Signalisation au cours de l’organogenèse antéhypophysaire

La croissance est un processus physiologique qui permet le développement de l’organisme. La taille d’un individu est un élément phénotypique visible qui est étudié depuis longtemps du fait de l’existence d’anomalies du développement comme le nanisme. Une courbe de croissance de référence a été déterminée en fonction des tailles moyennes retrouvées dans la population. Il y a retard de croissance lorsque la taille de l’enfant est au moins inférieure à -2 DS (déviation standard) par rapport à la moyenne des courbes normales pour l’âge et le sexe. La croissance est permise en partie par l’action de l’hormone de croissance ou GH (Growth Hormone) qui est sécrétée par la glande pituitaire. L’hypophyse est une glande endocrine régulant les fonctions physiologiques de base incluant la croissance, la réponse au stress, la reproduction, l’homéostasie et la lactation. Elle permet de relayer les signaux de l’hypothalamus jusqu’aux organes périphériques cibles (Figure 1). Cette glande est située dans la selle turcique, une cavité de l’os sphénoïde localisée à la base du cerveau. La glande mature est composée de l’adénohypophyse qui est constituée de l’antéhypophyse et du lobe intermédiaire, et de la neurohypophyse qui correspond au lobe postérieur. Chez l’homme, le lobe intermédiaire est présent chez le nouveau né mais régresse au cours du temps pour disparaître complètement à l’âge adulte. L’antéhypophyse contient une population hétérogène de cinq types cellulaires différenciés caractérisés par la nature de l’hormone produite et sécrétée. Les cellules somatotropes sécrètent la GH et régulent la croissance et le métabolisme. Les cellules lactotropes permettent à la prolactine (PRL) de réguler la production de lait chez la femme. Les cellules corticotropes sécrètent l’ACTH (ou adrénocorticotrophine), produit protéolytique de la POMC (Pro-OpioMélanoCortine), qui stimule la glande surrénale pour la production de cortisol. La TSH (thyréostimuline ou Thyroid Stimulating Hormone) est produite par les cellules thyréotropes et permet le développement des follicules thyroïdiens et la sécrétion d’hormones thyroïdiennes (TH). Les cellules gonadotropes produisent la FSH (Follicle-Stimulating Hormone ou hormone folliculostimulante) et la LH (Luteinising Hormone ou hormone luteïnisante) qui agissent sur les gonades pour initier la maturation sexuelle et le maintien des fonctions reproductrices. La TSH, la LH et la FSH sont des glycoprotéines hétérodimériques composées d’une sous-unité protéique commune appelée alpha-glycoprotéine ou α-GSU [Voss et Rosenfeld, 1992] et d’une sous-unité béta spécifique de l’hormone (TSHβ, LHβ, FSHβ) .

Contrôle génétique du développement antéhypophysaire et pathologie humaine 

Le développement pituitaire chez la souris est complexe et est soumis à une régulation fine des voies de signalisation et des facteurs de transcription aboutissant à la formation d’une hypophyse différenciée [Dasen et Rosenfeld, 1999]. Depuis la placode hypophysaire jusqu’à l’obtention de l’antéhypophyse différenciée (ex poche de Rathke), de nombreux facteurs de transcription agissent et interagissent entre eux. Ces facteurs de transcription dictent la différenciation et la prolifération cellulaire au sein de l’antéhypophyse.

Signalisation au cours de l’organogenèse antéhypophysaire 

Dès les premières étapes du développement pituitaire, les molécules de signalisation diffusent du diencéphale ventral (Bmp4, Fgf8, Wnt5α), de l’ectoderme oral (Sonic Hedgehog, Shh), du mésenchyme avoisinant (Bmp2) et de la poche de Rathke elle-même (Bmp2, Wnt4). Les facteurs diffusibles ont pour effet d’établir l’expression des gènes codant pour des facteurs de transcription qui déterminent ensuite la structure de la glande pituitaire (Figure 3). Leurs rôles au cours de l’organogenèse ont été démontrés dans différents modèles animaux. Shh est exprimé au cours du développement précoce dans l’ensemble de l’ectoderme oral puis son domaine d’expression se réduit. Cependant, chez la souris, son expression n’est pas détectée dans la poche de Rathke, créant ainsi une frontière entre l’antéhypophyse et le reste de l’ectoderme [Treier et al., 2001]. La surexpression de la protéine Hip (Huntingtin interacting protein), antagoniste de Shh, au sein de l’ectoderme oral et de la poche de Rathke, bloque la signalisation Shh et entraîne un arrêt du développement de la poche de Rathke chez les embryons. Les voies Bmp4 et Fgf permettent tout de même la formation d’une poche rudimentaire bien qu’elle soit sévèrement hypoplasique et l’expression du facteur de transcription Lhx3 est graduellement perdue excepté dans les cellules en contact avec l’infundibulum [Treier et al., 2001].

La voie de signalisation Wnt canonique qui est dépendante de la β-caténine – à distinguer des voies Wnt non canonique indépendante de la β-caténine comme la voie de la polarité planaire cellulaire – est impliquée dans l’embryogenèse et dans les mécanismes de prolifération, de différenciation et de polarisation cellulaire au cours de l’embryogenèse [Huelsken et Birchmeier, 2001]. Dans la poche de Rathke, Wnt4 est exprimé à partir de e9,5. L’invalidation génétique de Wnt4 chez les souris entraîne une hypoplasie hypophysaire mais l’origine de ce défaut n’est pas claire. En effet, dans un premier temps, l’invalidation de Wnt4 avait montré une diminution importante de l’expression d’α-Gsu, de Gh et de Tshく [Treier et al., 1998] mais une étude plus récente, utilisant les mêmes souris mutantes [Stark et al., 1994], montre une diminution de l’expression du facteur de transcription pituitaire Pou1f1 sans diminution d’α-Gsu [Potok et al., 2008]. La voie Wnt dépendante de la β-caténine peut coopérer avec d’autres voies de signalisation, notamment la voie Notch. Quatre récepteurs Notch sont présents chez les mammifères. Les cibles de Notch les mieux caractérisées sont les membres de la famille HES (Hairy enhancer of split), Hes1, Hes5 et les membres de la famille Herp (Hes-related protein). Lors du développement pituitaire, la voie de signalisation Notch est diminuée ventralement mais est maintenue dorsalement autour de la lumière de la poche de Rathke. La signalisation Notch pourrait être nécessaire pour l’émergence des cellules précurseurs dépendantes de Pou1f1 [Zhu et al., 2006]. Bmp4 (Bone Morphogenetic Protein) est une molécule de signalisation précoce connue pour être exprimée au niveau de l’infundibulum à partir de e8,5 et jusqu’à e14,5 [Davis et Camper, 2007; Ericson et al., 1998]. La délétion complète de Bmp4, chez la souris, conduit à une létalité embryonnaire. Les analyses histologiques des rares embryons survivants à e10,5 ont montré l’absence de la formation de la poche de Rathke [Takuma et al., 1998]. Une étude de souris transgéniques qui expriment de manière ectopique Noggin, l’antagoniste de Bmp4, au sein de l’ectoderme oral et de la poche de Rathke, a permis d’observer, chez les embryons, un arrêt précoce du développement de la future antéhypophyse à e10,5 [Treier et al., 1998]. Bmp4 est nécessaire à l’induction et au maintien de la poche de Rathke.

Fgf8 (Fibroblast Growth Factor) est également nécessaire à la formation de l’antéhypophyse et a un rôle dans la détermination des cellules antéhypophysaires dorsales. Vingt-quatre heures après le début de l’expression de Bmp4, Fgf8 commence à s’exprimer au niveau de l’infundibulum [Ericson et al., 1998; Treier et al., 1998, 2001]. L’utilisation d’un antagoniste du récepteur des Fgf mimant la perte de la signalisation Fgf, entraîne la diminution de l’expression de Lhx3, ainsi que la différenciation ectopique des cellules thyréotropes et corticotropes le long de la région dorsale avec une prolifération significativement réduite [Norlin et al., 2000]. Des souris transgéniques, qui surexpriment Fgf8 sous le contrôle de l’élément régulateur α-GSU, ont également montré une augmentation des cellules en position dorsale (corticotropes et mélanotropes) alors que les cellules en position ventrale (somatotropes, lactotropes et thyréotropes) ne se développent pas [Treier et al., 1998, 2001]. A e10,5, un autre membre de la famille BMP, Bmp2, s’exprime dans la zone de l’ectoderme ventral qui n’exprime pas Shh. Les souris Bmp2-/- présentent un nanisme et une antéhypophyse hypoplasique. L’expression de Bmp2 n’est plus détectable à e15,5-e16,5 lorsque les cellules dépendantes de Pou1f1 sont différenciées. Au contraire, le maintien de l’expression de Bmp2 sous le contrôle du promoteur α-Gsu résulte en une glande hyperplasique avec absence des marqueurs de différenciation Gh, Prl et Tshβ. Seules les cellules exprimant l’ACTH semblent normales. L’atténuation de l’expression de Bmp2 semble donc nécessaire à la différenciation des cellules somatotropes, lactotropes et thyréotropes [Treier et al., 1998]. L’action de ces différentes molécules diffusibles de signalisation qui agissent selon un gradient spatio-temporel précis est nécessaire au développement correct de l’antéhypophyse (Figure 3). Néanmoins, ils ne sont pas suffisants et de nombreux facteurs de transcription sont également impliqués dans le développement pituitaire.

Facteurs de transcription nécessaires au développement antéhypophysaire et pathologies humaines 

Des modèles murins mutés spontanément (souris Ames, Snell Jackson) ou invalidées génétiquement par recombinaison homologue ont permis d’évaluer l’importance fonctionnelle des gènes intervenant au cours du développement. Hesx1, Lhx2, Lhx3, Lhx4, Pitx1, Pitx2, T-Pit, Six3, Pax6, Gata2, Otx2, Sox2, Sox3, Prop1 et Pou1f1 sont des gènes codant pour des facteurs de transcription à domaine « homéo » exprimés à différents stades du développement. Ils agissent sur l’ADN et/ou d’autres protéines afin de réguler par activation ou par inhibition la transcription de leurs gènes cibles. Les analyses histologiques par hybridation in situ et immunohistochimiques ont permis l’identification du profil d’expression spatiotemporel de chacun de ces gènes. Certains de ces facteurs de transcription sont regroupés en famille en fonction de la séquence de l’homéodomaine (HD) ou des domaines associés :
– les facteurs de transcription à domaine HD-PAIRED (Prop1, Hesx1, Pitx1, Pitx2, Otx2, Pax6)
– les facteurs de transcription à domaine HD-POU (Pou1f1)
– les facteurs de transcription à domaine HD-HMG (Sox2, Sox3)
– les facteurs de transcription à domaine LIM (Lhx2, Lhx3, Lhx4)
– les facteurs de transcription à domaine SIX (Six3).

Table des matières

INTRODUCTION
1. CONTROLE GENETIQUE DU DEVELOPPEMENT ANTEHYPOPHYSAIRE ET PATHOLOGIE HUMAINE
1.1. Signalisation au cours de l’organogenèse antéhypophysaire
1.2. Facteurs de transcription nécessaires au développement antéhypophysaire et pathologies humaines
1.2.1. OTX2
1.2.2. SOX2 – SOX3
1.2.3. SIX
1.2.4. GLI
1.2.5. PITX1 – PITX2
1.2.6. HESX1
1.2.7. Protéines LIM
1.2.8. PROP1
1.2.9. POU1F1
2. IMPLICATION DES GENES DE L’AXE SOMATOTROPE EN PATHOLOGIE
2.1. GHRHR
2.2. GHSR
2.3. GH
2.4. Facteurs de transcription et IGHD
3. REGULATION DE L’EXPRESSION DU GENE GH HUMAIN
3.1. L’hormone de croissance
3.2. Interactions fonctionnelles impliquant POU1F1
OBJECTIFS
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. ANALYSE GENETIQUE
1.1 SIX6
1.2. LHX2
1.3 POU1F1 et LCR GH
2. RECHERCHE DE PARTENAIRES DE POU1F1
2.1 Synthèse des cibles ADN
2.2 Protéines recombinantes
2.3 Construction des plasmides – Mutagénèse dirigée
2.4 Production de la protéine recombinante
2.5 Purification des protéines recombinantes
2.6 Concentration des protéines et dialyse
2.7 Electrophorèse et western blot
2.8 Préparation des extraits nucléaires
2.9 BIAcore
2.10 Spectrométrie de masse
3. CRISTALLOGRAPHIE
3.1 Clonage du TAD de POU1F1
3.2 Expression du TAD de POU1F1
3.3 Purification du TAD de POU1F1
3.4 Cristallisation
RESULTATS
1. ANALYSE DE GENES CANDIDATS POUR LES MALADIES DE LA CROISSANCE
1.1 Recherche de mutations du gène SIX6
1.2 Recherche de mutations du gène LHX2
ARTICLE 1 : SCREENING OF LHX2 IN PATIENTS PRESENTING GROWTH RETARDATION WITH POSTERIOR PITUITARY AND OCULAR ABNORMALITIES
1.3 Recherche de mutations du gène LHX3
ARTICLE 2 : SYMPTOMATIC HETEROZYGOTES AND PRENATAL DIAGNOSES IN A NON-CONSANGUINEOUS FAMILY WITH SYNDROMIC COMBINED PITUITARY HORMONE DEFICIENCY RESULTING FROM TWO NOVEL LHX3 MUTATIONS
2. RECHERCHE DE PARTENAIRES DE POU1F1 AU LOCUS GH HUMAIN
2.1 Recherche d’anomalies moléculaires de POU1F1 et du LCR GH chez des patients présentant un IGHD
2.2 Recherche de partenaires de POU1F1
2.2.1 Stratégie
2.2.2 Résultats
Production et purification des protéines POU1F1
Etude d’interaction de POU1F1 sur les séquences d’ADN cibles
Interaction ADN-protéines
Cinétique
Recherche de partenaires de POU1F1
Mise au point et validation de l’approche « Recovery »
« Recovery » à partir d’extraits nucléaires
2.3 Etude de la structure tridimensionnelle du domaine de transactivation de POU1F1
DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE

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