Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et méthode d’interprétation

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Huile essentielle de l’Oliban :

Par combustion de l’Oliban, on obtient une odeur agréable et forte. L’extraction alcoolique de la résine donne l’absolu. Les HE sont obtenues par distillation et les résinoïdes par extraction à l’hexane.

Exemple de biochimie aromatique de l’oliban

L’oliban de Boswellia serrata Roxb. ex Colebr. contient 65% de résine, 30% de gomme et 4% d’huile. L’absolu contient des monoterpènes (α-pinène, limonène, β- thuyène, phellandrène, paracymène, verbénol, verbénone) et des diterpènes (oxyde d’incensole). Les acides boswelliques de la résine possèdent par ailleurs d’excellentes propriétés anti-inflammatoires [25].

Exemples d’applications en parfumerie :

« Coco » de Chanel (1984) ; « Loulou » de Cacharel (1987) ; « Shalimar » de Guerlain (1925) ;
« Gems » de Van Cleef ; « Mania » de Giogio Armani (2000) ; « Nu » d’YSL (2001) [25].

Huile essentielle de la myrrhe

En parfumerie, la myrrhe donne des résinoïdes brun rouge à odeur chaude, épicée, balsamique, à goût amer. Elle sert en parfumerie comme fixatif et l’huile donne une note orientale florale. L’essence de myrrhe obtenue par distillation est un des composants de base des parfums de type
oriental, enassociation avec l’encens, l’opopanax et le santal [41].

Exemple de biochimie aromatique de la myrrhe :

La fraction d’huile volatile contient différents terpènes, sesquiterpènes, des esters, de l’élémol, du cinnamaldéhyde, Cuminaldéhyde, cumicalcohol, de l’eugénol, du herabolene, du limonène, dipentène, pinène, du m-crésol, cadinène et furanosesquiterpene numereous, du myrcène et de l’α – camphorarene; stéroïdes y compris le Z-guggulsterol, et des I, II, III guggulsterols [16] [25].

Exemples d’applications en parfumerie:

« Portos » de Balenciaga ; « Opium » d’YSL(1977) ; « La Myrrhe » des SPRS (1995) ; « Vetiver Extraordinaire » de Dominique Ropion aux éditions de Parfums Frédéric Malle (2002) [25].

Chromatographie sur colonne :

C’est une technique chromatographique préparative pouvant se baser sur le phénomène d’adsorption, d’exclusion ou d’échange d’ion selon la phase stationnaire qui est placée dans la colonne [18].
La chromatographie sur colonne est une méthode standard de purification en chimie organique, elle sert à séparer les constituants d’un échantillon (fractionnement ou purification de produits naturels ou de produits de réaction).

Techniques d’analyses structurales des produits isolés

Divers techniques spectrales (ou spectroscopiques), utilisées seule ou en combinaison avec des méthodes chromatographiques ont été mises à profit dans le présent travail.
Les analyses de l’échantillon par CPG-SM et RMN ont été réalisées au Laboratoire de Pharmacognosie à l’Université de Rouen.

Couplage chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse (CPG-SM)

 Principe de la CPG
Cette technique est utilisée pour séparer les constituants d’un mélange de gaz ou de liquide volatil (huile essentielle, résines, fractions légères des raffineries de pétrole…). Elle a plusieurs applications : vérification de la pureté d’un produit, identification d’une substance, contrôle qualité (médicament, huile essentielle, pesticides, aliments,…) et dosages diverses [24].
Appareillage: un chromatographe en phase gazeuse comprend 5 grandes parties :
– Gaz vecteur (hélium, azote, argon, hydrogène) et régulateur de débit (phase mobile)
– Chambre d’injection pour l’introduction de l’échantillon
– Four à colonne portant la colonne à la température et à la pression convenable
– Colonne : tube contenant la phase stationnaire : généralement, on utilise des colonnes
capillaires (colonne très long et très mince : diamètre interne 0,05 à 0,35mm ; longueur 10 à 100m)
– Détecteur et enregistreur
 Principe de la CPG-SM
Cette technique permet de façon précise l’identification des molécules d’un mélange volatil. Le détecteur utilisé est un spectromètre de masse. Sortis de la colonne de CPG, les composés sont introduits dans une chambre d’ionisation où les molécules sont bombardées par des électrons pour donner des fragments caractéristiques. Les fragments obtenus sont enregistrés sous forme de spectres de masse [24].
Les données spectrales peuvent être comparées avec des spectres de composées connus : si les deux échantillons sont un seul et même produit, leurs spectres seront superposables.

Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et méthode d’interprétation

La spectroscopie de RMN basée sur les propriétés de certains noyaux atomiques constitue un outil performant pour établir une hypothèse de structure moléculaire fiable. Seuls les noyaux de I≠0 donnent des spectres de RMN. Parmi eux figurent le proton (1H), le carbone (13C), l’azote (15N) et le phosphore (31P). La méthode de RMN repose sur le phénomène de magnétisme. En effet, les noyaux cités précédemment possèdent un moment magnétique nucléaire. Ils se comportent comme des aimants microscopiques caractérisés par une grandeur quantique appelée «spin». La technique étudie le comportement de ces noyaux en présence d’un champ magnétique externe. Ce dernier appliqué au produit analysé entraîne un dédoublement de niveaux d’énergie du spin nucléaire, de sorte qu’on puisse induire des transitions entre eux, après absorption d’une radiation électromagnétique adéquate. On obtient ainsi des signaux (FID) dont le traitement par une transformation de Fourrier conduit au graphe appelé « spectre de RMN » [21].
Les 1H (ou les 13C) sont caractérisés sur le spectre par leurs déplacement chimique δ (exprimés en ppm ou partie par million). Cette grandeur est liée à l’environnement chimique du noyau considéré dans la molécule. Des valeurs de δ pour différents types de protons ou carbones sont rassemblées dans des tables dites de références [21].
Plusieurs types d’expériences sont utilisés en RMN. Dans le présent travail, les produits ont été analysés en RMN monodimensionnel (1H, 13C et DEPT) et en RMN bidimensionnel (HMQC).

Etude des produits volatils de l’échantillon

Extraction par hydrodistillation

L’obtention de l’huile essentielle par hydrodistillation, a été réalisée à l’aide d’un essencier de type Clevenger. L’échantillon finement broyé est placé dans un ballon de 2l et immergé dans 1l d’eau ; quelques grains de pierre ponce ont y été ajoutés. L’ensemble est porté à l’ébullition. On note le volume cumulé d’HE en fonction du temps.

Analyse de l’huile essentielle par chromatographie en phase gazeuse (CPG/FID) et méthode d’interprétation :

La Chromatographie en phase gazeuse (CPG) a été la méthode utilisée pour l’analyse de l’huile essentielle. Elle permet de déterminer sa composition qualitative et quantitative.
Dans le présent travail, l’identité des constituants majoritaires a été fixée par la méthode de calcul des Indices de Kovats. L’indice est calculé sur la base des temps de rétention obtenus à partir du chromatogramme de l’HE totale et de celui de paraffines de références [15].
En programmation de température, l’indice de Kovats est calculé suivant la formule :
IK = 100n + (100 × ).
IK : Indice de Kovats.
Tx : Temps de rétention du composé « x » étudié.
Tn: Temps de rétention de la paraffine à « n » atomes de carbones, précédant immédiatement le composé étudié.
Tn+1: Temps de rétention de la paraffine à « n+1 » atomes de carbones, suivant immédiatement le composé étudié.
n : Nombre de carbone de la paraffine précédant immédiatement le composé étudié
On note une confusion dans les compositions, aspects et noms de certaines résines d’origines animales et végétales. Des études chimiques sont alors nécessaires pour les spécifier. Généralement, elles sont constituées par des composés terpéniques.
Les terpènes sont des métabolites secondaires des végétaux, pouvant avoir des rôles importants pour l’être humain. Ces molécules sont utilisées dans le domaine thérapeutique, en parfumerie et en agroalimentaire comme condiment.
Ainsi, par référence aux données bibliographiques sur les utilisations et les valeurs des résines végétales ou animales, le présent travail a été fixé sur l’étude chimique d’une résine collectée sur la côte Ouest de Madagascar.

Mise au point de technique d’extraction et recherche de solvants chromatographiques :

Cette partie consiste à trouver le meilleur solvant permettant d’extraire le maximum des composés contenus dans l’échantillon.
Tous les essais d’extraction ont été réalisés par macération à température ambiante. 1eressai d’extraction : extraction brute 0,2 g de l’échantillon sont finement broyés à l’aide d’un mortier et pilon en céramique.
La poudre obtenue est macérée avec un système de solvant DCM/Methanol (50/50 ; V/V), à température ambiante. La macération a duré 3 jours.
2èrmeessai d’extraction : épuisement successif avec des solvants de polarité croissante : Hexane, DCM. 0,4 g de l’échantillon sont finement broyés. La poudre est macérée de l’Hexane par fractionnement de 30ml jusqu’à épuisement. Le surnageant est transvasé à chaque fois dans un autre tube. La même opération est effectuée avec du DCM.
Chaque extrait obtenu a été soumis à des CCM avec des éluant différents afin d’évaluer les résultats d’extraction selon la variation du solvant et d’en trouver le meilleur éluant qui permet de bien séparer les différents constituants.
Eluants utilisés : AcOEt/Hexane (60/40, v/v).
AcOEt/Hexane (40/60, v/v).
Hexane/DCM (80/20, v/v).

CCM préliminaires :

Il s’agit de déposer un volume déterminé de l’extrait de l’échantillon à étudier sur une plaque de silice avec des témoins stéroïdes : cholestérol, stigmastérol et ergostérol. Le cholestérol est un produit spécifique pour l’ambre gris. [19]
– Eluants utilisés : Hexane/ DCM (90/10, v/v) et Hexane/ DCM (80/20, v/v)
Hauteur de Plaque : 8 cm.
– Les dépôts sont espacés de 1 cm.
– Phase stationnaire : silicagel (phase normale).
Système de révélation :
– Visualisation de la plaque CCM sous UV 254 nm.
– Puis pulvérisation de la plaque CCM avec une solution de vanilline perchlorique sulfurique suivie directement de chauffage.

Préparation du dépôt:

Environ 2,05g de poudre de l’échantillon sont solubilisées dans le DCM à température ambiante pendant 15 minutes.
5g de silice sont ajoutés dans l’extrait de dichlorométhane, l’évaporation à sec de ce mélange a conduit à un résidu qui est ensuite broyé jusqu’à l’obtention d’une poudre très fine. La poudre est versée délicatement dans la colonne.
Une hauteur de solvant de 15cm environ au-dessus de l’adsorbant est nécessaire pour éviter le contact de ce dernier avec l’air.

Elution

Des gradients de solvants de polarités croissantes ont été utilisés Hexane / DCM (100 /0 à 0 /100, V/V), ensuite par le DCM/Méthanol (100/0 à 98,5/1,5, V/V), de façon à accélérer le déplacement des analytes. Les molécules sont entraînées à des vitesses variables selon leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité. Des fractions de 20ml ont été recueillies.
Des CCM sont effectuées sur les fractions recueillies pour comparer leurs constituants et évaluer le nombre de constituants de chaque fraction : celles ayant le même profil chromatographique ont été regroupées.
Les groupes contenant les produits majoritaires sont soumis à une deuxième chromatographie sur colonne (hauteur 35cm, diamètre 1cm). Le gel de silice employé a une masse proportionnelle à celle du groupe à purifier. L’élution est effectuée avec du solvant de système isocratique pour chacun des groupes concernés.
Les produits isolés sont ensuite analysés par les différents méthodes spectroscopiques afin d’établir leurs structures.

Techniques d’analyses spectrales des produits isolés pour leurs déterminations structurales

Analyse des produits résineux par couplage CPG/SM

L’appareillage est composé d’un chromatographe en phase gazeuse Agilent 6890 équipé d’une colonne capillaire à silice fondue Optima 5 (diamètre interne 60 m x 0,25 mm, épaisseur de film 0,25 μm), directement lié à un spectromètre de masse Hewlett-Packard 5973.
Le produit est dissout dans du dichlorométhane : un volume de 1 à 1,5 µl de solution est injecté.Le gaz vecteur est l’hélium, le débit a été régularisé en mode split à 20 ml/min. La température varie entre 60 °C et 280 °C avec une vitesse de 3 °C/min. La température finale est maintenue pendant 20 min. Les spectres de masse sont obtenus en mode impact électronique à 70 eV et par PCI utilisant comme gaz d’ionisation le méthane. L’appareil est piloté par un système informatique HPCHEM.
Les composés sont identifiés par comparaison des indices de rétention et des spectres de masse avec les données de la littérature (librairie informatique Wiley 275 et NIST 98, documents Adams et Davies)

Analyse des produits résineux par RMN

Un appareil Bruker Avance 400 a été utilisé pour l’enregistrement des spectres RMN 1H, des spectres RMN 13C et DEPT 1D et le traitement des spectres par les logiciels TOPSPIN-NMR, MESTRENOVA

Analyse de l’huile essentielle par chromatographie en phase gazeuse (GC/FID) et méthode d’interprétation :

Les étapes suivantes sont respectées :
 Préparation de l’échantillon, 0,2μl de l’huile essentielle pure a été dissoute dans 100μl d’hexane. 0,05μl de cette solution a été injectée. On obtient le chromatogramme A de l’HE pure.
 Préparation du mélange d’alcanes de référence, 0,2μl de chaque alcane est dissout dans 100μl d’hexane.
 Pour la coinjection, dans une même seringue, nous avons introduit 0,05μl du mélange d’alcanes
(C10 àC20) et 0,05μl de la solution d’HE à 2%. Après injection, on obtient le chromatogramme B du mélange HE et d’alcanes.
Les IK des quatre composés majoritaires de l’huile essentielle ont été calculés et comparés aux valeurs données par la littérature.

Examen de l’ensemble des résultats d’analyse spectrale (CPG/SM et RMN)

 Exploitation des résultats CPG/SMIE
Sur le spectre de masse SM/IE du G (4+5)-1 (figure 41), on relève les fragments suivants avec leurs pourcentages : 424 (12 %) ; 205 (60 %); 189 (35 %); 149 (10 %); 121(52 %) ; 109 (35 %); 95 (62 %); 81 (42 %)
La comparaison de ces données avec celles des librairies (figure 42), et des journaux [12] [28] [38] [53], permet de dire que la structure probable du G (4+5)-1 serait celle de l’epi-Ψ-taraxastanonol ( de masse moléculaire 442g/mol et de formule brute C30H50O2).
Le fragment à m/z=424 (C30H480) pourrait provenir de la déshydratation de l’epi-Ψ-taraxastanonol.
L’ion moléculaire à m/z=442 correspondant à la formule brute C30H5002est absent à cause de la déshydratation…
Le pic intense à m/z=205, serait dû à l’ouverture du cycle E.

Table des matières

TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION
PARTIE 1 SYNTHESE DES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LES MATIERES RESINEUSES
I-1 Généralités sur les résines
I-1-1 Définition
I-1-2 Rôles des résines au sein d’une plante
I-1-3 Caractéristiques générales des résines
I-1-3-1-Propriétés physiques
I-1-3-2- Composition et propriétés chimiques
I-1-3-3-Différents modes de classification des produits résineux
 La classification taxonomique
 La classification chimique
 Classification selon les constituants de résine
I-2 Résines diterpéniques
I-2-1 Notion de diterpénoïdes
I-2-2-Sources des résines diterpéniques
I-2-3-Résines de conifères
 Copal de Congo
 Colophane
I-2-4- Ambre jaune
Définition
Composition chimique
Utilisations
Répartition géographique
I-3 Résines triterpéniques
I-3-1- Notion de triterpénoïdes
I-3-2-Sources des résines triterpéniques
I-3-3 L’Oliban
Définition
Composition chimique
Utilisations
Répartition géographique
I-3-4-La myrrhe
Définition
Composition chimique
Utilisations
Répartition géographique
I-3-5-Autres résines triterpéniques
Mastic
Dammar
I-4- Autres produits résineux : cas de l’ambre gris
Définition de l’ambre gris
Caractéristiques
Composition chimique
Utilisations
I-5- Huiles essentielles de résines
I-5-1-Notion générale de huile essentielle
Définition
Composition chimiques
Notions sur les monoterpènes
Notions sur les sesquiterpènes
I-5-2- L’huile essentielle de l’Oliban
I-5-2-1 Exemple de biochimie aromatique de l’oliban
I-5-2-2 Exemples d’applications en parfumerie
I-5-3- L’huile essentielle de la myrrhe
I-5-3-1 Exemple de biochimie aromatique de la myrrhe
I-5-3-2 Exemples d’applications en parfumerie
I-5-4- Huile essentielle d’autres résines
I-6-2 Chromatographie sur colonne
I-6-3 Techniques d’analyses spectrales des produits isolés
I-6-3-1 Couplage chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse (CPG-SM)
I-6-3-2 Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et méthode d’interprétation
I-7- Techniques d’étude des produits volatils de l’échantillon
II-7-1 Extraction par hydrodistillation
II-7-2 Analyse de l’huile essentielle par chromatographie en phase gazeuse (GC/FID) et méthode d’interprétation
PARTIE 2 MATERIELS ET METHODES
II-1 Choix de l’échantillon et stratégie d’étude
II-1-1- Echantillons à étudier
Caractéristiques généraux de l’échantillon à étudier
II-1-2- Matériels de laboratoires utilisés
II-1-3- Stratégie de recherche adoptée
II-2- Techniques d’études préliminaires
II-2-1-Tests physiques
II-2-2- Mise au point de technique d’extraction et recherche de solvants chromatographiques
II-2-3-CCM préliminaires
II-2-4- Criblage des triterpènes et stéroïdes
II-2-5- Techniques d’extraction et d’isolement des constituants non volatils
Extraction dans le DCM
II-2-6 Fractionnement de l’extrait
II-2-6-1Préparation de la colonne
II-2-6-2Préparation du dépôt
II-2-6-3Elution
II-3- Techniques d’analyses spectrales des produits isolés pour leurs déterminations structurales
II-3-1 Analyse des produits résineux par couplage CPG/SM
II-3-2 Analyse des produits résineux par RMN
II-4-Analyse de l’huile essentielle par chromatographie en phase gazeuse (CPG/FID) et méthode d’interprétation
Conclusion partielle
PARTIE 3 RESULTATS ET DISCUSSIONS
III-1- Résultats des tests physiques
III-2- Résultats des extractions par solvants
III-2-1-Rendements d’extractions obtenues des solvants variés
III-2-2- Résultats de la CCM de divers extraits
III-2-3-Résultats de CCM de l’extrait DCM
III-2-4- Résultats du criblage des triterpènes et stéroïdes
III-2-5- Fractionnement de l’extrait
III-2-6- Purification des groupes de fractions : isolement des constituants
III-3- Etudes structurales des produits isolés
III-3-1- Identification du produit G10
 Analyse par CPG/SM
 Du composé majoritaire G102
 Du composé minoritaire G101
 Analyse par RMN
 Du composé majoritaire G102
 Du composé minoritaire G101
III-3-2- Identification des produits G(4+5)-1 et G6-1 : élucidation de la structure épi-ψ taraxastanonol
III-3-2-1-Comparaison des profils chromatographiques de G(4+5)-1 et G6-1
III-3-2-2-Examen de l’ensemble des résultats d’analyses spectrales (CPG/SM et RMN)
 Exploitation des résultats CPG/SMIE
 Exploitation des spectres de RMN
III-3-3- Identification des produits G6-3 et G6-4 : élucidation des structures α-amyrenone et β amyrenone
III-3-3-1 – Comparaison des profils chromatographiques de G6-3 et G6-4
III-3-3-2 – Examen du résultat CPG/SM du produit majoritaire G642
III-3-3-3 – Examen du résultat CPG/SM du produit minoritaire G641
 Exploitation des résultats CPG/SMIE
III-4- Résultats d’étude des constituants volatils
III-4-1-Extraction
III-4-2-Identification des constituants par analyse en CPG/FID
Conclusion partielle
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES

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