ebola doit être réalisée dans des postes de sécurité microbiologique (PSM) au minimum de niveau 3, voire 4. Le diagnostic biologique de la fièvre hémorragique à virus Ebola fait appel à deux grands types de techniques :
– des techniques directes qui permettent de rechercher l’agent pathogène en cause ou une partie de celui-ci (antigène) et même son génome
– des techniques indirectes qui mettent en évidence la réponse de l’hôte à l’infection (recherche d’anticorps par sérologie).
Les méthodes de diagnostic direct et indirect sont complémentaires (Tableau III). Puisque les symptômes précoces de la maladie à virus Ebola sont relativement aspécifiques, il est important d’éliminer une autre étiologie par l’établissement d’un diagnostic précis, afin de mettre rapidement en place des soins de support et d’isoler le patient pour éviter la création de multiples chaines de transmission (CDC, 2016; Haas, 2014; Martinez et al., 2015).

PERSPECTIVES THERAPEUTIQUES

Actuellement, il n’existe aucun vaccin validé contre le virus Ebola, de nombreux protocoles expérimentaux sont testés par les scientifiques du monde entier pour lutter contre cette fièvre hémorragique mortelle. La démarche thérapeutique repose essentiellement sur la prise en charge symptomatique (CDC, 2014 ; Madariaga, 2015 ; Mercedes et al., 2015). Il y a bien un traitement curatif maintenant. Nous avons deux molécules qui sonttrès efficaces et qui peuvent guérir rapidement.

Mesures de réanimation

La correction vigoureuse et immédiate de la déplétion volémique, ainsi que la balance hydro électrolytique et acido-basique sont de plus haute importance. L’antibiothérapie à large spectre peut être indiquée si une surinfection bactérienne est présumée.

Traitement spécifique

❖ REGN-EB3 et mAb114
La maladie à virus Ebola a désormais un traitement efficace. Il s’agit mAb114 et le REGN-EB3, deux molécules testées et attestées par l’Institut National des Recherches Biomédicales (INRB).
Le taux de mortalité réduit à 29% et 34%
– Les traitements REGN-EB3 et mAb114 «sont les premiers médicaments qui, dans le cadre d’une étude scientifique solide, ont clairement montré une diminution significative de la mortalité de 90% chez les personnes atteintes du virus Ebola»
❖ Remdesivir (GS-5734)
C’est un promédicament qui présente une activité antivirale à large spectre contre plusieurs virus à ARN. Ce composé est actuellement en développement clinique pour le traitement de la maladie à virus Ebola (Ebola). Bien que des effets antiviraux aient été démontrés dans des cultures cellulaires et chez des primates non humains, le mécanisme d’action de l’inhibition du virus Ebola (EBOV) contre le Remdesivir reste à élucider.
❖ ZMapp
Il s’agit d’un médicament expérimental développé par Mapp Biopharmaceutique. C’est une combinaison de trois anticorps monoclonaux générés par les souris infectées par le virus Ebola et par la suite produite à l’aide d’une plante : Nicotiana Benthamiana (plante du tabac). Au cours des études sur les animaux, 43% des souris infectées ont survécu avec ce traitement. Le médicament a été utilisé expérimentalement chez certains patients au cours de l’épidémie qui a sévi en Afrique de l’ouest en 2014, et plusieurs personnes ont survécu (Pettitt et al., 2013 ; Butler, 2014).
❖ Thérapies de convalescence
Il s’agit de la transfusion de sang et de plasma récupéré chez des patients convalescents de la MVE. C’est une stratégie thérapeutique utilisée pour soutenir l’immunisation passive. Elle a été utilisée pour la première fois chez une patiente au cours de l’épidémie de Zaïre en 1976, et il a été constaté une amélioration des symptômes, même si la patiente est décédée par la suite (Mupapa et al., 1999).
❖ Traitements antiviraux
La ribavirine et la lamivudine se sont avérées efficaces pour le traitement de la maladie à virus Ebola. Cependant, la ribavirine n’était pas recommandée en raison des effets indésirables graves qui ont été observés. En outre, il n’y avait aucun bénéfice de survie pour la lamivudine. Autre médicament antiviral expérimental, la Favipiravir, a été développé par Fujifilm, Japon, initialement pour le traitement de l’infection par le virus de la grippe. Ce médicament pourrait empêcher une issue mortelle dans les études sur des animaux. Compte tenu des défis actuels que présente le virus Ebola, d’autres études sur l’homme sont en cours (Feldmann et al., 2012 ; Butler, 2014 ; CDC, 2014).

PREVENTION

La vaccination

La vaccination constitue la meilleure prévention afin de pouvoir se protéger de la MVE .

Principe et différents types de vaccins

La vaccination est une pratique prophylactique qui induit la mise en place d’une immunité protectrice. Son principe repose sur la capacité du système immunitaire spécifique de générer une mémoire immunologique suite à une première rencontre avec l’antigène. Il s’agit ainsi d’inoculer lors de l’acte vaccinal le pathogène sous une forme inoffensive afin de générer la réponse primaire qui aboutira à la production de cellule mémoire. Il existe plusieurs vaccins actuellement disponibles.
– les vaccins conventionnels
– Vaccins vivants atténués où l’on injecte le micro-organisme à qui on fait perdre sa virulence
– Vaccins inactivés où l’on injecte un microorganisme tué
– Les vaccins sous-unités ou purifiés où l’on injecte une partie du pathogène : toxine, polyoside, antigènes recombinants
– les nouveaux vaccins en phase d’essais cliniques, tous exprimant l’antigène d’intérêt vaccinal
– les vaccins vivants recombinants
– les vaccins vivants modifiés
– les vaccins peptidiques ou synthétiques
– les vaccins génétiques (Espinosa, 2010).

Stratégie de rappel hétérologue : prime-boost pour générer une immunité cellulaire protectrice

Certains pathogènes sont mal contrôlés par les approches vaccinales récentes, car résistent à l’immunité humorale qui est typiquement générée par les vaccins classiques. Les rappels de vaccinations assurent une amplification de la réponse anticorps, mais n’amplifie que très peu la réponse cellulaire du fait d’une mauvaise présentation de l’antigène. Pour remédier à ce problème, on réalise non pas un rappel classique avec le même vaccin, mais une seconde injection avec un vecteur différent (rappel hétérologue).
Cette stratégie a été testée à partir de deux vaccinations consécutives avec des vaccins vivants recombinants basés sur des virus vecteurs différents. On a constaté un effet de synergie entre ces deux vaccinations, avec une augmentation des lymphocytes T spécifiques du pathogène à la fois CD4 et CD8, et de forte avidité (Espinosa, 2010).

Candidats Vaccins contre le virus Ebola

Pour l’instant, il n’y a pas de vaccin homologué chez l’homme pour se protéger contre la maladie à virus Ebola. Le 8 août 2014, l’OMS a réuni un Comité d’urgence sur la flambée d’Ebola en Afrique de l’Ouest. Il a conclu que cette flambée constituait une urgence de santé publique de portée internationale (USPPI). Depuis lors, les évaluations des vaccins candidats les plus avancés se sont accélérées. Les deux candidats vaccins en cours d’essai chez l’homme sont :
– ChAd3-ZEBOV, mis au point par GlaxoSmithKline, en collaboration avec le National Institute of Allergy and Infectious Diseases, USA.
– rVSV-ZEBOV, mis au point par New Link Genetics et Merck Vaccines USA, en Collaboration avec l’Agence de santé publique du Canada.
Ces deux vaccins se sont avérés sûrs et efficaces chez l’animal et chez l’homme (Ling et al., 2015 ; OMS, 2015).
Plusieurs essais cliniques sont en cours ; parmi lesquels l’essai clinique randomisé constitué de vaccins hétérologues :
– ChAd3-EBO Z : il s’agit d’un vaccin à vecteur viral utilisant comme vecteur un adénovirus de chimpanzé codant la glycoprotéine Ebola de souche Zaïre ; et
– MVA- EBO Z : un vaccin à vecteur viral utilisant comme vecteur le virus modifié de la vaccine Ankara, codant la glycoprotéine du virus Ebola Zaïre.
Le MVA est un vecteur de vaccin de la famille des orthopoxvirus. Il s’agit d’un candidat attrayant pour des raisons d’innocuité et d’immunogénicité.
– Ce génome viral a été prouvé stable à travers une grande série de passages dans des fibroblastes d’embryon de poulet.
– Le MVA n’a également montré aucun effet cytopathique, ni formation de plaques dans des cellules d’origine humaine.
– Chez les souris irradiées, le MVA n’a suscité aucune morbidité ni létalité, même lorsqu’il était administré par la voie intracérébrale à des doses élevées, ce qui démontre son innocuité, même dans les organismes immunodéprimés.
– Par conséquent, le MVA-EBO Z utilisé dans cette étude est produit dans la nouvelle lignée cellulaire Immortalisée de la rétine de canard AGE1.CR.pIX cultivée dans un milieu sans sérum. L’immortalisation est obtenue par transfection des gènes E1A et E1B issus de l’adénovirus humain de sérotype 5. Les lignées cellulaires sont adaptées à la prolifération en suspension dans un milieu exempt de composants d’origine animale. Les deux, dans des monocouches adhérentes et dans une culture de cellules en suspension, sont hautement permissives au MVA, dépassant les rendements obtenus avec des fibroblastes primaires de poulet (Jordan et al., 2009).
– Les vaccins utilisant le MVA comme vecteur sont particulièrement adaptés pour stimuler des réponses immunitaires à un antigène suite à une vaccination en collaboration avec un autre vecteur viral.
Le vaccin hétérologue ChAd3-MVA prime-boost s’est avéré sûr, bien toléré et immunogène (Sheehy et al., 2011), suscitant des réponses anticorps et de cellules T spécifiques de haut niveau (Sheehy et al., 2012 ; Ewer et al., 2013).

Prévention Communautaire

Pour combattre efficacement la MVE, il faut mettre en œuvre un ensemble d’interventions :
– Journées de sensibilisation pour bien expliquer la MVE aux populations, comment l’éviter et se protéger
– Interdiction de consommer la viande brousse et éviter tout contact avec des chauves-souris dans des zones suspectes.
– Proscription des rites funéraires chez des personnes décédées de suite de la MVE ; Les personnels de santé qualifié doivent s’en occuper
– Prise en charge des cas
– Surveillance et recherche des cas contacts
– Mise en place des services de laboratoire de qualité
– Inhumations sans risque et mobilisation sociale
– Participation de la communauté est essentielle pour juguler les flambées.
– Sensibilisation sur les facteurs de risque de l’infection par le virus Ebola et sur les mesures de protection possibles est un moyen efficace pour réduire la transmission chez l’homme (Wong et al., 2015 ; OMS, 2014).

LUTTE CONTRE L’INFECTION DANS LES ETABLISSEMENTS DE SOINS

– Les agents de santé doivent toujours appliquer les précautions standards lorsqu’ils s’occupent des patients, quel que soit le diagnostic présumé. Ces précautions portent sur les règles de base en matière d’hygiène des mains, l’hygiène respiratoire, le port d’un équipement de protection individuelle et la sécurité des injections et des rites funéraires.
– Les agents de santé qui s’occupent de cas suspects ou confirmés d’infection à virus Ebola doivent, en plus des précautions d’usage, prendre d’autres mesures de lutte anti-infectieuse pour éviter tout contact avec le sang ou les liquides biologiques du patient ou avec des surfaces et des matériaux contaminés comme les vêtements et le linge de lit. Lors des contacts proches avec les malades (c’est-à-dire à moins d’un mètre), ils doivent porter une protection du visage (écran facial, ou masque chirurgical et lunettes de protection), une blouse propre, non stérile à manches longues, et des gants (stériles pour certains actes médicaux).
– Les employés des laboratoires sont également exposés au risque. Les échantillons qui ont été prélevés sur des sujets humains ou des animaux afin de rechercher l’infection au virus Ebola doivent être manipulés par du personnel formé et traités dans des laboratoires équipés (OMS, 2014 ; Wong et al., 2015).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR LA MALADIE A VIRUS EBOLA
I. EPIDEMIOLOGIE DU VIRUS EBOLA
II. STRUCTURE DU VIRUS EBOLA
III. CYCLE DE REPLICATION VIRALE
IV. REPONSE IMMUNITAIRE DANS LA MALADIE A VIRUS EBOLA
IV.1. Immunité innée
IV.1.1. Les Cellules Présentatrices d’Antigène
IV.1.2. IFN de type I et II
IV.1.3. Cellules tueuses naturelles (NK)
IV.2. Immunité Adaptative
IV.2.1. Réponse Cellulaire
IV.2.2. Réponse humoraleMoreover, death and hemorrhage were associated with elevated thrombomodulin and ferritin levels
IV.2.3. Apoptose lymphocytaire
V. PHYSIOPATHOLOGIE
V.1. Entrée virale
V.2. Diffusion virale
V.3. Aspects cliniques de la maladie à virus Ebola
VI. DIAGNOSTIC
VII. PERSPECTIVES THERAPEUTIQUES
VII.1. Mesures de réanimation
VII.2. Traitement spécifique
VIII. PREVENTION
VIII.1. La vaccination
VIII.1.1. Principe et différents types de vaccins
VIII.1.2. Stratégie de rappel hétérologue : prime-boost pour générer une immunité cellulaire protectrice
VIII.1.3. Candidats Vaccins contre le virus Ebola
VIII.2. Prévention Communautaire
VIII.3. Lutte contre l’infection dans les établissements de soins
I. METHODOLOGIE
I.1. Objectifs
I.1.1. Objectif général
I.1.2. Objectifs spécifiques
I.2. Cadre d’étude
I.3. Population d’étude
I.4. Produits expérimentaux
I.5. Critères d’inclusion et d’exclusion
I.5.1. Critères d’inclusion
I.5.2. Critères d’exclusion
I.6. Aspects Ethiques
II. MATERIELS & METHODES
II.1. Recueil des échantillons
II.2. Séparation et Comptage Cellulaire
II.3. Dosage des anticorps par ELISA
II.4. Dosage ELISPOT
II.5. Coloration cellulaires par cytométrie de flux
II.6. Analyses Statistiques
III. RESULTATS
III.1. Caractéristiques de la Population d’Etude
III.2. Réponses Humorales induites par le Vaccin ChAd3- MVA
III.3. Réponses ELISPot induites par le Vaccin ChAd3- MVA
III.4. Expression des Cytokines induites par le Vaccin ChAd3- MVA
IV. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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