STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTANT A LA METICILLINE

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Phase stationnaire : action des protéines toxiniques

Certaines toxines sont responsables d’une pathologie dont les symptômes sont définis et reproductibles après administration de la toxine. D’autres toxines ont un rôle encore incertain dans les infections.
Dans le premier groupe on retrouve les exotoxines comprenant les enterotoxines (SE) et la toxic shock synrome toxin (TSST), mais aussi les exfoliatines (ET) et la toxine Panton Valentin (PVL). Dans le deuxième groupe on retrouve principalement l’arginine catabolic mobile element (ACME) et l’epidermal cell différentiation inhibitor (EDIN).
 Les exotoxines
Les Exotoxines au nombre de 23, appartiennent à la famille des super antigènes thermostables. On peut distinguer :
– Les enterotoxines (SE) n=12 : SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SER, SES, SET, SEP codées respectivement par les gènes sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, ser, ses, set, sep.
– Les enterotoxines-like (SE/) n=10 : SE/J, SE/K, SE/L, SE/M, SE/N, SE/O, SE/Q, SE/U, SE/U2, SE/V codées respectivement par les gènes selj, selk, sell, selm, seln, selo, selq, selu, selu2, selv.
– Une toxine TSST codée par le gène tst.
Selon une étude américaine, la majorité des S.aureus (99%) possède au moins un gène codant pour une enterotoxine. Certaines souches peuvent contenir jusqu’à 12 gènes mais la médiane se situe à 5 gènes [10].
Les enterotoxines partagent des propriétés communes : un pouvoir pyrogène, une action à très faible concentration, et des propriétés émétiques. Le gène le plus prévalent est ser, le plus rare est see. Il n’y a pas de différence significative dans la distribution des gènes entre les SARM et SAMS excepté pour sek et sen. Le gène sek est retrouvé plus fréquemment sur les SARM alors que le gène sen est retrouvé principalement sur les SAMS [10].
Elles sont constituées de deux domaines globulaires qui ont une forte affinité pour la partie constante du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH II) des cellules présentatrices d’antigènes et la partie variable Vβ des récepteurs des lymphocytes. La fixation à ces deux récepteurs induit une activation massive des lymphocytes T polyclonales provoquant une sécrétion importante de cytokines pro inflammatoire à l’origine du choc toxique (Figure 2) [11].
A gauche activation lymphocytaire en présence d’un antigène « classique », à droite, activation lymphocytaire en présence d’un superantigène se fixant conjointement sur le CMH II et sur la partie Vβ du récepteur TCR des lymphocytes T induisant une activation polyclonale Vβ dépendante des lymphocytes T d’après http ://spiral.univ-lyon1.fr.
Le choc toxique est défini par la présence d’au moins 4 des 5 critères suivants [12] :
– Fièvre >38.8°C
– Eruption maculaire diffuse
– Desquamation cutanée secondaire
– Hypotension
– Atteinte multi-systémique (positif si 3/6) digestive, musculaire, hépatique, neurologique, rénale et hématologique.
Il est important de distinguer le choc toxique menstruel dont la mortalité est faible, et seule la toxine TSST-1 (associée à SEA) est responsable, du choc toxique non menstruel. Dans ce dernier la mortalité est plus élevée, et les toxines impliquées peuvent être la TSST-1, SEA, SEC ou SEB [13].
La majorité des enterotoxines est associée à l’intoxication alimentaire (2ème cause mondiale) (Tableau II) [14]. La symptomatologie apparaît en moyenne au bout de 3h, elle est marquée par des vomissements incoercibles, des douleurs abdominales, et des diarrhées pendant 18-24h. Le pronostic est bon s’il y a un traitement symptomatique.

Régulation génétique

L’expression des gènes codants pour les phases exponentielles et les phases toxiniques est étroitement régulée par deux régulateurs transcriptionnels : le gène Staphylococcal accessory regulator (SarA) et le gène accessory gene regulateur (Agr).
 Système SarA
SarA est activé à un stade précoce de la formation des biofilms pour exprimer les gènes codants pour des protéines de surface.
Directement ou indirectement le système SarA influence la transcription d’au moins 120 gènes de S.aureus. Il est capable aussi bien d’exercer un contrôle positif sur certains gènes qu’un contrôle négatif [27].
 Le système agr
Ce système est lié au système quorum-sensing permettant la communication cellule à cellule. Il est induit par l’intermédiaire d’un peptide nommé AIP pour auto-inducing peptide. Lorsque la densité bactérienne est faible le peptide est en faible quantité et ne déclenche donc pas d’action. Dès que la densité bactérienne devient suffisante, l’AIP s’accumule et induit une cascade d’activation régulant la transcription des gènes (Figure 6).
A la phase post-exponentielle, la densité bactérienne est telle que le système agr s’active. Il déclenche ainsi la phase toxinique permettant l’expansion de l’invasion [28].
Le système Agr chez S. aureus. Le peptide auto-inductible (AIP) dérive d’un propeptide AgrD (trait bleu). L’enzyme AgrB (en jaune) modifie l’AIP et permet son transport dans le milieu extra cellulaire. Une fois dans le milieu extra cellulaire, l’AIP active le système Agr en se fixant sur AgrC (en rouge) et forme avec AgrA (en rouge) un système de transduction du signal à deux composantes. Ce système induit la transcription de deux opérons ARNII et ARNIII par fixation aux promoteurs P2 et P3. ARN-II induit un rétrocontrôle positif sur le système Agr et ARN-III permet l’activation de nombreux gènes cibles, d’après Kong et al 2006 [29].
Le système Agr est présent chez toutes les souches de S.aureus cependant les variations dans la région B-D-C ont permis d’identifier quatre groupes agr (agr-I, agr-II, agr-III et agr-IV). L’appartenance d’une population à un groupe agr est corrélée avec le génotype de la souche. Cependant deux clones appartenant au même groupe agr peuvent être éloignés génétiquement sauf le groupe agr-IV qui semble homogène [30].

RESISTANCES

A l’introduction de chaque nouvel antibiotique, le S.aureus a su développer des résistances soit par modification de la cible, soit par inactivation enzymatique, ou bien par un système d’efflux (Figure 7).

Bêta-lactamine

 Pénicillinase
La résistance par production de la pénicillinase est induite par l’acquisition du gène blaZ (transposon sur plasmide), dont l’activité est régulée par blaI et blaR. Elle confère une résistance aux pénicillines G, A, carboxypenicillines et aux Ureidopenicillines mais reste sensible aux inhibiteurs de beta lactamase [31].
 Gène mec
Un an après l’introduction de la méticilline, les premiers cas de SARM sont décrits [32]. Elle est induite par une protéine liant la pénicilline additionnelle (PLP2a). Cette protéine a une faible affinité vis à vis des bêta-lactamines. Le gène mecA code cette protéine, il est inclus dans une cassette staphylococcique (SCCmec, staphylococcal cassette chromosome mec).
La SCCmec est composée de plusieurs éléments (Figure 8) :
– Complexe mec: mec A, mecR, mec I
– Complexe de gènes des recombinases: ccrA, ccrB et/ou ccrC
– Jonctions : séquences d’insertion, des transposons ou des copies de plasmide portant des gènes de résistances associées.
Le complexe mec confère la résistance aux beta lactamines. Les recombinases sont responsables de la mobilité de la cassette, elles sont encadrées par une séquence à cadre de lecture ouverte (OrfX) dont les fonctions ne sont pas connues.
OrfX, gène où s’intègre mecA ; SRI séquences inversées répétées ; IS431, séquence d’insertion 431, adapté de CLSI 2010.
Jusqu’à présent 11 différents types SCCmec (I à XI) ont été décrits selon leur complexe mec et leurs gènes ccr, d’après la nomenclature du groupe international working group on the Staphylococcal Cassette Chromosome éléments (IWG-SCC).

Résistance aux glycopeptides

La résistance aux glycopeptides peut être classée en trois catégories :
– Staphylococcus aureus de sensibilité diminuée pour les glycopeptides (GISA)/ Staphylococcus aureus de sensibilité diminuée pour la vancomycine (VISA) : sensibilité diminuée, la majorité de la population est de sensibilité diminuée. Ces souches ont un épaississement de leur paroi. Le support génétique est inconnu et la résistance est non transférable [34].
– Hétéro-VISA : l’expression de cette résistance est hétérogène
– Staphylococcus résistant à la vancomycine (VRSA) : l’acquisition du gène vanA confère une résistance de haut niveau, ces cas sont exceptionnels.

Aminosides

Les aminosides inhibent la synthèse protéique par fixation sur l’ARN. Les gènes aacA-aphD, aadD et adphA3 (transposons) codent pour des transférases. Elles modifient la structure chimique des aminosides diminuant l’action des antibiotiques.
On différencie 3 phénotypes :
– Kanamycine et Amikacine résistants (adphA3).
– Kanamycine, Amikacine et Tobramycine résistants (aadD).
– Résistance à tous les aminosides sauf streptomycine (aacA-aphD).

Macrolides

Les macrolides et apparentés inhibent la synthèse protéique en favorisant la dissociation entre ribosome et ARN de transfert. La méthylation ribosomale confère une diminution d’affinité de la cible. La production de cette méthylase est sous le contrôle des gènes erythromycin ribosome methylation (erm). Les gènes ermA et ermC essentiellement plasmidiques sont retrouvés chez les staphylocoques. Le phénotype attendu peut être soit constitutif soit inductible.
Il existe deux autres mécanismes de résistance : l’inactivation enzymatique par l’intermédiaire d’une acétylase et le système d’efflux par l’intermédiaire d’une pompe (Tableau IV).

STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTANT A LA METICILLINE

Les SARM sont endémiques dans les hôpitaux du monde entier et sont associés à une morbidité et mortalité importante.
Les infections à SARM associées aux soins apparaissent chez des personnes présentant des facteurs de risque (exemple : chirurgie, dispositif médical).
En revanche, de nombreuses infections à SARM-CO surviennent chez des personnes en bonne santé sans de tels facteurs de risque. Ces différences suggèrent que les souches de SARM-CO sont plus virulentes et transmissibles que les souches SARM-N [36]. Les échanges inter continentaux semblent beaucoup plus rapides pour les SARM-CO. Les SARM-N diffusent uniquement d’un service à l’autre contrairement aux SARM-CO dont la diffusion est plus rapide via les moyens de transports, et les flux migratoires.

SARM Nosocomial

Le premier cas de SARM a été isolé en 1961 aux Royaume unis, il arborait la cassette SCCmecI, Il était nommé le clone archaïque. Puis rapidement dans les années 1970, l’expansion des SARM est mondiale. Les SARM sont vite devenus une des premières causes d’infections nosocomiales dans les hôpitaux du monde entier (Figure 9).
Sur une étude de 359 SARM obtenues entre 1961 et 1999 dans 20 pays, il a été retrouvé 5 complexes clonaux (tableau V) dont les deux majeurs sont CC5 et CC8[38]. Plusieurs types de SCCmec sont retrouvés, soutenant l’hypothèse d’une évolution multi-lignées par acquisition de différents types de SCCmec au cours du temps. Il a été montré que l’acquisition d’une SCCmec par un SAMS était 4 fois plus importante que le remplacement d’une SCCmec par une autre. L’épidémiologie des SARM-N est en perpétuelle évolution. Ils émergent, diffusent puis disparaissent, remplacés par d’autres clones [39]. Les SCCmec retrouvées de nos jours sont de type IV ou V, car elles sont plus petites facilitant les transferts entre bactérie [40].

SARM Communautaire

Depuis les années 1980, les infections à SARM ne sont plus limitées au milieu hospitalier et sont diagnostiquées dans le domaine communautaire. Ces nouveaux SARM sont définis comme des SARM-CO.
Ils ont deux caractéristiques quasi-constantes. D’une part la présence d’une cassette chromosomique de petite taille (SCCmec type IV ou V) et d’autres part ils hébergent très souvent le gène codant pour la PVL. Par contre le fond génétique et la distribution des autres gènes sont spécifiques à chaque continent. On retrouve principalement 6 clones de SARM-CO : USA300, ST80, ST1, ST59, ST93 et SWP (Figure 10)
Pour l’ensemble de ces clones, la propagation limitée uniquement à certaines régions du monde n’est pas comprise. Ceci en particulier pour les clones USA300 et ST80 dont les prévalences sont les plus importantes. En effet la prévalence du clone USA300 en Europe reste relativement faible par rapport au clone ST80 [41]. Le clone ST80 est, par ailleurs limité à l’Europe et l’Afrique du Nord.
Ce clone ST80 est prédominant en France, il est habituellement résistant à l’acide fusidique, l’amikacine, la kanamycine et la tétracycline [42]. Il est porteur des gènes PVL, etD et SCCmec IV [43]. Il a été montré que ce clone est principalement associé aux infections des tissus cutanés et plus rarement aux bactériémies ou méningites [41].
Le clone ST59 est fréquemment retrouvé à Taiwan mais aussi, plus rarement, en Australie, Pays-Bas, Danemark, en Angleterre et aux USA. Lors d’un dépistage nasal chez 3000 employés adultes d’une usine Tawanaise, il a été retrouvé 119 souches de SARM.
Sur les 119 souches isolées, 100 souches appartenaient aux clones ST59, dont 65% étaient PVL+(4 Le clone ST93 est retrouvé en Angleterre et en Australie, mais il est rarement détecté dans les autres pays.
Le clone ST30 ou clone du Pacifique Sud-Ouest (SWP) reste principalement détecté en Australie bien qu’il ait eu une expansion mondiale.
Enfin le clone ST1 connu aussi sous les noms de USA400 et MW2 est désormais plus rare. Il a été supplanté par le clone USA300[44].

OUTILS EPIDEMIOLOGIQUES

La forte prévalence tant en communautaire qu’en nosocomiale des infections à Staphylococcus impose des investigations épidémiologiques. Depuis plusieurs décennies, de nombreux outils épidémiologiques ont été développés. Plusieurs critères sont pris en compte dans leurs utilisations : la reproductibilité, le pouvoir discriminant, le coût, la facilité d’interprétation, et le temps d’exécution. Depuis l’apparition du typage moléculaire, le typage phénotypique est historique car il présente de nombreux inconvénients.
Les techniques utilisées sont dépendantes du type d’étude. En cas d’étude d’épidémiologie locale, les techniques utilisées doivent avoir un fort pouvoir discriminant (permettant de détecter des variations génétiques mineures). Alors que pour les études d’épidémiologie globale, les techniques doivent être capables de s’affranchir de variations génétiques mineures et ne détecter que les variations qui se sont accumulées lentement pendant l’évolution.

Electrophorèse en champ pulsé (ECP)

Cette technique mise au point par Schwartz et Cantor en 1984 est considérée comme un gold standard pour le génotype des SARM [46]. Son principe repose sur la fragmentation de l’Acide DésoxyriboNucléique (ADN) par des endonucléases à site de coupure rare (SmaI). Les fragments d’ADN obtenus sont séparés par électrophorèse soumise à des champs électriques alternés. Ce champ électrique empêche la formation d’enroulements secondaires gênant la migration et permet l’obtention d’un profil de macrorestriction nommé pulsotype. L’analyse des différents profils peut être réalisée par comparaison des profils à l’aide du logiciel GelCompar® ou par la construction d’un dendrogramme. Bien qu’ayant un pouvoir très discriminant, la grande variabilité inter laboratoire limite son utilisation dans l’investigation de la dissémination d’un clone de SARM [47]. Afin de réduire cette variabilité, le groupement européen HARMONY a mis au point un protocole standardisé [48].

MultiLocus Sequence Typing (MLST)

Elle consiste en l’amplification par Polymérase Chain Reaction (PCR) puis le séquençage de 7 gènes de ménage impliqués dans le métabolisme cellulaire de l’espère S.aureus (Figure11)[49]. arC : Carbamate kinase, aroE : shikimate déshydrogénase, glpF :glycérol kinase, gmk : guanylate kinase, pta : phosphatase acétyltransférase, tpi : triosephosphate isomérase, yqiL : acétyl coenzyme A acétyltransférase d’après Gomes et al [50].
Chaque séquence différente représente un allèle auquel un numéro arbitraire est attribué par la base de données MLST (http://www.mlst.net) quelle que soit l’origine de la différence (mutation ponctuelle ou large recombinaison). La combinaison des sept numéros constitue le profil allélique, dit séquence type (ST) qui est désigné aussi par un numéro arbitraire. Tous les ST ayant 5 des 7 gènes en commun sont regroupés dans un même complexe clonal (CC).

Direct repeat units typing (Dru typing)

Le Dru-typing a pour but d’amplifier une série de séquences répétées de 40 paires de composition variable située à côté de la séquence d’insertion IS431 présente au sein de la cassette SCCmec. Le produit d’amplification est ensuite séquencé. La nature (enchaînement de bases) et le nombre des séquences répétées permettent de définir une combinaison particulière dénommée dru-type et signalée par le préfixe dt. Un chiffre différent est attribué pour chaque combinaison.
Le pouvoir discriminatoire est comparable au spa typing et MLST [60]. Mais il n’est utilisable que pour les souches de SARM.

Cartographie optique (Whole genome mapping)

Technique de nouvelle génération, elle consiste à établir une cartographie de la localisation de sites de restrictions sur le génome complet. Les brins d’ADN extraits sont fixés sur une lame spécifique. Une enzyme de restriction (XbaI) permet la formation de fragments d’ADN. Ces fragments sont révélés par un microscope à fluorescence couplé à un logiciel d’analyse. La compilation de plusieurs profils permet d’établir une carte complète de restriction d’un génome ou carte optique d’un génome (Whole genome map).
Cette technique est plus discriminante que l’ECP. Elle est capable entre autres de déterminer la longueur du génome, d’identifier des nouveaux gènes, de réaliser le typage de SCCmec, de comparer des souches et de caractériser les clones épidémiques [61]. Elle a aussi l’avantage d’être reproductible et standardisée. Mais elle ne permet pas d’analyser les brins d’ADN de taille inférieure à 150kb (exemple : plasmide) [62]. Son coût est élevé et son interprétation est difficile.

Séquençage du génome (WGS)

Le séquençage et l’analyse du génome entier permettent une étude épidémiologique approfondie.
La technique découle de la méthode de Sanger. Elle est divisée en 4 étapes majeures. Tout d’abord la constitution d’une librairie de séquençage puis la génération des clusters ensuite le séquençage et enfin l’analyse des données par bioinformatique.
Le WGS possède un pouvoir discriminant élevé, supérieur à l’ECP.
C’est une technique supérieure aux biopuces à ADN car elle est capable de détecter des variants alléliques indispensables pour prédire le phénotype de virulence et de résistance des souches [63].
Son utilisation permet aussi de comprendre la dissémination et la persistance des souches de S.aureus [64] et d’analyser les épidémies locales mais aussi régionales [65] Mais le séquençage reste relativement onéreux, l’interprétation et l’analyse sont extrêmement complexes et requièrent une formation spécialisée. La sensibilité n’est pas suffisante pour séquencer les brins d’ADN trop courts tels que les plasmides.

EPIDEMIOLOGIE DU STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN AFRIQUE.

La distribution des clones de S.aureus en Afrique est relativement mal connue. D’une part il y a un très faible nombre d’études dont la comparaison est difficile (différentes populations étudiées, techniques de génotypages diverses, nombre restreint de souches) et d’autre part de nombreux pays Afrique n’ont fait l’objet d’aucune étude.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.GENERALITES
II. INFECTION A STAPHYLOCOCCUS AUREUS
II.1. Phase exponentielle : action des protéines de surfaces
II.2. Phase stationnaire : action des protéines toxiniques
II.3. Régulation génétique
III.RESISTANCES
III.1. Bêta-lactamine
III.2. Résistance aux glycopeptides
III.3. Aminosides
III.4. Macrolides
III.5. Fluoroquinolones
III.6. Autres molécules
IV.STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTANT A LA METICILLINE
IV.1. SARM Nosocomial
IV.2. SARM Communautaire
V.OUTILS EPIDEMIOLOGIQUES
V.1. Electrophorèse en champ pulsé
V.2. MultiLocus Sequence Typing
V.3. Spa Typing
V.4. Biopuce à ADN
V.5. Direct repeat units typing
V.6. Cartographie optique
V.7. Séquençage du génome
VI.EPIDEMIOLOGIE DU STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN AFRIQUE
VI.2. SARM
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I.CADRE ET PERIODE DE L’ETUDE
I.1. Cadre de l’étude
I.2.Période de l’étude
II.MATERIEL-METHODES DE L’ETUDE
II.1. Matériel de l’étude
II.2. Méthodes de l’étude
II.2.1. Type étude-Critères
II.2.2. Identification des isolats de S. aureus
II.2.3 Tests de sensibilité aux antibiotiques
II.2.4. Génotypage
III.RESULTATS DE L’ETUDE
III.1. Résultats globaux
III.2. Données concernant les souches
III.3. Données concernant les souches génotypées
III.3.1. Gènes de résistance
III.3. 2.Gènes de virulence
III.3.3. Gènes de régulation et MSCRAMMs
III.3. 4.Caractérisation des principaux clones
IV. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES
ANNEXE

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