Soutenance mémoire
Les maladies hémoparasitaires, dues à des parasites circulant dans le sang, sont nombreuses chez l’homme et chez les animaux. Ces maladies s’étendent des affections bénignes peu handicapantes aux affections graves. Le paludisme et la filariose sont parmi les maladies hémoparasitaires responsables d’importants problèmes de santé publique. Le paludisme est dû aux protozoaires du genre Plasmodium spp. transmis par la piqûre de l’anophèle femelle. Il est l’une des plus importantes maladies qui frappent l’espèce humaine. Près de la moitié de la population mondiale est exposée à cette maladie (1). Les filarioses sont engendrées par différentes espèces de vers connus sous le nom de filaires. Trois espèces de filaires peuvent être responsables de la filariose lymphatique dont la plus fréquente est Wuchereria bancrofti (2). Le paludisme et la filariose lymphatique peuvent être concomitants en partageant les vecteurs communs qui sont les moustiques du genre Anopheles (3).
Les animaux domestiques et sauvages sont également des hôtes de plasmodies et de microfilaires. Les infections à Plasmodium touchent les mammifères, les oiseaux et les reptiles (4). Les microfilaires ont été découvertes chez les singes, les carnivores domestiques et les chauves-souris (5). Des microfilaires ayant une ressemblance morphologique à Wuchereria bancrofti var vauceli ont été décrites chez les lémuriens (6). En conséquence, l’objectif principal de cette étude est de mettre au point des techniques d’amplification génique (PCR) pour détecter ces hémoparasites chez les lémuriens dans le but de suivre et de contrôler la circulation des parasites pouvant potentiellement infecter l’homme.
GENERALITES
Lémuriens
Prosimiens endémiques de Madagascar, 5 familles et 15 genres de lémuriens diurnes et nocturnes sont répertoriés, soit les Cheirogaleidae (Allocebus, Cheirogaleus, Microcebus, Mirza, Phaner), les Lepilemuridae (Lepilemur), les Lemuridae (Eulemur, Hapalemur, Lemur, Prolemur, Varecia), les Indridae (Avahi, Indri, Propithecus) et les Daubentoniidae (Daubentonia). Sur les 101 espèces et sous-espèces de lémuriens décrites, 26 sont considérées comme menacées d’extinction selon la dernière évaluation de l’UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) et figurent sur la Liste Rouge (7). En effet, de nombreuses menaces indirectes pèsent sur ces animaux avec la destruction de leur environnement, notamment la déforestation et l’exploitation forestière (production de charbon, défrichage et feu de brousse augmentant les surfaces de pâturage pendant la saison sèche) mais également des menaces directes avec le braconnage et la capture, les destinant à devenir des animaux de compagnie .
Spécificité des lémuriens
La diversité morphologique et comportementale des lémuriens, leur origine unique dans l’évolution et leur distribution biogéographique restreinte se combinent pour faire d’eux des primates remarquables à l’échelle mondiale. Les Cheirogaleidae comprennent ainsi les plus petits primates vivants, pesant entre 30 et 87 grammes, appartenant au genre Microcebus. Nocturnes et principalement frugivores, ils sont également les seuls primates connus pour hiberner durant une grande partie de la saison sèche. Le plus grand lémurien actuel, Indri indri, ne possédant qu’un appendice caudal, pèse jusqu’à 9,5 kg et mesure jusqu’à 90 cm. Diurne, folivore et sauteur spectaculaire, il est le seul représentant vivant de la famille des Indridae (8). La dernière espèce vivante appartenant aux Daubentoniidae, appelée Aye-aye (Daubentonia madagascariensis) est le plus particulier des lémuriens avec des incisives en croissance continue, de larges oreilles, une queue ressemblant à celle des écureuils et le troisième doigt de la main, squelettique et extrêmement allongé, servant à fouiller les orifices dans lesquels pourraient se trouver ses proies .
Espèces de lémuriens étudiées
Propithecus verreauxi coronatus
Comme les autres membres de la famille des Indridae, Propithecus a un complexe postural et locomoteur inhabituel caractérisé par la tenue verticale du corps sur des supports verticaux (8). Les sous-espèces de Propithecus verreauxi ont des aires de répartition différentes. Propithecus verreauxi coronatus a un pelage presque entièrement de couleur blanc crème. La tête, le cou et la gorge ont une coloration chocolat à brun noir. La face est nue, de couleur grise sombre à noire et de forme plus carrée. Les oreilles présentent des poils blancs. Propithecus verreauxi coronatus se rencontre dans des forêts sèches d’arbres à feuilles caduques. Il peut parfois être observé en train de se nourrir au sol. Le régime alimentaire est principalement constitué de bourgeons et de fruits non mûrs, avec une proportion significative de feuilles. Il vit en groupes de deux à huit individus (8). Cette sous espèce figure sur la Liste Rouge de l’UICN dans la catégorie « en danger critique d’extinction » .
Lemur catta
Le genre Lemur ne contient qu’une unique espèce appelée Lemur catta. Le dos présente généralement une coloration grise à gris-brun. Le ventre est blanc cassé ou crème. La face ainsi que la gorge sont plutôt blanchâtres. La queue est longue et présente des anneaux alternativement noirs et blancs. C’est un animal diurne et semiterrestre. Il se rencontre dans les forêts d’épineux, les buissons secs, les forêts d’arbres à feuilles caduques et les couloirs forestiers. Son régime alimentaire comprend des fruits, des feuilles, des fleurs, des écorces, des jus de plantes et occasionnellement des invertébrés. Les groupes de Lemur catta peuvent comporter jusqu’à 24 individus sous dominance des femelles. Les marquages olfactifs sont très importants surtout pour la délimitation du territoire (8). Cette espèce figure sur la liste de l’UICN dans la catégorie « quasi menacée » .
Varecia variegata variegata
Ce sont les plus grands des Lemuridae vivants. La sous-espèce Varecia variegata variegata a un pelage long et dense. La queue, les pattes, les surfaces intérieures des membres, les épaules, la face, le museau et le sommet de la tête sont noirs. Le dos, les flancs et la majeure partie de la surface extérieure des membres sont blancs. Les oreilles sont blanches avec de longs poils formant une collerette blanche autour des joues et sous le menton. Varecia variegata variegata se rencontre dans les forêts tropicales humides de moyenne altitude. Les fruits et le nectar constituent l’essentiel de son régime alimentaire, complétés par des feuilles et des graines. Ses vocalisations sont puissantes. Il est classé « en danger critique d’extinction » selon l’UICN .
Paludisme
Le paludisme est une parasitose due à des hématozoaires du genre Plasmodium, transmise par des moustiques du genre Anopheles. Cette maladie concerne principalement les populations vivant en zone intertropicale.
Epidémiologie du paludisme
Importance du paludisme à l’échelle mondiale
Fléau mondial et quatrième cause de mortalité liée à une maladie infectieuse, le paludisme se classe derrière les maladies respiratoires aiguës, le VIH/SIDA et les maladies diarrhéiques (10). Selon le « Rapport sur le paludisme dans le monde 2011 », 216 millions de cas de paludisme causant 655’000 décès ont été enregistrés en 2010 pour la plupart en Afrique, où selon les statistiques, un enfant meurt chaque minute du paludisme (11). L’endémie est élevée dans les zones tropicales défavorisées d’Afrique, d’Asie et d’Amérique Latine et les cas de paludisme enregistrés en Europe sont dits d’importation et concernent les personnes n’ayant pas suivi de prophylaxie lors de leur séjour à l’étranger .
Importances relatives des espèces plasmodiales humaines
Quatre espèces de parasites du genre Plasmodium sont responsables de la maladie chez l’homme.
– La première espèce Plasmodium falciparum provoque la majorité des cas mortels. Retrouvée dans les zones tropicales d’Amérique Latine et d’Asie, P. falciparum est aussi l’espèce dominante en Afrique (12).
– Plasmodium vivax coexiste avec P. falciparum partout dans le monde ainsi que dans certaines régions tempérées (12).
– Plasmodium ovale, trouvé principalement en Afrique de l’Ouest, entraîne des rechutes 4 à 5 ans après la primo infection (12).
– Plasmodium malariae, rare avec une distribution mondiale inégale, entraîne des rechutes jusqu’à 20 ans après la primo infection .
Plasmodium knowlesi, principalement retrouvé dans les pays d’Asie du Sud- Est, est le cinquième agent étiologique potentiel du paludisme humain .
Paludisme à Madagascar
Des variations bioclimatiques conditionnent la durée et l’intensité de la transmission du paludisme. Le paludisme est à forte transmission toute l’année au niveau de la côte Est. Il est stable avec une forte transmission en saison des pluies au niveau de la côte Ouest et au Nord. Le paludisme est instable et saisonnier au niveau des hautes terres centrales. Au Sud, il est instable à transmission liée aux précipitations. Les altitudes supérieures à 1 500 m et les grandes agglomérations urbaines sont des zones « sans transmission ». Plasmodium falciparum est en cause dans près de 90% des accès palustres .
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Table des matières
INTRODUCTION
I. GENERALITES
I.1. Lémuriens
I.1.1. Spécificité des lémuriens
I.1.2. Espèces de lémuriens étudiées
I.2. Paludisme
I.2.1. Epidémiologie du paludisme
I.2.2. Infection
I.2.3. Paludisme des primates non-humains
I.3. Filariose
I.3.1. Filariose lymphatique
I.3.2. Filariose lymphatique chez les animaux
I.3.3. Filariose lymphatique chez les primates
I.4. Co-infection
I.5. Zoonoses
I.6. Conservation
I.7. PCR
I.7.1. Principe
I.7.2. Réaction
I.7.3. Exigences de la PCR
I.7.4. Types de PCR
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. Méthodes
II.1.1. Cadre et type d’étude
II.1.2. Durée d’étude
II.1.3. Objectifs de l’étude
II.1.4. Critères d’inclusion et d’exclusion
II.1.5. Prélèvements sanguins des lémuriens
II.1.6. Transport des échantillons
II.1.7. Stockage des prélèvements
II.1.8. Traçabilité des prélèvements
II.1.9. Microscopie optique
II.1.9.1. Confection de la goutte épaisse et du frottis mince
II.1.9.2. Séchage et fixation
II.1.9.3. Coloration
II.1.10. Test de diagnostic rapide
II.1.10.1. Dépistage de Plasmodium spp par TDR
II.1.10.2. Dépistage de Wuchereria bancrofti par TDR
II.1.11. Extraction d’ADN
II.1.11.1. Extraction à partir du sang total
II.1.11.2. Extraction d’ADN à partir des lames souches de l’OMS positives en Wuchereria bancrofti
II.1.12. PCR
II.1.13. Electrophorèse
II.1.14. Purification d’ADN
II.1.15. Optimisation des conditions de PCR
II.1.16. Recherche des hémoparasites chez les lémuriens
II.2. Matériels
II.2.1. Prélèvement
II.2.2. Microscopie
II.2.3. Test sérologique ou test de diagnostic rapide (TDR)
II.2.4. Extraction d’ADN
II.2.5. PCR conventionnelle et PCR en temps réel
II.2.6. Matériels biologiques
III. RESULTATS
III.1. Résultats de la microscopie et du TDR
III.2. Résultat global de la PCR
III.3. Résultats des mises au point des PCR conventionnelles simplex
III.3.1. Résultats de la mise au point de la recherche de Plasmodium
III.3.2. Résultats de la mise au point de la recherche des microfilaires
III.4. Résultats des mises au point des PCR conventionnelles duplex
III.5. Résultats des mises au point des PCR en temps réel
III.5.1. Résultat de la mise au point de la RT-PCR servant à la recherche de Plasmodium
III.5.2. Résultat de la mise au point de la RT-PCR pour la recherche de Wuchereria bancrofti
III.6. Résultats des PCR des prélèvements de lémuriens
III.6.1. Résultats des PCR standards simplex
III.6.2. Résultat de la PCR standard duplex
III.6.3. Résultats de la PCR en temps réel simplex
IV. DISCUSSION
IV.1. Méthodes
IV.1.1. Microscopie et TDR
IV.1.2. Extraction de l’ADN génomique
IV.1.3. PCR classique et PCR en temps réel
IV.1.4. Optimisation de la PCR
IV.2. Résultats des PCR
V. SUGGESTIONS
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
