Séparation et visualisation sur Séquenceur LICOR 4300 DNA Analyzer

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Généralités sur l’arachide

Classification botanique

L’arachide fait partie de la grande famille des légumineuses. Cette famille est divisée en trois (03) sous-familles : les Mimosoideae, les Caesalpinoideae et les Papilionoideae. C’est dans cette dernière sous-famille que l’on retrouve la plupart des légumineuses cultivées à haute importance économique. L’arachide appartient à la tribu des Aeschynomeneae, la sous-tribu des Stylosanthenae et au genre Arachis. Le genre Arachis comprend 80 espèces décrites qui ont été réparties en 9 sections en fonction de leur morphologie, de leurs caractéristiques chromosomiques et de leur compatibilité de croisement (Krapovickas et Gregory, 1994; Valls et Simpson, 2005). Les sections Arachis et Rhizomatosae sont composées d’espèces diploïdes (2n=2x=20, 2n=2x=18) et d’espèces tétraploïdes (2n=4x=40) (Smartt et Stalker, 1982) de génome A, B, AB et D.
L’arachide cultivée appartient à la section Arachis dans laquelle 29 espèces diploïdes et tétraploïdes ont été décrites.

Origine et distribution

L’arachide cultivée (Arachis hypogaea L.) est une plante originaire d’Amérique du Sud, autogame, allotétraploïde (2n=4x=40), issue d’un évènement relativement récent d’hybridation entre deux espèces diploïdes sauvages de génomes A et B suivi d’un doublement spontané des chromosomes. Elle a été introduite dans la plupart des pays tropicaux à partir du XVI siècle (Pattee et Thomas, 1995). La plante est extrêmement plastique; les températures optimales pour son développement se situent entre 20 et 35°C; mais sa croissance est inhibée en deçà de 10° et au-delà 45°C (Bockelee-Morvan A., 1974). L’arachide cultivée a été subdivisée en deux sous-espèces A. hypogaeas sp. Hypogaea et A. hypogaea sp. fastigiata.

Description de la plante

L’arachide possède une racine primaire pivotante qui s’enfonce verticalement dans le sol jusqu’à plus de 1 m de profondeur. Le système radiculaire ne comporte pas de poils absorbants mais présente des formations ligneuses contrairement à la partie aérienne. Les nodules à croissance déterminée (Bradyrhizobium), caractéristiques des légumineuses, apparaissent à l’aisselle des racines latérales une quinzaine de jours après la levée et se rencontrent surtout dans les 15 premiers centimètres du sol.
Elle a une tige principale toujours érigée et un nombre variable de ramification qui peuvent être ascendante ou courir sur une partie de leur longueur sur le sol pour les formes rampantes.
Les feuilles sont pennées et possèdent 4 folioles de forme ovales, opposées par paire et de couleur vert-foncée chez les variétés tardives et, en général, verte plus claire, pour les variétés hâtives. L’arachide possède 2 catégories de fleurs (aériennes et souterraines). Les fleurs aériennes sont en général de couleur jaune d’or avec souvent des stries rosées à la base de l’étendard. La fécondation est en général autogame. Les Fleurs souterraines, elles, apparaissent au début de la floraison aérienne. Elles sont cléistogammes, c’est-à-dire qu’elles ne s’ouvrent pas et que l’autofécondation est par conséquent rigoureusement assurée (Cattan P., 1996).
L’autogamie est le mode normal de reproduction de cette plante. Mais le taux d’allogamie de l’arachide n’est pas pour autant nul et peut varier entre 0,2 et 6,6 % selon les types botaniques, les variétés, les localités et les insectes pollinisateurs présents (Nigam et al., 1983). Les fruits sont des gousses ovoïdes ou cylindriques longues de 1 à 8 cm et large de 0,5 à 2 cm. Elles comprennent une coque et des graines.

Importance de l’arachide

L’arachide est cultivée sur tous les continents, dans les zones tropicales et subtropicales avec une production totale de 41,2 millions de tonnes sur une superficie de 24,7 millions d’hectares (FAO, 2012). C’est une culture très importante au Sénégal tant du point de vue économique que du point de vue alimentaire. Elle occupe 50 % des superficies cultivées (Tossim, 2011). La production arachidière donne lieu à une intense activité de transformation industrielle pour la fabrication d’huile destinée à la consommation et de tourteau utilisé comme aliment de bétail. L’arachide est également une culture vivrière et, à ce titre, elle intervient pour une large part dans la couverture des besoins alimentaires des populations. Ses fanes constituent un excellent fourrage pour le bétail. Du point de vue alimentaire, l’arachide est un protéagineux possédant une valeur énergétique et nutritionnelle importante. Selon Schilling (1996), la teneur de l’huile d’arachide en certains acides gras est très proche des recommandations actuelles de la FAO (Tableau 1).
Elle présente la composition suivante pour 100g de graine: Hydrate de carbone 11 à 27 g, Matières grasses 41 à 52 g, Protéines 21 à 30 g. Elle est aussi riche en Calcium, Niacine, Potassium, Phosphore, Magnésium, Vitamine E.
Cependant, la production arachidière est très fortement fluctuante et dépend de paramètres externes au secteur. Les variations erratiques de rendement observées proviennent de trois facteurs essentiels : la faible productivité par actif rural et par surface cultivée avec des rendements qui baissent de 4% par an, l’extrême instabilité des cours mondiaux et la forte dépendance vis-à-vis des conditions climatiques. Cette dernière contrainte paraît très importante notamment dans le contexte de réchauffement climatique qui secoue actuellement tous les pays. Il s’avère donc important de construire un matériel végétal plus résistant avec des caractères agronomiques améliorés. L’un des moyens efficaces et très adoptés dans les approches de sélection des cultures consiste à exploiter la diversité génétique au sein de l’espèce pour faire face aux diverses contraintes liées à leurs productions.

Marqueurs moléculaires et diversité génétique au sein de l’arachide cultivée

Pour toutes les ressources génomiques, les marqueurs moléculaires ont une utilisation prépondérante pour la caractérisation du matériel génétique, la cartographie des gènes et la sélection assistée par marqueurs. Plusieurs types de marqueurs ont été développés pendant les trois dernières décennies : le RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), le RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), l’AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), le SSR (Simple Sequence Repeat), le SNP (Single Nucleotide Polymorphism) etc.
Les marqueurs microsatellites ou SSR se définissent comme des séquences d’ADN composées de motifs répétés en tandem n fois. Ces motifs sont généralement composés de 2 à 6 nucléotides ex: [(CG)n, (CAGC)n, etc…]. Les marqueurs SSR ont un pouvoir de discrimination élevé, ce qui fait d’eux de bons candidats pour le marquage génétique (Ouédraogo et al., 2006). Ils sont reproductibles, multi-alléliques, à caractère co-dominant et d’usage facile (Pandey et al., 2012). Les marqueurs SNP quant à eux, sont plus adaptés aux approches de génotypage de haut-débit. Leur développement et les applications dans les espèces cultivées deviennent de plus en plus courant même si leur utilisation est difficile dans les laboratoires à faible niveau de technologies.
Dans le cas de l’arachide, les marqueurs RFLP, RAPD et AFLP ont d’abord été utilisés pour des analyses de diversité génétique (Hilu et Stalker 1995; Kochert et al., 1996; Subramaniyan et al., 2000; Dwivedi et al., 2001; He et Prakash 2001; Herselman 2003; Bravo et al., 2006). Ces études ont révélé un très faible taux de polymorphisme entre les accessions cultivées étudiées. Cette faible diversité moléculaire a été expliquée par l’origine monophylétique récente de l’espèce tétraploïde cultivée (Kochert et al., 1996) et par la domestication qui s’en est suivie (Burow et al., 2001). Singh et al. (1998) ont expliqué le faible polymorphisme observé dans le compartiment cultivé par l’inadéquation du matériel génétique utilisé dans les différentes études et ont préconisé l’utilisation d’une méthode d’échantillonnage plus rigoureuse et l’utilisation de marqueurs de type SSR ou AFLP.
Tang et al. (2007) ont conduit une étude de diversité génétique au sein de l’arachide cultivée en se basant sur 34 marqueurs SSR à partir des accessions issues des quatre (4) variétés botaniques de l’arachide cultivée. Ils ont conclu qu’il y avait un polymorphisme intra-variété abondant, et qu’avec plus de marqueurs SSR, la diversité génétique intrinsèque serait mieux détectée. Durant la décennie passée, de grands efforts ont donc été consentis pour le développement de marqueurs SSR et plus de 6000 marqueurs SSR dont certains hautement informatifs ont été générés (Pandey et al., 2012). On prévoit que cette avancée notable accélèrera les études génétiques et de sélection plus fines sur l’arachide cultivée.
La diversité génétique des plantes cultivées offre aux agriculteurs et aux sélectionneurs les ressources nécessaires pour sélectionner des cultures adaptées aux conditions écologiques et aux traditions culturelles. En l’absence de diversité, des options en matière de durabilité sont compromises. Pour augmenter la diversité génétique, diverses approches ont été utilisées. Dans ce sens, la mutagenèse artificielle a été appliquée avec un certain succès chez quelques espèces, mais son impact sur l’amélioration variétale est resté marginal. L’une des stratégies utilisées pour résoudre ce problème d’insuffisance de variabilité consiste à exploiter les ressources génétiques des espèces sauvages apparentées.
En effet, les espèces sauvages apparentées de l’arachide ont développé au cours de leur évolution des capacités d’adaptation leur permettant de croître et de se reproduire dans des environnements contraints et variables. Elles représentent donc un important réservoir d’allèles intéressants qui peuvent être utilisés en sélection pour l’amélioration de caractères simples tels que la résistance aux maladies mais aussi de caractères plus complexes tels que l’adaptation au déficit hydrique et l’amélioration de la productivité (Fonceka et al., 2009).
En effet, plusieurs études ont montré une forte diversité génétique au sein des espèces sauvages d’arachide (Moretzsohn et al., 2004; Nelson et al., 2006; Barkley et al., 2007; Khera et al.,2013). Ainsi en se basant sur la disponibilité des marqueurs moléculaires notamment les marqueurs SSR, il est possible d’élargir la base génétique de l’arachide cultivée par introgression des segments génomiques des espèces sauvages.
Pour ce faire, la construction de cartes génétiques constitue un préalable pour faciliter l’analyse des QTL et pour développer des outils pour une meilleure Sélection Assistée par Marqueurs.

Carte génétique et Cartographie de QTL par l’analyse de populations biparentales

Les cartes génétiques de liaison consistent à ordonner les marqueurs moléculaires le long du génome et nécessitent un nombre important de marqueurs pour une bonne couverture du génome. Elles représentent une base qui permet l’identification et la localisation de QTLs (Quantitative Trait Loci) pour des caractères d’intérêt, comme la croissance ou la résistance à une maladie, avec l’objectif d’implémenter une amélioration génétique par sélection assistée par marqueur (MAS). Elle est basée sur l’analyse statistique de la ségrégation des marqueurs dans la descendance d’un croisement biparental. Les marqueurs doivent donc être polymorphes. Les distances se mesurent en centiMorgans (cM).
L’établissement d’une carte génétique nécessite la création d’une descendance en ségrégation issue d’un croisement par reproduction sexuée, ainsi que la caractérisation moléculaire des individus de la descendance.
La réalisation d’une carte génétique est basée sur le déséquilibre de liaison entre deux locus dans une population en ségrégation. En effet le taux de recombinaison observé entre 2 locus représente la distance qui les sépare. Il est possible de regrouper et d’ordonner l’ensemble des marqueurs moléculaires en calculant les distances qui les séparent deux à deux. Il existe deux formules pour calculer les distances génétiques à partir des taux de recombinaisons, celle d’Haldane (Haldane, 1919) et celle de Kosambi (Kosambi, 1944); ce dernier prend en compte les phénomènes de crossing-over multiples. Le choix d’un type de descendance dépend essentiellement des contraintes biologiques de l’espèce (F2, Lignée recombinantes, haploïdes doublées et le backcross).
Le backcross est en réalité une méthode d’amélioration génétique qui a pour but d’introduire un (ou plusieurs) gène(s) (appelés gènes cibles) dans un fond génétique particulier. C’est pourquoi le backcross est également appelé introgression de gène. Le principe du backcross est de croiser un parent donneur du gène cible avec un parent receveur de ce gène. L’hybride ainsi produit est recroisé avec le parent receveur pour produire une population en ségrégation nommée backcross (Fig. 2).
A partir des cartes génétiques, il est possible de positionner les gènes d’intérêt (par exemple les gènes de résistance à une maladie) par simple analyse de la co-ségrégation entre les allèles aux marqueurs et des performances des plantes (résistantes / sensibles). Pour les caractères quantitatifs (comme le rendement ou la précocité de floraison par exemple) dont le déterminisme génétique complexe fait potentiellement intervenir un grand nombre de gènes (appelés QTL) à effet individuel faible, la détection de QTL consiste à rechercher, pour chacun des marqueurs de la carte, s’il existe une liaison statistique entre le génotype au marqueur et le caractère d’intérêt. La présence d’associations significatives entre un marqueur et un caractère permet de conclure qu’il existe à proximité de ce marqueur un ou plusieurs QTL intervenant dans la variation du caractère et d’estimer l’effet des allèles apportés par chacune des lignées parentales sur le caractère d’intérêt. En plus de l’analyse de l’association entre un marqueur et un caractère, il existe d’autres méthodes plus précises qui ont été développées dans les années 90. Ces méthodes appelées cartographie d’intervalle permettent d’estimer la position la plus probable des QTL dans les intervalles entre les marqueurs. Très rapidement, grâce au développement de la technologie des marqueurs moléculaires, de très nombreuses cartes génétiques et des expériences de détection de QTL ont été réalisées dans la plupart des espèces d’intérêt agronomique : Sorgho (Rami et al., 1998; Tao et al., 1998; Bhattramakki et al., 2000 ; Hart et al., 2001 ; Bowers et al., 2003; Mace et al., 2009; Sukumaran et al., 2012 etc.) ; le Niébé (Menéndez et al., 1997; Ubi et al., 2000; Ouédraogo et al.,2002; Yap et al., 2003; Muchero et al., 2009 etc.). Sur une espèce comme le Maïs, en 2009 on pouvait recenser plus de 200 publications de cartographie génétique et de détection de QTL (Manicacci et al., 2009).
L’arachide aussi a fait l’objet de nombreuses études de cartographie génétique et de détection de QTL (Halward et al., 1993; Burow et al., 2001; Garcia et al., 1996; Liang et al., 2009a; Selvaraj et al., 2009; Fonceka et al., 2012; Varshney et al., 2009c; Ravi et al., 2011; Gautami et al., 2011; Bertioli et al., 2014 etc.).

Choix du logiciel de cartographie

Les analyses de liaison ont suscité le développement de nombreux logiciels de cartographie génétique. Une revue non exhaustive est disponible sur le site internet suivant : http://linkage.rockefeller.edu/soft/. La plupart de ces logiciels utilisent les mêmes statistiques de base pour le test de liaison entre marqueurs. Leurs principales différences résident dans le type de populations et de croisements (Backcross, F2, etc…), leur plateforme de fonctionnement et interface (Windows, Unix), le codage des données et les options qu’ils proposent (analyse multipoint, recherche d’erreurs dans le jeu de données, modules de représentation graphique des cartes, etc…). Quatre logiciels sont plus couramment utilisés : Crimap (Lander et al., 1987), Mapmaker (Lander et al., 1987), JoinMap (Stam, 1993) et Carthagene (Schiex et al., 1997).

Cartes génétiques sur l’arachide

L’arachide est une allotétraploïde (2n=4x=40) avec un grand génome de 2800 Mb/1C. Les  premières constructions de cartes génétiques chez l’arachide ont été initiées en 1993. Elles ont été développées à partir des populations issues de croisements interspécifiques. Par exemple, une population F2 (87 lignées) issue du croisement A. stenosperma × A. cardenasii avait été utilisée pour développer une carte génétique avec 117 locus RFLP cartographiés dans11 groupes de liaison pour une couverture du génome de 1,063 cM (Halward et al., 1993). Plus tard, une population en backcross (78 lignées BC1F1) issue du croisement Tx AG-6, une espèce amphidiploïde synthétique ([A. batizocoi × (A. cardensii × A. diogoi)] 4x) et Florunner a été utilisée pour développer une carte génétique avec 370 locus RFLP répartis dans 23 groupes de liaison pour une couverture du génome de 2,210 cM (Burow et al., 2001).
Depuis 2005, avec le développement des marqueurs SSR, la construction de cartes génétiques de plus en plus saturées a considérablement augmenté (Pandey et al., 2012). Plusieurs cartes ont été construites sur des populations en génération F2, obtenues à partir des croisements entre des espèces diploïdes de génome AA (Moretzsohn et al., 2005; Leal-Bertioli et al., 2009; Nagy et al., 2010a); des espèces diploïdes de génome BB (Gobbi et al., 2006; Moretzsohn et al., 2009).
Dans le compartiment cultivé de l’arachide, avec la faible diversité existante, ce n’est que récemment que les premières cartes génétiques ont été construites. Varshney et al. (2009c) ont développé une carte génétique à l’aide de marqueurs SSR sur une population RIL issue du croisement TAG 24 × ICGV 8603. Cette carte a été mieux saturée plus tard par Ravi et al. (2011) et la nouvelle carte présentait 191 locus SSR répartis dans 20 groupes de liaison avec une couverture du génome de 1,785 cM. Par la suite, plusieurs autres cartes ont été construites sur l’arachide cultivée à l’aide des marqueurs SSR (Tableau 2).
Certaines cartes génétiques ont été élaborées sur des populations interspécifiques issues des croisements entre des variétés cultivées d’arachide et des espèces tétraploïdes synthétiques obtenues à partir de variétés sauvages. C’est le cas de Fonceka et al. (2009) qui ont construit une carte génétique sur une population de 88 BC1F1 issue du croisement A. hypogea cv FLEUR11× (A. ipäensis× A. duranensis)4x avec 298 marqueurs SSR. L’objectif poursuivi étant d’élargir la base génétique de l’arachide cultivée par introgression des segments génomiques de l’espèce sauvage.
Encore plus récemment, avec le développement des marqueurs SNP, les cartes génétiques sur l’arachide associant les marqueurs SSR et SNP ont été élaborées (Nagy et al., 2012).
Bertioli et al. (2014) ont développé une carte génétique entièrement construite à l’aide de 1536 marqueurs SNP avec deux populations RIL, l’une diploïde (A. duranensis x A. stenosperma) et l’autre tétraploïde [A. hypogaea cv. Runner IAC 886 x tétraploïde synthétique (A. ipaënsis x A. duranensis) 4x].
La densité en marqueurs des cartes génétiques construites à partir de croisement en tétraploïdes était jusque présent limitée. Ceci est principalement lié à l’insuffisance des marqueurs cartographiés et la grande taille du génome de l’arachide (2800 Mb/1C). Dans l’objectif de disposer de cartes avec des densités importantes, des cartes consensus ont été élaborées à partir de plusieurs cartes déjà établies sur différentes populations (Gautami et al., 2012; Shirasawa et al., 2013). L’objectif poursuivi est d’augmenter la résolution des cartes génétiques pour une large gamme d’applications génétiques.

Collecte et séchage du matériel

Au 21ème JAS, de jeunes feuilles ont été prélevées sur 150 plantes BC1. Elles ont été enveloppées dans du papier aluminium, placées sur de la glace puis transférées au laboratoire. Elles ont été séchées pendant 72 heures à 40°C à l’étuve en laissant les feuilles d’aluminium ouvertes.

Extraction de l’ADN

L’ADN génomique a été extrait par la méthode d’extraction au MATAB (Mixed Alkyl Trimethyl Ammonium Bromide).

Procédure de la technique d’extraction au MATAB

Pour chaque échantillon environ 20mg du matériel sec ont été introduits dans des tubes Eppendorf de 2µl avec 2 à 3 billes d’acier de 5mm. Les tubes ont été placés dans un vibro-broyeur RETSCH. Les feuilles séchées ont été broyées pendant 1min30s à 30 pulsations par seconde.
Un volume de 750µl de tampon MATAB préalablement préchauffé à 65°C au bain-marie a été ajouté au broyat. Le mélange obtenu a été homogénéisé au vortex et les tubes ont été incubés dans un bain-marie (65°C) pendant 20min avec agitation toutes les 5min. Cette étape permet la lyse de la membrane nucléaire et la libération de l’ADN dans le tampon. Les échantillons ont été ensuite refroidis à température ambiante pendant 5min. Un volume de 750µl de Chloroforme IsoAmyl Alcool (CIAA, 24:1) a été rajouté au mélange. Le mélange a été ensuite homogénéisé par retournement 50 fois. Une centrifugation de 20min à 13000rpm s’en est suivie. Un volume de 600µl de surnageant a été transféré dans un nouveau tube 1,5µl et un volume égal d’Isopropanol y a été ajouté à froid. Le mélange a été agité doucement jusqu’à l’apparition de la pelote d’ADN qui précipite et le tube a été placé à -20°C pendant 2h. Les tubes ont été centrifugés à 13000rpm à 4°C pendant 20min. La pelote d’ADN s’est posée sur le fond du tube, le liquide a été vidé et la paroi du tube a été séchée avec du papier absorbant. Un volume de 500µl d’éthanol (70%) a été ajouté dans le tube et le mélange a été à nouveau centrifugé à 13000rpm à 4°C pendant 20min pour le rinçage de l’ADN. Ensuite, le liquide a été vidé et la pelote d’ADN a été séchée pendant au moins 1h à température ambiante. Le culot a été repris dans 500µl de TE 1X pendant une nuit à température ambiante.

Quantification de l’ADN

L’ADN extrait a été quantifié sur gel d’agarose à 0,5% par une estimation visuelle de la concentration en comparaison aux bandes d’un marqueur de poids moléculaire (Smart Ladder), de concentrations connues. Après coulage du gel, 2,5µl de Bromure d’Ethidium (BET 0,5mg/µl) ont été rajoutés. Le gel a été ensuite placé dans une cuve d’électrophorèse remplie de tampon Tris Borate EDTA (TBE) 0,5X. Les échantillons à déposer sur dans le gel ont été préparés par mélange de 2µL d’ADN, 2µl de Bleu de Bromophénol et 6µl d’eau pure. Cinq (5) µl de chaque échantillon ont été déposés dans chaque puits du gel de même que le Ladder. La migration a été réalisée à 100 Volts à température ambiante durant 30min à l’aide d’un générateur EPS 300 (Pharmacia Biotech).
L’ADN a été visualisé sous lumière U.V. et photographié à l’aide d’un appareil photographique.

PCR

Suite aux résultats de la quantification de l’ADN, deux (02) plaques de dilution d’ADN de concentration finale de 5ng/µl ont été réalisées par ajout d’eau distillée.
Cinq cent trente (530) marqueurs SSR ont été criblés pour leur polymorphisme sur les parents croisés. Deux cents (200) marqueurs SSR polymorphes ont été ensuite sélectionnés pour génotyper tous les individus de la population BC1.
Pour réaliser les PCR, un volume réactionnel de 25µL contenant de l’ADN: 25ng, du Buffer: 1x, de dNTPs: 200µM, chaque amorce: 0,1µM, IrDye : 0,1µMµmol, de Taq polymérase: 1U et de l’eau pure, a été utilisé. La PCR a été réalisée en 35 cycles dans un thermocycleur (MWG AG Biotech). Cette dernière a été programmée de la façon suivante. Une pré-dénaturation de 94°C a été observée pendant 4min. Elle a été suivie de 10 cycles dont chacun comprend: une dénaturation (94°C pendant 45s), une hybridation (60°C pendant 1min; et une diminution de 0,5°C par cycle) ; une amplification (72°C pendant 1min 15s). Une série de 25 cycles dont chacun comprend : une dénaturation (94°C pendant 45s); une hybridation (55°C pendant 1min); une amplification (72°C pendant 1min 15s). Enfin, une élongation finale de 5min à 72°C a été observée.

Multiplexage

Les marqueurs microsatellites donnent des produits d’amplification de tailles différentes. Par ailleurs, le CERAAS dispose d’amorces marquées l’IRdye 682 (fluorescence rouge) et l’IRdye 782 (fluorescence verte). Pour optimiser les manipulations, plusieurs marqueurs ont été donc multiplexés en se basant sur leur différence de taille et sur les fluorochromes utilisés. Ainsi, jusqu’à quatre marqueurs ont été déposés sur un même gel: 2 marqueurs de tailles différentes en IRdye 682 et 2 autres marqueurs de tailles différentes en IRdye 782.

Séparation et visualisation sur Séquenceur LICOR 4300 DNA Analyzer

Les fragments d’ADN amplifiés ont été ensuite séparés sur un séquenceur LICOR 4300. L’avantage du séquenceur LICOR est sa haute résolution car il permet de séparer des bandes qui diffèrent d’une paire de base. Pour un échantillon donné, les produits PCR des 4 marqueurs multiplexés ont été déposés simultanément dans chaque puits. Pour ce faire, 2µl de fragments d’ADN amplifiés ont été prélevés dans les puits de chaque plaque PCR et mélangés dans les puits d’une plaque de multiplexage. Douze (12) µl de bleu-urée ont été ajoutés. Ensuite, la plaque de multiplexage a été mise dans un Thermocycleur MWG AG Biotech Primus 96 pour une dénaturation de l’ADN à 94°C pendant 3 min. Après dénaturation, 2µl d’ADN dénaturé ont été déposés dans de petits puits d’une plaque de dépôt posée sur un bac contenant de la glace afin d’empêcher la renaturation des bandes d’ADN. Un marqueur de taille (1,5µl) a été déposé aux deux extrémités de la plaque de dépôt. La migration a été réalisée dans un gel de polyacrylamide 6,5% jusqu’à l’apparition des bandes fluorescentes détectées à l’aide d’une caméra infrarouge. Les images sont nommées et enregistrées automatiquement.

Lecture des gels

Les images des profils de migration ont été traitées avec le logiciel XnView 2.13. La lecture des gels a été réalisée à l’aide de l’application Jelly 0.1 (Rami, non publié). Toutes les images ont été importées dans l’application Jelly. Etant donné qu’il s’agit d’une population en backcross1, les génotypes attendus sont (i) les homozygotes parent récurrent à une proportion de ½ et (ii) les hétérozygotes récurrent/donneur à une proportion équivalente (½). Pour la lecture, à un locus donné, la lettre « a » a été attribuée pour les homozygotes et la lettre « h » pour les hétérozygotes. Les données manquantes ont été matérialisées par la lettre « x ». Un individu homozygote à un marqueur est celui qui présente uniquement les bandes issues du parent cultivé FLEUR11. Un individu hétérozygote est celui qui présente à la fois les bandes issues du parent cultivé et du parent sauvage ISATGR 52B. La matrice ainsi obtenue a été exportée vers un Tableur Excel.

Table des matières

INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Généralités sur l’arachide
1.1. Classification botanique
1.2. Origine et distribution
1.3. Description de la plante
2. Importance de l’arachide
3. Marqueurs moléculaires et diversité génétique au sein de l’arachide cultivée
4. Carte génétique et Cartographie de QTL par l’analyse de populations biparentales
5. Choix du logiciel de cartographie
6. Cartes génétiques sur l’arachide
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel végétal
2. Méthodes
2.1 Culture des plantes
2.2 Collecte et séchage du matériel
2.3 Extraction de l’ADN
2.3.1 Procédure de la technique d’extraction au MATAB
2.3.2 Quantification de l’ADN
2.4 PCR
2.5 Multiplexage
2.6 Séparation et visualisation sur Séquenceur LICOR 4300 DNA Analyzer
2.7 Lecture des gels
2.8 Construction de la carte
RESULTATS
1. Polymorphisme des marqueurs utilisés
2. Carte génétique
3. Comparaison de la carte établie avec la carte consensus de Gautami et al. (2012)
DISCUSSION
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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