Souches bactériennes, plasmides et bactériophages

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Assemblage de la particule virale et encapsidation du génome dans la lignée des bactériophages caudés-herpèsvirus

L’assemblage des particules virales est un processus complexe en plusieurs étapes dont l’objectif final est de produire des virus infectieux. Ils doivent être capables de détourner les machineries cellulaires, de répliquer leur génome en plusieurs copies, de synthétiser les différentes protéines et de sortir de la cellule hôte. L’encapsidation du génome virale est une des étapes les plus fascinantes du cycle viral. Elle a été largement étudiée chez les virus à ADN db tel que les bactériophages à queue et les herpèsvirus.

Les bactériophages à queue

Les bactériophages sont les entités biologiques les plus présentes dans l’environnement et sont présents dans tous les écosystèmes (Ackermann, 2001). Les bactériophages sont classés selon le type de leur acide nucléique, la symétrie de la capside et la présence ou non d’une enveloppe (Ackermann, 1998). Il a été observé que parmi les 5500 bactériophages étudiés au microscope électronique depuis 1956, 96% de ces phages sont des bactériophages à queue (ordre Caudovirales). Ils ont une symétrie binaire et sont caractérisés par une tête icosaédrique et une queue, longue ou courte, contractile ou non. Cet ordre est subdivisé en trois familles en fonction de la morphologie de la queue ; 1) Myoviridae (24.5%), longue queue contractile, 2) Siphoviridae (61%), longue queue non contractile, et 3) Podoviridae (14%), queue courte (Figure 1.2) (Murphy, 1995 ; Ackermann, 2007). Étant l’ordre de phages le plus important, et infectant la vaste majorité des espèces bactériennes (Ackermann, 2007), beaucoup de travaux ont été réalisés sur le groupe des bactériophages à queue.
Figure 1.2. Représentation schématique des différents groupes de phages à ADN db de la famille des Caudovirales (Ackermann, 2007).

Voies d’assemblage de la capside des bactériophages à queue

L’étude du cycle de vie des différents bactériophages à queue a apporté des connaissances sur plusieurs mécanismes génétiques et biochimiques impliqués au cours de ce processus et a montré une voie de morphogénèse de la particule virale commune. En effet, les travaux sur certains des bactériophages les plus étudiés (phages λ, T4, T7, P22 et SPP1) ont montré les différentes étapes séquentielles de la voie d’assemblage des virions et les différentes interactions entre les protéines virales mises en jeu. Le processus commence par l’assemblage de la procapside, la première forme intermédiaire de la capside observée lors de la construction du virion. La procapside est un icosaèdre avec une forme sphérique d’une taille de 60 nm pour le phage λ (Lander et al, 2008), 60 nm chez T7 (Guo et al, 2014) et 61 nm chez P22 (Chang et al, 2007). Elle est constituée par de centaines de copies de la protéine majoritaire de la capside qui constituent sa coque extérieure dans laquelle les protéines d’échafaudage sont renfermées. Pendant l’assemblage de la procapside une protéine, nommée portale, forme un sommet spécialisé appelé aussi le « sommet portal » (Figure 1.3) (Moore et Prevelige, 2002). Celle-ci est un élément structural présent chez tous les bactériophages à queue. Malgré les différences de séquence d’acides aminés, les études par microscopie électronique ainsi que par diffraction de rayons X ont montré que les protéines portales partagent une structure cyclique homo-oligomérique (Orlova et al, 1999). Chez le bactériophage T7 ainsi que ϕ29, elle est formé par 12 sous-unités (T7 : Agirrezabala et al, 2005 ; ϕ29 : Guasch et al, 2002). Chez SPP1, la protéine isolée est formée par 13 sous-unités (Dube et al, 1993) et par 12 sous-unités organisées autour d’un canal dans la particule phagique (Lebedev et al, 2007). La translocation de l’ADN à l’intérieur de la procapside à lieu à travers ce canal portal. L’encapsidation de l’ADN commence par la reconnaissance et le clivage de l’ADN viral. Celui-ci est présent, le plus souvent, sous forme de concatémère composé par une suite de copies du génome phagique organisées en tête-queue (Black et al, 1989), résultant d’une réplication en cercle roulant (Takashi et al, 1975) ou par recombinaison (Mosig et al, 1998).
L’encapsidation du génome viral dans la procapside fait intervenir une protéine virale spécialisée, la terminase. Cette dernière est présente chez tous les bactériophages à queue et a un rôle essentiel dans le processus d’encapsidation du génome. La terminase est constituée chez la plupart des bactériophages par deux sous-unités, une petite sous-unité (TerS) qui varie selon les phages entre 16 et 21 kDa (T4: 18 kDa (Lin et al, 1997), P22 : 18,6 kDa (Mcnulty et al, 2001), SPP1 : 16 kDa (Oliveira et al, 2013)) , et une grande sous-unité (TerL) entre 46 et 72 kDa (T4 : 70 kDa (Lin et al, 1997), P22 : 57,6 kDa (Mcnulty et al, 2001), SPP1 : 48,8 kDa (Oliveira et al, 2013)).
L’encapsidation de l’ADN commence par la reconnaissance spécifique d’une séquence par TerS qui sera le point de départ de l’empaquetage du génome dans la particule virale (Figure 1.3). Cette reconnaissance est suivie par un clivage spécifique dans cette séquence par la TerL générant ainsi une extrémité libre prête à être encapsidée. Le complexe nucléoprotéique TerS-ADN-TerL va alors se fixer à la protéine portale par une interaction directe TerL-protéine portale, et démarrer la translocation de l’ADN vers l’intérieur de la procapside grâce à l’activité ATPasique de la TerL. Une fois la procapside remplie, la protéine TerL effectue un nouveau clivage endonucléolytique non spécifique ou spécifique, selon le phage, qui termine l’encapsidation. Des protéines viennent alors se fixer au sommet portal pour fermer le pore portal et former un complexe nommé connecteur, sur lequel viendra se fixer la queue pour finir la formation de la particule phagique. Le complexe terminase-ADN détaché de la capside va interagir avec une autre procapside et démarrer un nouveau cycle d’encapsidation (Casjens, 2011 ; Oliveira et al, 2013).
Figure 1.3. Schéma général de la voie de morphogénèse de la particule virale chez les bactériophages à ADN double-brin. Le concatémère viral est représenté en interaction avec les deux sous unités de la terminase TerS-TerL. Après reconnaissance et clivage, le complexe ADN-terminase se fixe à la protéine portale, par laquelle l’ADN est transloqué vers l’intérieur de la procapside grâce à l’hydrolyse de l’ATP par la protéine TerL. Une fois la tête pleine, une seconde coupure de l’ADN par la TerL a lieu finissant l’encapsidation du génome. Le complexe ADN-terminase se détache pour chercher une nouvelle procapside. Des protéines additionnelles viennent fermer le pore portal, suivi par la fixation de la queue. Figure adaptée de http://viralzone.expasy.org/.

Initiation de l’encapsidation chez les bactériophages à queue

Lors de l’infection des bactéries, la plupart des phages ne dégradent pas le génome de l’hôte et doivent donc reconnaitre sélectivement le génome viral. L’encapsidation de l’ADN commence par la reconnaissance de régions spécifiques dans des concatémères produits par cercle roulant ou par recombinaison. On reconnait trois stratégies d’encapsidation en fonction du site reconnu et des caractéristiques des molécules d’ADN encapsidées. C’est ainsi que trois groupes de phages se distinguent : i) Les phages dont l’encapsidation commence et se termine par une coupure dans la séquence « cos » et qui produit des extrémités cohésives, ii) Les phages dont l’encapsidation commence par la séquence « pac » et se termine dans une séquence différente, déterminée par le mécanisme par tête pleine avec la production d’extrémités redondantes et iii) Un troisième groupe qui inclut les phages T3 et T7, dont l’encapsidation commence et se termine sur un site spécifique, en produisant de longues extrémités redondantes.

Les bactériophages « cos »

Les mécanismes d’encapsidation chez les phages « cos » ont été bien étudiés chez le bactériophage λ. L’assemblage de virions infectieux commence par la reconnaissance et le clivage d’une séquence spécifique du concatémère nommée « cos » pour cohésif, puisque l’encapsidation d’un monomère d’ADN dans la procapside conduit à la production d’un ADN linéaire avec des bouts cohésifs de 12 pb complémentaires (Catalano et al, 1995). Comme chez les autres bactériophages à queue, l’initiation de l’encapsidation est assurée par la terminase. La séquence cos du phage λ est une région de 200 pb avec plusieurs sites (Figure 1.4) : cosN, cosB et cosQ (Yang et al, 2008). La TerS de λ gpNu1 reconnait spécifiquement 3 motifs R répétés de 16 pb dans la région cosB qui se trouve à droite du site de clivage par la terminase (Yang et al, 1997). L’interaction gpNu1- cosB va alors conduire la TerL de λ, gpA, sur le site cosN pour couper à une distance de 22 pb générant ainsi une extrémité libre prête à être encapsidée de manière unidirectionnelle dans la tête du phage. L’encapsidation de l’ADN commence alors grâce à l’activité ATPasique de la sous-unité gpA (Feiss & Catalano, 2005). Une fois la capside pleine, gpA va terminer le cycle d’encapsidation avec un second clivage dans la séquence cosN. La région cosQ constituée de 7 pb et qui se trouve à 17 pb à gauche de cosN a été décrite comme nécessaire pour une terminaison de l’encapsidation sur le site approprié cosN (Wieczorek & Feiss, 2001).
Figure 1.4. Mécanisme d’encapsidation chez les phages « cos ». L’ADN concatémèrique du phage λ est représenté schématiquement dans la partie supérieure de la figure. Le polymère d’ADN est présenté avec les séquences cos entre chaque unité issue de la réplication en cercle roulant. Les flèches verticales représentent les sites de coupure dans cos et les flèches horizontales le nombre de cycles d’ADN encapsidé indiquant le sens de l’encapsidation du génome. Dans l’agrandissement du génome de λ en bas de la figure sont montrés les sites cos d’initiation et de terminaison de l’encapsidation avec les éléments de séquence nécessaires pour déterminer le clivage de cos (Feiss & Catalano, 2005 ; Wieczorek & Feiss, 2001). Figure adaptée à partir de Yang et al, 2008.

Les bactériophages « pac »

Plusieurs bactériophages bien étudiés tels que les phages, P22, P1 et SPP1 font partie du groupe de phages qui encapsident leur génome à partir d’une séquence pac. Comme les phages cos, ce groupe encapside son ADN à partir d’un concatémère. La production des virus infectieux requiert l’encapsidation d’au moins une unité du génome qui passe par une première reconnaissance et clivage dans la séquence pac. En effet la petite sous-unité de la terminase reconnait une séquence spécifique de l’ADN « pac » pour « packaging » démarrant ainsi le premier cycle d’une série processive et unidirectionnelle de cycles d’encapsidation. Le site de terminaison est cette fois-ci non spécifique, déterminé par la quantité d’ADN dans la capside.
Chez le phage P22 qui infecte la bactérie Salmonella typhimurium (Zinder et Lederberg, 1952), l’initiation de l’encapsidation du génome commence par la reconnaissance d’une séquence de 22 pb au sein de pac par la TerS, gp3 de P22 (Wu et al, 2002). Cette interaction est suivie par un clivage par la nucléase TerL (gp2) de P22 dans une région à gauche du site de reconnaissance à une distance de 120 pb. Chez P22 le clivage de pac est caractérisé par 6 coupures dans cette région, distribuées à 20 pb d’intervalle (Wu et al, 2002). Chez le phage P1 qui infecte une large gamme de bactéries Gram-négatives (Yarmolinsky et Sternberg, 1988), pac est une séquence de 162 pb. TerS, PacA dans P1, reconnait 7 motifs répétés 5’-TGATCA/G -3’ qui se trouvent dans 90 pb de la séquence pac de part et d’autre du site de clivage (Sternberg et Coulby, 1990). TerL, PacB dans P1, vient alors couper dans une séquence de 13 pb (Sternberg et Coulby ,1987). Le phage SPP1 qui infecte B.subtilis a une séquence pac de 268 pb dont l’organisation et position sont différentes par rapport à P22 et P1. Elle sera décrite en détail dans la section 1.3.2.1.
Selon les phages, la région pac varie en taille et en séquence mais tous ces phages adoptent la même stratégie de reconnaissance d’un site spécifique, suivie d’un clivage effectué par la terminase. Cette première reconnaissance est critique puisqu’elle représente le point de départ de plusieurs cycles d’encapsidation où les autres séquences pac ne sont pas coupées. En effet, une fois la capside pleine d’ADN, TerL enclenche une nouvelle coupure cette fois non spécifique par le mécanisme de tête pleine déterminée par la quantité d’ADN à l’intérieur de la tête (Figure 1.5). La quantité d’ADN encapsidée est probablement déterminée par un capteur qui détecte quand la tête est pleine. Chez SPP1, des substitutions d’acides aminées dans la protéine portale gp6 (mutations siz) ont montré que l’ADN encapsidé était plus court que la gp6 sauvage. Une des mutations siz se trouve dans la partie de gp6 qui est à l’intérieur de la capside, ce qui pourrait en constituer l’élément qui détecte la quantité d’ADN encapsidée en le bloquant par un changement de conformation. Une autre mutation dans gp6 qui induit l’encapsidation d’un ADN plus court, a aussi été associée à une réduction de l’activité ATPasique de gp2, ce qui basculerait l’activité de cette protéine vers la coupure nucléasique qui termine le cycle d’encapsidation (Oliveira et al, 2013). Le mécanisme de terminaison par tête pleine conduit à ainsi à l’encapsidation d’une quantité d’ADN supérieure à une unité du génome viral, par exemple 104% chez SPP1 (Tavares et al, 1996). Le résultat de ce mécanisme est une population de molécules d’ADN encapsidées avec une permutation partielle de leur séquence et avec des extrémités redondantes (Casjens et Gilcrease, 2009). La redondance terminale permet la recirculation de l’ADN viral lors d’une infection afin de démarrer sa réplication dans le cytoplasme de la cellule hôte.
Figure 1.5. Mécanisme d’encapsidation de l’ADN par tête pleine « Headful ». Représentation schématique de l’ADN concatémèrique d’un phage pac, ici SPP1, issu du mode de réplication en cercle roulant. La première flèche verticale rouge (à gauche) indique le premier clivage spécifique dans pac qui génère une extrémité libre d’ADN qui est encapsidée lors du premier cycle d’encapsidation. Les flèches verticales suivantes représentent les clivages sur des séquences non spécifiques qui finissent chaque encapsidation, déterminées par le mécanisme d’encapsidation par tête pleine. Les flèches horizontales montrent la direction de l’encapsidation et indiquent les différents cycles d’encapsidation. La région entre deux sites pac correspond à une unité de génome de SPP1 (44.0 kb). La région entre deux flèches verticales correspond à la taille du chromosome mature de SPP1 encapsidé (45.5 kb) (Oliveira et al, 2013).

Les phages avec des extrémités redondantes fixes

Cette stratégie d’encapsidation est utilisée par les bactériophages T3 et T7 qui infectent E. coli. Comme les phages « cos » et « pac », la réplication de leur ADN produit un concatémère. L’initiation et la terminaison de l’encapsidation se fait par la reconnaissance et le clivage d’une séquence spécifique, tel que les phages « cos ». Cependant, ces phages sont caractérisés par la présence de longues extrémités à bouts francs de 160 pb pour T7 et 230 pb pour T3. Les mécanismes impliqués dans ce processus sont peu connus mais ils requièrent probablement une synthèse de l’ADN des extrémités lors de l’encapsidation pour générer une répétition de leur séquence (Calendar, 1988).

Voie d’assemblage et encapsidation du génome dans les Herpèsvirus

Le processus utilisé par les bactériophages à queue pour l’assemblage de leur capside et l’encapsidation du génome viral dépasse la barrière eucaryote/procaryote. En effet, la même stratégie est observée chez les herpèsvirus (ordre Herpesvirales), des virus à ADN db qui infectent les animaux et les humains. La voie d’assemblage de la lignée des phages caudés et des virus d’Herpès suit un schéma général commun avec un ordre séquentiel et bien défini d’interactions protéine-protéine et protéine-acide nucléique. Comme chez les phages (Figure 1.6), le génome viral est protégé à l’intérieur d’une procapside préformée qui est le premier élément observé lors de la morphogénèse de ces virus eucaryotes. Celle-ci de forme sphérique est composée par la protéine majoritaire de la capside appelée UL19 qui renferme 1100 copies des protéines d’échafaudage UL26.5 et de la protéase virale UL26. La protéine portale UL6 est positionnée à un sommet unique de la procapside. La protéolyse des protéines d’échafaudage suivie par leur sortie et l’expansion de la procapside sont suivies par l’encapsidation de l’ADN (Baines, 2011).
L’encapsidation de l’ADN est initiée par la reconnaissance et le clivage d’une séquence spécifique du concatémère. Ce concatémère est constitué par la répétition de deux segments retrouvés dans le génome viral. Ils sont désignés par leur longueur : un segment long UL (unique long) et un court Us (unique short). Des boites répétées inversées sont présentes de part et d’autre de chaque segment. Des motifs riches en A/T, Pac1 et Pac2, en amont de UL, ont été décrits comme nécessaires pour le premier clivage du concatémère qui a lieu dans la séquence DR1 générant une extrémité 3’ protubérante de sorte que Pac1 et Pac2 ne soient pas encapsidés. Comme chez les bactériophages à queue, cette étape est prise en charge par les protéines de la terminase composé de 3 sous-unités ; i) la protéine UL28 qui a pour rôle la reconnaissance de l’ADN, ii) la protéine UL15 qui a une activité de nucléase et d’ATPase, et iii) la protéine UL33 dont le rôle définitif n’est pas complètement déterminé mais, est nécessaire pour l’encapsidation de l’ADN. L’extrémité libre de l’ADN générée sera ensuite transloquée à l’intérieur de la capside à travers un canal formé par 12 copies de la protéine portale UL6, grâce à l’énergie générée par la protéine UL15. Pour finir l’encapsidation, la terminase UL28/UL15 assure un second clivage dans la séquence DR1 dans la région Pac1 et Pac2. Ceci, génère la même coupure que lors du premier clivage conduisant à la production de molécules avec des extrémités identiques (Adelman et al, 2009 ; Catalano, 2005). S’ensuivent alors des étapes d’assemblages spécifiques aux herpèsvirus. La première est la fixation autour de la capside d’une couche de protéines, le tégument, au contact de la membrane interne du noyau et la seconde, l’enveloppe, dans le cytoplasme au contact des vésicules du réseau trans-Golgi (Mettenleiter et al, 2009).

Table des matières

Chapitre 1 : Introduction
1.1. Le compactage du génome
1.2. Assemblage de la particule virale et encapsidation du génome dans la lignée bactériophages caudés – herpèsvirus
1.2.1. Les bactériophages à queue
1.2.1.1. Voie d’assemblage de la capside chez les bactériophages à queue
1.2.1.2. Initiation de l’encapsidation chez les bactériophages à queue
1.2.1.2.1. Les bactériophages « cos »
1.2.1.2.2. Les bactériophages « pac »
1.2.1.2.3. Les bactériophages avec des extrémités redondantes fixes
1.2.2. Voie d’assemblage et encapsidation du génome dans les Herpèsvirus
1.3. Modèle d’étude : Le bactériophage SPP1 de B. subtilis
1.3.1. Voie d’assemblage chez SPP1
1.3.2. Initiation de l’encapsidation du génome chez le bactériophage SPP1
1.3.2.1. Organisation de la séquence pac chez SPP1
1.3.2.2. Petite sous-unité de la terminase contenant le domaine de liaison à l’ADN : gp1
1.3.2.3. Grande sous-unité de la terminase : gp2
1.4. Problématique
Chapitre 2 : Matériels & Méthodes
2.1. Souches bactériennes, plasmides et bactériophages
2.2. Construction des mutants
2.2.1. Préparation des bactéries compétentes
2.2.2. Mutagénèse dirigée
2.2.3. Clonage
2.2.3.1. Délétions pacL
2.2.3.2. Phages mutants SPP1 Mut6* et SPP1 Mut8*
2.2.4. Transformation et transfection
2.3. Séquençage des mutants construits
2.4. Test de complémentation
2.5. Test du clivage pac in vivo
2.6. Test de clivage pac in vitro, basé sur le système RTS 100 E. coli HY
2.7. Western Blot
2.8. Production et purification des phages
2.9. Purification des fragments pac pour séquençage à haut débit
2.10. PCR run-off
2.11. Séquençage haut débit, Next Generation Sequencing (NGS)
2.12. Analyses bio-informatiques
Chapitre 3 : Résultats
3.1. Etude de la région pacC, cible du clivage par la terminase
3.1.1. Effet des mutations dans pacC sur le clivage pac
3.1.2. Détermination du site de clivage pac chez SPP1 par PCR run-off et séquençage à haut débit
3.1.3. Détermination des sites de clivage pac des phages du groupe de SPP1
3.2. Etude des régions pacL et pacR, les sites de reconnaissance par la petite sous-unité de la terminase gp1
3.2.1. Implication de la région pacR dans le clivage pac
3.2.2. Rôle de la région pacL, non encapsidée, dans le clivage pac
3.2.3. Test de clivage pac in vitro et in vivo dans E.coli
3.3. Etude de l’interaction gp1-ADN
Chapitre 4 : Discussion
4.1. Identification du site de clivage dans pacC
4.2. Les régions pacL et pacR sont nécessaires au clivage de pac
4.3. Modèle proposé
Chapitre 5 : Conclusions et Perspectives
Bibliographie

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