Soutenance mémoire
Caractères bactériologiques
Les staphylocoques se présentent sous forme de coques en petits amas, en diplocoques ou en très courtes chainettes de trois à cinq éléments positivement colorés au Gram (Fauchère et Avril, 2002), le mode de regroupement dit en grappe de raisin ou en amas est plus caractéristique après culture sur un milieu gélosé . La disposition en amas s’explique par la division cellulaire des staphylocoques en trois plans successifs et perpendiculaires les uns aux autres et par le fait que les cellules filles ne se séparent pas complètement de la cellule mère dont elles sont issues. Le S. aureus est une bactérie aéro-anaérobie facultative, et se cultive bien sur les milieux ordinaires (Gélose nutritive, bouillon nutritif…), se cultive également sur gélose au sang et le milieu sélectif chapman. C’est une bactérie mésophile (37 °C de croissance optimale), neutrophile (pH 7 optimal) et halophile (se développe à de fortes concentrations de NaCl). Elle est aussi relativement résistante aux inhibiteurs bactériens comme le cristal violet et le tellurite de potassium (Trouillet, 2011). En bouillon ordinaire, la culture est rapide et les staphylocoques se multiplient en quelques heures, formant un trouble homogène ou un dépôt. Sur gélose nutritive on observe des colonies opaques, régulièrement rondes, lisses, plus ou moins bombées avec un diamètre variant de 1,5 à 2 mm. La plus part des souches produisent alors un pigment doré non diffusable en 24 heures à 37°C, pigment qui sera plus prononcé après 24 à 48 heures de plus à la température ambiante. Sur le milieu Chapman S.aureus donne des colonies jaunes dorée avec un virage du milieu vers le jaune orangé, ce qui signifie une fermentation du mannitol par la bactérie, alors que les autres staphylocoques donnent des colonies blanchâtres d’où le nom de staphylocoque blanc. En milieu gélose au sang, on observe fréquemment une zone claire d’hémolyse (betahémolyse) autour des colonies. Ceci est lié au fait que certains staphylocoques en particulier S.aureus, sont susceptibles de synthétiser quatre hémolysines distinctes et variables d’une souche à l’autre, et dont l’activité diffère selon le type d’hématie en cause (Tchougoune, 2007). L’étude des différents caractères biochimiques et métaboliques des souches de staphylocoques a permis le développement de galeries d’identification rapides et efficaces permettant de définir les différents profils biochimiques des souches appartenant à une même espèce (Aouati, 2009). Toutes les souches produisent une catalase mais pas d’oxydase. Ainsi, les souches de S. aureus sont: indole -, acétone +, uréase +, réduisant le téllurite de potassium et les nitrates en nitrites, et produisant de l’ammoniaque à partir de l’arginine (Le Minor and Veron ,1990). De plus, la plupart des souches de S. aureus contrairement aux autres espèces produisent de l’hémolyse bêta, caractéristique utile lorsqu’on cherche à identifier un staphylocoque. S. aureus possède également un équipement enzymatique lui permettant de métaboliser de nombreux et divers substrats glucidiques, protéiques et lipidiques (Couture, 1990). Le métabolisme glucidique est particulièrement intéressant. La plupart des sucres sont fermentés; (glucose, saccharose, lévulose, lactose et mannitol), le glucose est utilisé en anaérobiose et aérobiose ainsi que le mannitol. L’utilisation du mannitol est une indication importante parce que ce polyalcool est fermenté par S. aureus et S. epidermidis. Cependant, la production de pigments (caractères culturaux), d’hémolyse et la dégradation d u mannitol n’ont pas toujours lieu; ce sont des indices auxquels on ne peut se fier pour identifier le germe de façon certaine. Il faut donc procéder à son identification par l’étude de différentes propriétés biologiques et biochimiques (Couture, 1990). Ce qui caractérise mieux l’espèce S. aureus, c’est la production d’une staphylocoagulase (Fauchere et Avril, 2002). Cependant, certaines souches de S.aureus peuvent ne pas produire de coagulase libre en raison d’une mutation. Ainsi, une DNase thermostable permet de déterminer si le germe isolé est un S. aureus (Couture, 1990).
Béta-hémolysine ou béta-toxine
Elle est thermolabile de PM de 26 à 38 kDa et de pI 9.4, synthétisée par 94% de souches animales et par 54% de souches humaines. Elle agit sur un grand nombre de cellules incluant les globules rouges, les globules blancs et les fibroblastes. Son activité hémolytique est remarquable par les conditions d’apparition, car elle est de type « chaud-froid »: les érythrocytes soumis à son action à 37°C ne sont pas lysés sauf si on les refroidit à 4°C. Le rôle pathogène de cette toxine n’est pas précis, car elle est instable à l’état purifié et ses effets cytopathiques sont mal connus (Gras, 2006).
Support génétique de la virulence
Le génome de S. aureus se caractérise par sa complexité et sa plasticité. La comparaison des génomes séquencés et l’analyse par la technique des micropuces à ADN d’un échantillon représentatif des différentes lignées de S. aureus montrent qu’environ 75% du génome est hautement conservé (Holden et al, 2004; Lindsay and Holden, 2004). La majorité des gènes de ces régions conservées sont impliqués dans la réplication de l’ADN, la synthèse protéique, les fonctions métaboliques. Un quart du génome est caractérisé par une variabilité génétique importante et les gènes de ces régions sont dévolus à des fonctions non essentielles à la croissance et à la survie. Ces régions variables sont composées d’éléments génétiques mobiles acquis par transferts horizontaux à partir d’autres souches de S. aureus et d’autres espèces bactériennes plus ou moins éloignées (Fitzgerald et al, 2001). Ces éléments génétiques mobiles comprennent des génomes prophages, des transposons, des séquences d’insertion, des plasmides, des cassettes chromosomiques, des îlots de pathogénécité et des îlots génomiques (Lindsay and Holden, 2004). La plupart de ces éléments génétiques mobiles transportent des gènes de virulence ou des gènes de résistances aux antibiotiques (Iandolo, 2002). Il existe un très grand nombre de gènes liés à la virulence : au moins 40 gènes codant pour des toxines, 20 codant pour des facteurs d’adhésion et 44 régulant la transcription de produits associés à la virulence. Les gènes codant pour les toxines sont regroupés dans des îlots de pathogénicité qui sont des éléments génétiques mobiles (Kuroda et al, 2001). Près de 75% des souches cliniques de S. aureus ont des gènes codant pour des toxines (Becker et al, 2003).
Mécanisme de résistance
Le principal mécanisme de résistance aux aminosides (kanamycine, amikacine, tobramycine, gentamicine) est lié à des modifications de la cible ribosomale par des enzymes codées par des gènes plasmidiques ou transposables. Il existe trois enzymes de résistance, chacune d’entre elles conférant un phénotype de résistance spécifique aux aminosides
Une résistance de haut niveau à la kanamycine et l’amikacine (phénotype K); la résistance à la kanamycine traduit la présence d’une enzyme inactivatrice aminoglycoside phosphotransférase (3’)-III.
Une résistance de haut niveau à la kanamycine, à l’amikacine et à la tobramycine (phénotype KT); la résistance à la kanamycine et à la tobramycine due à la production d’un aminoglycoside nucléotidyltransférase (4’) (4’’).
Une résistance de haut niveau à la kanamycine, à l’amikacine, à la tobramycine et à la gentamicine (phénotype KTG) due à la synthèse d’une enzyme bifonctionnelle, aminoglycoside acétyltransférase (6’)-phosphotransférase (2’’). ( Quincampoix et Mainardi, 2001 ; Leclercq , 2002).
Multilocus sequence typing (MLST)
Le MLST est basé sur l’analyse des séquences de gènes conservés (house keeping genes) de S. aureus, soit les gènes arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi et yqiL. Pour chaque gène, un allèle distinct est assigné à chaque séquence différente. Les allèles des sept gènes définissent la lignée de la souche et résulte en un profil allélique désigné séquence type (sequence type, ST). L’évolution de cette méthode a mené à l’apparition des complexes clonaux (CC) et repose sur le même principe avec un nombre de variants de locus simple plus élevé (Malachowa et al, 2005).
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Table des matières
Introduction
Partie 1: Revue de la littérature
I – Etude de l’espèce Staphylococcus aureus
1- Historique de la taxonomie
2- Habitat
3- Caractères bactériologiques
4- Facteurs de virulences
4-1- Protéines de surface (colonisation)
4-2- Facteurs protégeant la bactérie de la phagocytose
4-3- Facteurs conduisant à l’extension de l’infection
4-3-1- Toxines staphylococciques
4-3-2- Super antigènes
4-3-3- Les enzymes
5- Support génétique de la virulence
6- Régulation des facteurs de virulence
II- Résistance de S.aureus aux antibiotiques
1- Résistance de S.aureus aux bêta- lactamines
1-1- Mécanisme de résistance
2- Résistance à la méthicilline
2-1- Mécanisme de résistance
2-2- Facteurs influençant l’expression de la méthicillino-résistance
3- Résistance de S.aureus aux glycopeptides
3-1- Mécanisme d’action
3-2- Résistance à la vancomycine
3-3- S.aureus de sensibilité intermédiaire à la vancomycine (VISA)
3-4- La résistance hétérogène des souches VISA
4- Résistance de S.aureus aux aminosides
4-1- Mécanisme de résistance
5- Résistance de S.aureus aux macrolides
5-1- Mécanisme de résistance
III- Epidémiologie
IV- Méthodes de typage
1- Multilocus sequence typing
2- Profil de macro restriction génomique par électrophorèse en champs pulsé
3- Typage du gène spa
4- Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis
Partie 2: Partie expérimentale
Matériels et Méthodes
1- Objectif de l’étude
2- Isolement des souches bactériennes
3- Purification des souches
4- Conservation des souches
5- Identification des souches
5-1- Recherche de la catalase
5-2- Recherche de la coagulase
5-3- Recherche de la DNase (Désoxyribonucléase)
5-3-1- Technique à l’acide chlorhydrique
5-3-2- Technique au bleu de toluidine
6- Le test Pastorex Staph Plus
7- Détermination du profil biochimique
8- Détection phénotypique de la méthicillino-résistance
8-1- Méthode de diffusion du disque d’Oxacilline 1ug
8-2- Méthode de diffusion du disque d’Oxacilline (5ug) à 30°C
8-3- Méthode de diffusion du disque de Céfoxitine
8-4- Test de screening à l’Oxacilline
8-5- Détection de la résistance à l’oxacilline par la mise en évidence de la PLP2a (BioMerieux)
9- Test de sensibilité aux antibiotiques
10- Détermination des CMI par test de sensibilité en microdilution (système d’inoculation Prompt TM* D)
11- Recherche des phénotypes de résistance MLSB
12- Recherche de la résistance de S. aureus à la vancomycine (Test de Screening)
13- Détermination de la CMI vis-à-vis de vancomycine par E-test
14- Détection de la sensibilité diminuée au glycopeptides (GISA)
15- Analyse de population
16- Détection des gènes de virulence par PCR
16-1- Identification par PCR
A- L’extraction de l’ADN
B- Sélection de la méthode PCR pour l’identification des gènes de virulences
– PCR Duplexe gyrA- mecA
– PCR Duplexe Luk-PV- tst1
C- Détection des produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose
– Préparation du gel à 1,5%
– Solution de dépôt sur gel d’agarose à 1,5 %
Résultats
1- Les isolats bactériens
1-1- Aspect macroscopiques et microscopique des isolats bactériens
2- Identification biochimique
2-1- Les tests catalase, coagulase et DNase
2-2- Test d’agglutination Pastorex Staph plus
3- Biotypage des souches de S.aureus selon les profils numériques en API Staph
4- Prévalence des souches SARM
4-1- répartition des SARM selon l’origine de prélèvements
4-2- répartition des SARM selon l’âge
4-3- répartition des SARM selon le sexe
5- Détection de la méthicillino-résistance
6- Détection de résistance hétérogène à la l’oxacilline
7- Recherches de la PLP2a dans les SARM hétérogènes
8- Tests de sensibilité aux antibiotiques
8-1- Les bêtalactamines
8-2- Les aminosides
8-3- Les macrolides
8-4- Autre antibiotiques
9- Détection du phénotype MLSB chez les souches SARM résistance à l’érythromycine
10- Détection de sensibilité diminuée aux glycopeptides
11- Profils de résistance des souches GISA
12- Analyse des sous population des souches GISA
13- Recherche moléculaire de la résistance et gènes de virulence
13-1- Amplification des gènes mecA et gyrA
13-2- Amplification des gènes codant pour la PVL et TSST
Discussion
1- Identification des souches
2- Prévalence des SARM
2-1- Prévalence des SARM selon l’origine du prélèvement
2-2- Prévalence des SARM selon le sexe
2-3- Prévalence des SARM selon l’âge
3- Résistance aux antibiotiques
3-1- Bêtalactamines
3-2- Aminosides
3-3- Macrolides, synergitine et lincosamides
3-4- Glycopeptides
3-4-1- Sensibilité intermédiaire aux glycopeptides
3-5- Fluoroquinolones
3-6- Autres antibiotiques
3-6-1- Chloramphénicol
3-6-2- Cyclines
3-6-3- Rifampicine
3-6-4- Fosfomycine
3-6-5- Trémithoprime
3-6-6- Acide fusidique
4- Bases moléculaires de résistance et gènes de virulence
3-1- Confirmation de l’espèce S.aureus par détection du gène gyrA
3-2- Recherche du gène mecA par PCR
3-3- Recherche de la production de la PVL
3-4- Recherche de la production TSST 1
Conclusion
Références bibliographiques
Résumé
Annexe
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