Spectroscopie femtoseconde infrarouge et modélisation du signal

La mitochondrie, siège du métabolisme cellulaire

   Tout organisme vivant fonctionne selon un métabolisme, c’est-à-dire un ensemble de réactions chimiques, par lequel il extrait de l’énergie de son environnement pour synthétiser ses propres constituants. Chez les organismes eucaryotes, l’énergie est extraite par des mécanismes  oxydatifs à partir de composés carbonés tels les sucres, les lipides et les protides. Ces macromolécules sont tout d’abord dégradées en éléments plus simples, les mono- et disaccharides dans le cas des sucres, les acides gras et le glycérol dans le cas des lipides et les acides aminés dans le cas des protides. Ces éléments simples sont ensuite dégradés par la glycolyse et le cycle de Krebs, ce qui entraîne la formation de dinucléotides réduits, le nicotinamide adénosine  dinucléotide (NADH) et le flavine adénosine dinucléotide (FADH2). Ces dinucléotides réduits délivrent des électrons dont le transfert à travers la chaîne respiratoire jusqu’à l’oxygène moléculaire est couplé à un pompage transmembranaire de protons. Le gradient de protons ainsi produit est utilisé pour la synthèse de molécules d’adénosine triphosphate (ATP). Ce sont ces molécules d’ATP hautement énergétiques qui, lors de l’hydrolyse de l’une de leurs liaisons phosphoanhydrides, fournissent l’énergie nécessaire aux réactions chimiques dans les cellules . La phosphorylation oxydative constitue l’ensemble des processus orchestrés par la chaîne respiratoire, qui induit la synthèse de l’ATP à partir de l’oxygène moléculaire et des électrons issus des dinucléotides réduits NADH et FADH2. Cette étape primordiale dans la production d’énergie de la cellule s’effectue au sein d’organelles appelées mitochondries, plus précisément au niveau de la membrane interne mitochondriale. Nous présentons donc plus en détail la mitochondrie et la phosphorylation oxydative.

Structure

   Parmi les oxydases terminales à hème-Cuivre, une des mieux caractérisées est la cytochrome c oxydase aa3 de Paracoccus denitrificans. Cette enzyme bactérienne comportant quatre sous unités a été tout d’abord isolée sous forme d’un sous-complexe fonctionnel de deux sous unités en 1980 [6], puis dans son ensemble de quatre sous unités en 1988 [7]. L’enzyme a ensuite été cristallisée et sa structure 3D à l’état oxydé est déterminée par diffraction aux rayons X dès 1995 à une résolution de 2,8 Å [8]. Le site actif est décrit avec plus de précision en 1997, à l’aide de nouvelles déterminations de structure avec une résolution de 2,4 Å [9]. La structure 3D de la cytochrome c oxydase aa3 mitochondriale, purifiée à partir du cœur de bœuf, est obtenue peu après, tout d’abord à une résolution de 2,8 Å [10] [11], puis à une résolution de 2,3 Å dans différents états d’oxydoréduction et de ligandation [12]. Par la suite, d’autres oxydases à hème-Cuivre ont révélé leurs structures, à savoir la cytochrome c oxydase ba3 de Thermus thermophilus en 2000 [13], et la cytochrome c oxydase aa3 de Rhodobacter sphaeroides en 2002 [14]. Nous nous intéressons ici uniquement à l’enzyme mitochondriale, que nous étudions en spectroscopie infrarouge, et à l’enzyme de P. denitrificans, que nous utilisons dans les modélisations de dynamique moléculaire. En effet, cette protéine bactérienne, très bien caractérisée, est un modèle simplifié pour l’étude du fonctionnement catalytique de la protéine mitochondriale, comme nous l’expliquons par la suite. La protéine bactérienne de P. denitrificans présente quatre sous-unités. La fonction catalytique enzymatique est assurée par les sous-unités I et II qui forment à elles seules un complexe fonctionnel. L’absence des sous-unités III et IV n’altère pas cette fonction catalytique, la sousunité III, qui lie les lipides, semble plutôt impliquée dans l’assemblage de l’enzyme. Quant à la sous-unité IV, simple hélice en contact avec les sous-unités I et III, son rôle reste indéterminé. La protéine du cœur de bœuf, beaucoup plus imposante que la protéine bactérienne, est un dimère de plus de 400 kDa dont chaque monomère présente treize sous-unités. Ces sous-unités ne sont pas synthétisées à partir du même matériel génétique, les trois premières sous-unités I, II et III sont codées par le génome mitochondrial, alors que les dix autres, IV à XIII, sont codées par le noyau de la cellule.

Transfert d’électrons

   Le transfert d’électrons à travers les différents sites d’oxydo-réduction, du cytochrome c au site catalytique bimétallique, a été abordé par deux types de méthodes complémentaires [18]. La première approche consiste à étudier le déplacement des électrons dans le sens physiologique, du cytochrome c au centre bimétallique. Ce transfert est initié soit par mélange rapide (stopped flow), soit en induisant la production d’électrons par radiolyse de l’eau ou à partir d’un réducteur photoactivable. Le passage des électrons du cytochrome c au CuA et du CuA à l’hème a est alors observé. La seconde approche consiste à suivre le transfert des électrons dans le sens inverse, du site bimétallique au CuA, afin d’étudier le passage des électrons de l’hème a3 à l’hème a. Ce transfert est initié par photodissociation du CO associé à la protéine de valence mixte. L’état à valence mixte correspond à un état d’oxydo-réduction particulier où seul le site bimétallique de fixation du ligand est réduit, la photodissociation du CO engendre ainsi un flux d’électrons de l’hème a3 réduit à l’hème a oxydé [19].

Transfert de ligands

   Le site bimétallique de la cytochrome c oxydase, qui catalyse la réduction de l’oxygène moléculaire en eau, a la capacité de fixer différents ligands compétitifs du ligand physiologique O2 au niveau de son hème a3 : le monoxyde de carbone CO, le monoxyde d’azote NO, ainsi que le cyanure CN. Le transfert de ligands jusqu’au site actif est une étape essentielle à l’initiation de la réduction de l’oxygène, l’étude du rôle structural du site actif dans ces mécanismes de transfert contribue donc à comprendre comment la protéine assure sa fonction catalytique. Dans ce contexte, le ligand le plus étudié est le monoxyde de carbone car son transfert est plus facile à observer que celui du ligand physiologique O2. Tout d’abord, le ligand CO forme un complexe stable avec l’enzyme, contrairement au ligand physiologique O2 qui est réduit dès son arrivée sur le Fer de l’hème. L’existence du complexe stable de la protéine ligandée avec le CO permet d’induire la dissociation du CO par photolyse, et de suivre ensuite son transfert au sein du site actif, sa sortie de la protéine et sa recombinaison sur l’hème. Ce processus de photodissociation du CO a permis par ailleurs d’induire dans certaines conditions d’autres phénomènes. Le transfert des électrons et la réduction de l’oxygène ont ainsi pu être étudiés. Le ligand CO est également bien choisi pour suivre la réaction de transfert de ligands par spectroscopie infrarouge. Sa force d’oscillateur est assez importante pour que son absorption dans l’infrarouge soit détectable, et sa fréquence de vibration est sensible à son état de ligation, ce qui permet de détecter les différents sites avec lesquels il interagit au cours de son déplacement dans le site actif. La formation, juste après photodissociation, d’une liaison entre le ligand CO et le Cuivre du site bimétallique a ainsi été mise en évidence par les premières expériences de spectroscopie infrarouge [28]. En plus de sa fonction réductrice, le Cuivre joue donc un rôle dans le transfert du CO, auquel il se lie lors de son entrée dans le site actif et de sa sortie hors du site.

Spectroscopie dans le domaine UV-Visible

   Les expériences de spectroscopie dans les domaines UV-visible ont apporté une grande contribution à l’étude des phénomènes subpicosecondes. Ces méthodes ne détectent pas directement le ligand CO, mais permettent d’accéder aux modifications des transitions électroniques au niveau de l’hème. Elles sont donc adaptées à l’étude des processus de transfert de ligands dont certaines étapes influent sur l’état électronique de l’hème. La photodissociation du CO dans la cytochrome c oxydase induit des modifications du spectre d’absorption UV-visible sur différentes échelles de temps. La dissociation du CO qui survient en moins de 100 femtosecondes [30] est clairement identifiée,  ainsi que sa recombinaison sur le Fer avec une constante de temps de 11 millisecondes, pour une pression de CO d’une atmosphère [31]. Par la suite, un délai qui pourrait correspondre à un transfert du CO du Fer vers le Cuivre en 300 fs [3] a aussi été mesurée. Afin de confirmer le rôle du Cu+ B dans le mécanisme de transfert du CO au sein du site actif de la cytochrome c oxydase, la recombinaison du CO sur l’hème a3 est suivie à différentes pression en CO [32], et les constantes de réaction de recombinaison correspondantes sont calculées.

Transfert du ligand CO dans la cytochrome c oxydase

   L’expérience pompe-sonde est parfaitement adaptée à l’étude de transferts ultra rapides de ligands dans les hémoprotéines. Nous appliquons cette méthode au transfert du ligand CO au sein du site actif de la cytochrome c oxydase, du Fer de l’hème a3 à l’atome de Cuivre B, comme nous le décrivons au chapitre I. Rappelons que ce processus très rapide s’effectue en moins d’une picoseconde [1] [2] et nécessite l’emploi d’une méthode de résolution femtoseconde. Dans le cadre de nos expériences pompe-sonde dans le domaine infrarouge, destinées à suivre le transfert du CO dans les hémoprotéines, une impulsion pompe femtoseconde de longueur d’onde 400 nm dans le domaine visible est utilisée afin d’initier le transfert du CO par rupture de la liaison Fer-Carbone, selon le processus expliqué dans l’encadré intitulé « Propriétés spectrales de l’hème dans le domaine UV-Visible ». Comme nous l’avons vu au chapitre I, les caractéristiques vibrationnelles du CO dépendent de son site de fixation et de son environnement protéique. Ainsi lors de son transfert du Fer vers le Cuivre dans la cytochrome c oxydase, la fréquence de la transition vibrationnelle du CO passe de 1963 à 2062 cm−1, sa largeur spectrale passe de 4 à 8 cm−1 et son absorption diminue d’un facteur 7 [32]. Afin d’accéder directement à ces variations, une impulsion sonde dans le domaine infrarouge est utilisée. Lors des expériences intégrées spectralement, cette impulsion accordable en fréquence est réglée soit à 1963 cm−1 , soit à 2062 cm−1 afin de pouvoir suivre séparément la dynamique de départ du CO du Fer et son arrivée sur le Cuivre. Dans les expériences résolues spectralement, une impulsion centrée vers 2010 cm−1 est assez large pour voir les deux fréquences de vibrations 1963 et 2062 cm−1 et détecter ainsi simultanément le départ du CO du Fer et son arrivée sur le Cuivre.

Table des matières

1 La cytochrome c oxydase 
1.1 La mitochondrie, siège du métabolisme cellulaire
1.1.1 La chaîne respiratoire mitochondriale
1.1.2 La phosphorylation oxydative
1.2 La cytochrome c oxydase, enzyme terminale de la chaîne respiratoire
1.2.1 Structure
1.2.2 Mécanismes fonctionnels
1.3 Etudes dynamiques de la cytochrome c oxydase
1.3.1 Transfert d’électrons
1.3.2 Cycle catalytique et pompage de protons
1.3.3 Transfert de ligands
2 Spectroscopie femtoseconde infrarouge et modélisation du signal 
2.1 L’expérience pompe-sonde 
2.1.1 Principe
2.1.2 Transfert du ligand CO dans la cytochrome c oxydase
2.2 Modèle de Bloch
2.2.1 Résolution de l’équation de Bloch
2.2.2 Polarisation induite
2.3 Modélisation du signal pompe-sonde 
2.3.1 Expression générale du signal pompe-sonde
2.3.2 Application à l’artefact de mesure à délai pompe-sonde nul
2.3.3 Application au signal du CO
2.3.4 Application à l’artefact de polarisation perturbée
3 Mise en œuvre expérimentale 
3.1 La sonde infrarouge et la pompe visible
3.1.1 Dispositifs
3.1.2 Modélisation du faisceau infrarouge
3.2 Caractérisation du faisceau infrarouge
3.2.1 Interférométrie par transformée de Fourier
3.2.2 Spectral Phase Interferometry for Direct Electric Field Reconstruction transposée à l’infrarouge
3.3 Détermination de la résolution temporelle et du délai pompe-sonde zéro 
3.4 Préparation de la cytochrome c oxydase 
3.4.1 Isolement des mitochondries
3.4.2 Purification de la cytochrome c oxydase
3.4.3 Préparation de l’échantillon
3.4.4 Difficultés avec la cytochrome c oxydase
3.5 Optimisation de l’expérience intégrée spectralement 
3.5.1 Optimisation de la stabilité et la puissance de la sonde
3.5.2 Réglage de la taille du faisceau pompe
3.5.3 Amélioration de la résolution temporelle de l’expérience pompe sonde
3.5.4 Mesures d’anisotropie
3.5.5 Montage à deux échantillons
3.6 Mise en place de l’expérience résolue spectralement 
3.6.1 Modifications au niveau de la sonde infrarouge
3.6.2 Mise en place de la pompe visible
3.6.3 Acquisition des signaux pompe sonde
4 Résultats expérimentaux et simulations 
4.1 Expériences intégrées spectralement 
4.1.1 Effet Kerr
4.1.2 Absorption par les transitions de l’hème
4.1.3 Correction du signal pompe-sonde de la cytochrome c oxydase
4.1.4 Mesures d’anisotropie
4.2 Expériences résolues spectralement 
4.2.1 Origines de bruit du signal différentiel
4.2.2 Transfert du CO dans la cytochrome c oxydase
4.2.3 Oscillations de cohérence dans l’hémoglobine
4.3 Simulations de dynamique moléculaire 
4.3.1 Construction de la protéine
4.3.2 Modélisation du transfert de ligand
4.3.3 Résultats des simulations
4.4 Discussion 
A Champ complexe et phase spectrale d’une impulsion
A.1 Notation complexe
A.2 Valeurs moyennes
A.3 Phase spectrale
A.4 Impulsion gaussienne
B Optique non linéaire
B.1 Effets non linéaires du second ordre
B.1.1 Doublage de fréquences
B.1.2 Différence de fréquence et amplification paramétrique
B.2 Effets non linéaires du troisième ordre
B.2.1 Effet Kerr optique
B.2.2 Effet Kerr croisé

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