Séparation du protéome des DRM par électrophorèse SDS-PAGE

Séparation du protéome des DRM par électrophorèse SDS-PAGE

Préparation de membranes

Les cellules sont récupérées dans du PBS à 4°C, congelées à -70°C pendant 1 hr,décongelées et homogénéisées au Potter Elvehjem dans du Tris-HCl 50 mM pH 7.4. Le culot nucléaire est éliminé après centrifugation à 1,000 g pendant 10 min, et la fraction membranaire totale (TM) est collectée par centrifugation à 100,000 g pendant 35 min.La concentration en protéines est déterminée par la méthode de Lowry (Lowry et al.,1951), avec l’albumine bovine comme standard. Brièvement, 1 ml de réactif (Na2CO3, NaOH 0,1 N contenant 1% (v:v) de CuSO4 1% et 1% (v:v) de tartrate double Na+, K+ 2%) est ajouté à 100 µl d’échantillon à doser. Après une première incubation de 30 min à température ambiante, 100 µl de folin (Sigma) dilué deux fois dans l’eau sont additionnés aux échantillons à doser et après une seconde incubation dans les mêmes conditions, la DO est mesurée à 650 nm (Lambda16 Perkin Elmer).

Mesures de liaison aux récepteurs opioïdes

Les sites de liaison opioïdes de la fraction TM des cellules SH-SY5Y sont quantifiés à l’aide d’[3H]diprénorphine (50 Ci/mmol; NEN Life Science Products). Les membranes (10-60 µg de protéines) sont incubées pendant 1 hr à 25°C avec des concentrations croissantes de ligand tritié dans 0.5 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7.4. La liaison non-spécifique est déterminée en présence d’1 µM de diprénorphine non marquée. Le ligand lié est collecté par filtration sur filtres de fibre de verre (GF/B; Whatman) et la radioactivité comptée sur un compteur à scintillation liquide Packard modèle 2100TR. Les données sont analysées à l’aide du logiciel Prism (GraphPad Software).

Mesure de l’activité de l’adénylyl cyclase

L’activité de l’adénylyl cyclase est mesurée en quantifiant l’AMPc accumulé dans les cellules suite à un traitement. La méthode repose sur l’incorporation d’adénine tritiée dans le pool d’ATP intracellulaire puis la séparation de l’AMPc tritié sur colonne d’alumine (Alvarez et Daniels, 1992). L’accumulation d’AMPc est stimulée par la forskoline en présence des agents à tester et d’inhibiteurs de phosphodiestérases.Des plaques de culture de 24 puits sont ensemencées la veille de l’expérience à raison de 200 000 cellules par puits dans 500 µl de milieu de culture. Le lendemain celui-ci est remplacé par 500 µl de milieu frais contenant les différents agents, morphine sulfate (Francopia), naloxone, MG115 (Sigma), lactacystine (Sigma) aux concentrations appropriées.Après incubation le temps désiré, le milieu de culture est à nouveau éliminé et remplacé par 200 µl de milieu frais contenant les agents à tester, 0,1 µM d’adénine froide et 1 µCi d’adénine tritiée (Amersham) pendant 1h à 37°C. Les cellules sont alors rincées 4 fois avec 500 µl / puits de tampon Krebs-Ringer-HEPES (KRH : KCl 5 mM, NaCl 125 mM, CaCl2 1,5 mM, MgSO4 1,25 mM, KH2PO4 1,25 mM, Glucose 8 mM, Hepes 25 mM pH 7,7 et BSA 0,05%) à 37°C. L’activité de l’adénylyl cyclase est stimulée pendant 10 min à 37°C par 5 µM de forskoline (Sigma) dans 200 µl de KRH contenant les inhibiteurs de phosphodiestérases : isobutylméthylxanthine (IBMX) (Sigma) et RO 20-1724 (BIOMOL Research Laboratories) à 1 µM. Après les 10 min de stimulation, la réaction est arrêtée par 30 µl de HCl à 2,2 N provoquant la lyse des cellules et donc la libération de leur contenu. Les surnageants sont ensuite déposés sur colonnes contenant chacune 0,65 g d’alumine acide sèche (Sigma). Les colonnes sont lavées avec 4 ml de HCl à 5 mM, puis avec 500 µl d’acétate d’ammonium 0,1 M. L’AMPc retenu sur la colonne est élué par 3 ml d’acétate d’ammonium à 0,1 M et récupéré dans des fioles à scintillation. Après ajout de 7,5 ml de liquide à scintillation (Ready ProteinTM Beckman Coulter), la quantité d’AMPc tritié éluée est mesurée par un compteur à scintillation liquide (Packard liquid scintillation analyser Tri-CARB 2100-TR) pendant 3 min. Chaque expérience est faite en triplet et répétée au moins trois fois. Les données sont analysées à l’aide du logiciel Prism (GraphPad Software).

Table des matières

INTRODUCTION
MATERIEL ET METHODES
I. Culture cellulaire et traitements
II. Préparation de membranes
III. Mesures de liaison aux récepteurs opioïdes
IV. Mesure de l’activité de l’adénylyl cyclase
V. Préparation des extraits cellulaires totaux pour l’électrophorèse bidimensionnelle15
V.1. Solubilisation des protéines
V.2. Précipitation des protéines au méthanol / chloroforme
V.3. Réduction et alkylation des protéines
VI. Séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle
VI.1. Isoélectrofocalisation
VI.2. Electrophorèse SDS-PAGE
VII. Coloration au bleu de Coomassie colloïdal
VIII. Analyse d’image par le logiciel Image Master 2D Platinium
IX. Préparation des fractions DRM
X. Séparation du protéome des DRM par électrophorèse SDS-PAGE
XI. Analyse d’image par le logiciel Quantity One
XII. Western blot
XIII. Identification des protéines par spectrométrie de masse
XIII.1. Excision et lavage des protéines d’intérêt
XIII.2. Réduction et alkylation des bandes 1D
XIII.3. Digestion trypsique
XIII.4. Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF
XIII.5. Extraction peptidique
XIII.6. Analyse par nanoLC-ESI-Q-TOF
RESULTATS
I. Etablissement de la lignée cellulaire
I.1. Effets aigus et chroniques de la morphine sur la production d’AMPc stimulée par la FSK dans les cellules SH-SY5Y sauvages et sur-exprimant le récepteur MOP
I.2. Cinétique, effet-dose et réversibilité de la sensibilisation de l’AC par la morphine
dans les cellules SH-SY5Y sc2
 ιι. Analyse différentielle du protéome total
III. Analyse du sous-protéome DRM/rafts
III.1. Identification des protéines sensibles à la morphine chronique
III.2. Corrélation entre les niveaux de Gβ ββ β et de sensibilisation de l’AC dans les cellules SH-SY5Y sc2
III.3. Effet de l’inhibition de l’activité du protéasome sur la down-régulation de Gβ ββ β et la sensibilisation de l’AC induites par la morphine dans les cellules SH-SY5Y sc2
DISCUSSION
REFERENCES

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