SELECTION ET AMELIORATION DES AGRUMES

MATERIELS ET METHODES

MATERIEL VEGETAL

Ce travail de thèse porte sur quatre génotypes, à savoir le mandarinier Willow leaf (Citrus deliciosa Ten.) et le citronnier Eureka (Citrus limon (L.) Burm.), ainsi que leur hybride somatique allotétraploïde [WLM + EUR 4x (Citrus deliciosa Ten.) + (Citrus limon (L.) Burm.)] et leur cybride diploïde [WLM + EUR 2x (Citrus deliciosa Ten.) + (Citrus limon (L.) Burm.)] obtenus par hybridation somatique (Ollitrault et al., 2000). Nous précisons que selon Tanaka (1961), le mandarinier cv « Willow leaf » est classé dans C. deliciosa, alors que selon Swingle et Reece (1967) il fait partie de C. reticulata qui regroupe l’ensemble des mandariniers. Ainsi, dans ce mémoire l’une ou l’autre classification a pu être utilisée. L’ensemble de ces variétés est greffé sur volkameriana (Citrus limonia Obs.) avec 3 répétitions par variétés et planté aléatoirement sur une parcelle homogène de la Station de Recherches Agronomiques Inra/Cirad de San Giuliano (Corse).

CARACTERISATION GENETIQUE DES HYBRIDES SOMATIQUES

Evaluation de la ploïdie

L’identification du niveau de ploïdie des différents génotypes étudiés dans le cadre de cette thèse est réalisée par cytométrie en flux et par comptage chromosomique.

Cytométrie en flux

Un échantillon de feuille est prélevé sur chaque plant afin d’évaluer son niveau de ploïdie à l’aide d’un cytomètre de type Partec PA-I. L’échantillon, additionné d’une portion de feuille d’un témoin interne triploïde, est haché à l’aide d’une lame de rasoir, en présence de 250 μL de tampon d’extraction (Partec, Cystain UV Précise P Nuclei Extraction Buffer), afin de libérer les noyaux. La solution obtenue est filtrée à l’aide d’un filtre Partec de 30μm et le filtrat recueilli dans un tube de 10 ml. A la suspension de noyaux ainsi obtenue sont additionnés 600 μL de tampon de coloration, contenant du DAPI (Partec, Cystain UV Précise P Staining Buffer). Ce fluorochrome se fixe spécifiquement à l’ADN. L’intensité de la fluorescence réémise par les noyaux sous excitation UV (365 nm) est proportionnelle à la quantité d’ADN. Les résultats obtenus pour plusieurs milliers de noyaux analysés individuellement lors de leur passage dans le cytomètre en flux sont retranscrit sur un histogramme. La position, sur l’axe des abscisses, des pics obtenus, est proportionnelle à la quantité d’ADN et donc à la ploïdie.

Comptage chromosomique

Le comptage de chromosomes est réalisé à partir de très jeunes feuilles en croissance. Les feuilles récoltées sont traitées avec une solution à 0,04% d’hydroxyquinoline pendant 4 h à température ambiante, puis 4 h à 4°C. Les feuilles sont ensuite fixées pendant 48 h dans un mélange éthanol/acide acétique (3:1) et stockées dans 70% d’éthanol à 4°C. La préparation des lames pour le comptage chromosomique est effectuée tel que décrit par (D’Hont et al., 1996). Les chromosomes sont colorés avec du DAPI. L’observation des chromosomes se fait à l’aide d’un microscope Nikon 80i.

Caractérisation des génomes nucléaires et cytoplasmiques

Les hybrides somatiques ainsi que leurs parents sont étudiés à l’aide de marqueurs moléculaires, afin de déterminer l’origine de leurs génomes nucléaire, chloroplastique et mitochondrial.

Extraction d’ADN

L’ADN des plants est extrait à partir de 100 mg de feuille selon un protocole modifié, dérivé de la méthode décrite par Doyle et Doyle (Doyle J J, 1987). La portion de feuille est broyée en présence d’azote liquide et d’une pincée de sable de Fontainebleau. Le broyat mélangé à 500μL de tampon d’extraction [2% (p/v) MATAB, 1,4M NaCl, 0,2 M Tris-HCl pH=8, 50mM EDTA, 1% (p/v) PVP, 0.5% Bisulfite de Sodium (p/v)] est transvasé dans un tube eppendorf de 2 mL puis incubé pendant 20 min à 65°C. A température ambiante, 500 μL de chloroforme/alcool iso amylique (24/1 ; v/v) sont rajoutés au tube, puis le mélange est soumis à une agitation douce (agitateur rotatif) pendant 10 min. Après une centrifugation de 5 min à 8000 g, la phase aqueuse est transférée dans un nouveau tube eppendorf avec 2,5 x volume d’éthanol 96° froid, afin de précipiter l’ADN. Après une centrifugation de 5 min à 12000 g, le surnageant est éliminé et le culot d’ADN est séché avant de lui rajouter 50 μl d’eau déminéralisée stérile.

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Table des matières

I. INTRODUCTION
I.1. LE MONDE DES AGRUMES
I.1.1. Origine et dispersion
I.1.2. Importance Economique des agrumes
I.1.3. Taxonomie et Diversité
I.1.4. Système de reproduction
I.1.5. La ploïdie des agrumes
I.1.5.1. Mécanismes de formation des polyploïdes spontanés chez les agrumes
I.1.5.2. Caractéristiques morphologiques des autotétraploïdes d’agrumes
I.2. SELECTION ET AMELIORATION DES AGRUMES
I.2.1. Généralités
I.2.2. Amélioration des porte-greffes
I.2.3. Amélioration des variétés
I.3. L’HYBRIDATION SOMATIQUE CHEZ LES AGRUMES
I.3.1. Principe de l’hybridation somatique
I.3.1.1. La fusion chimique
I.3.1.2. L’électrofusion
I.3.2. Les produits de la fusion de protoplastes
I.3.2.1. Les hybrides somatiques allotétraploïdes
I.3.2.2. Les hybrides asymétriques aneuploïdes
I.3.2.3. Les cybrides
I.3.3. Caractérisation des hybrides somatiques
I.3.3.1. Caractérisation du génome nucléaire
I.3.3.2. Caractérisation du génome cytoplasmique
I.3.4.2. La création directe d’hybrides triploïdes
I.3.4.3. La création d’hybrides allotétraploïdes
I.4. DE NOUVELLES QUESTIONS DE RECHERCHES SUR LES DETERMINANTS DE LA VARIABILITE PHENOTYPIQUE
I.4.1. Les interactions nucléo-cytoplasmiques
I.4.1.1. Les interactions noyau-mitochondrie
I.4.1.2. Les interactions noyau-chloroplaste
I.4.1.3. L’expression phénotypique chez les cybrides d’agrumes
I.4.2. Allopolyploïdie et expression génomique et phénotypique
I.4.2.1. L’identification des plantes polyploïdes
I.4.2.2. Les modifications génétiques liées à la polyploïdisation
I.4.2.3. Les modifications épigénétiques liées à la polyploïdisation
I.4.2.4. Expression génomique et phénotypique chez les hybrides somatiques allotétraploïdes d’agrumes
I.5. LES DETERMINANTS DE LA QUALITE DU FRUIT
I.5.1. Les sucres et les acides organiques
I.5.1.1. Généralité sur les sucres et acides organiques de la pulpe des agrumes
I.5.1.2. Métabolisme des sucres et des acides organiques
I.5.2. Les caroténoïdes
I.5.2.1. Généralité sur les caroténoïdes
I.5.2.2. Métabolisme des caroténoïdes
I.5.3. Les arômes
I.5.3.1. Généralité sur les arômes des fruits des agrumes
I.5.3.2. Métabolisme des composés d’arôme
I.6. LES OBJECTIFS DE LA THESE
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIEL VEGETAL
II.2. CARACTERISATION GENETIQUE DES HYBRIDES SOMATIQUES
II.2.1. Evaluation de la ploïdie
II.2.1.1. Cytométrie en flux
II.2.1.2. Comptage chromosomique
II.2.2. Caractérisation des génomes nucléaires et cytoplasmiques
II.2.2.1. Extraction d’ADN
II.2.2.2. Amplification des ADN par PCR
II.2.2.3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
II.2.2.4. Marqueurs microsatellites nucléaires
II.2.2.5. Marqueurs mitochondriaux et chloroplastiques
II.3. CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE DES HYBRIDES
II.3.1. Description des feuilles
II.3.2. Description des fleurs
II.3.3. Description des fruits
II.4. EVALUATION DE LA QUALITE DES FRUITS
II.4.1. Sucres et acides organiques
II.4.1.1. Mesure de l’acidité titrable et de l’extrait sec soluble (° Brix)
II.4.1.2. Dosage des acides organiques et des sucres
II.4.2. Les caroténoïdes
II.4.2.1. Extraction des caroténoïdes
II.4.2.2. Dosage des caroténoïdes
II.5. ETUDE DU TRANSCRIPTOME
II.5.1. Extraction et quantification des ARN totaux
II.5.2. Amplification et quantification des ARNm par PCR en temps réel
II.5.3. Analyses Microarrays
II.5.3.1. Amplification et marquage des ARNa
II.5.3.2. Hybridation des lames microarray et acquisition des données
II.5.3.3. Analyse des données microarray
II.6. ANALYSES STATISTIQUES
III. RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. CARACTERISATION DES GENOMES NUCLEAIRES ET CYTOPLASMIQUES DES HYBRIDES SOMATIQUES
III.1.1. Introduction
III.1.2. Résultats
III.1.2.1. Evaluation du niveau de ploïdie par cytométrie en flux et comptage
chromosomique
III.1.2.2. Caractérisation du génome nucléaire
III.1.2.3. Caractérisation du génome mitochondrial
III.1.2.4. Caractérisation du génome chloroplastique
III.1.3. Discussion
III.2. DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE COMPAREE DU CYBRIDE ET DE SES PARENTS
III.2.1. Introduction
III.2.2. Résultats
III.2.2.1. Description des feuilles
III.2.2.2. Description des fleurs
III.2.2.3. Description des fruits
III.2.3. Discussion
III.3. INFLUENCE DE L’ORIGINE DES MITOCHONDRIES SUR LA QUALITE DES FRUITS CHEZ UN CYBRIDE D’AGRUMES
III.3.1. Résumé de l’article
III.3.2. Article
III.4. ANALYSE COMPARATIVE DU TRANSCRIPTOME DU CYBRIDE ET DU CITRONNIER
III.4.1. Introduction
III.4.2. Résultats
III.4.2.1. Différences transcriptionnelles entre le citronnier Eureka et WLM + EUR 2x
III.4.2.2. Classification fonctionnelle des gènes surexprimés chez le cybride
III.4.2.3. Classification fonctionnelle des gènes réprimés chez le cybride
III.4.3. Discussion
III.5. DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE COMPAREE DE L’HYBRIDE ALLOTETRAPLOÏDE ET DE SES PARENTS
III.5.1. Introduction
III.5.2. Résultats
III.5.2.1. Description des feuilles
III.5.2.2. Description des fleurs
III.5.2.3. Description des fruits
III.5.2.4. Classification hiérarchique
III.5.3. Discussion
III.6. TRANSMISSION DE CARACTERES IMPLIQUES DANS LA QUALITE DU FRUIT CHEZ UN HYBRIDE SOMATIQUE INTERSPECIFIQUE D’AGRUMES
III.6.1. Résumé de l’article
III.6.2. Article
III.7. LA COMPOSITION DES CAROTENOÏDES DE LA PULPE DE L’HYBRIDE ALLOTETRAPLOÏDE EST CORRELEE AVEC UNE EXPRESSION NON ADDITIVE DES GENES DE LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES CAROTENOÏDES
III.7.1. Résumé de l’article
III.7.2. Article
III.8. REGULATION NON ADDITIVE DE L’EXPRESSION DES GENES CHEZ L’HYBRIDE SOMATIQUE ALLOTETRAPLOÏDE
III.8.1. Résumé de l’article
III.8.2. Article
IV. DISCUSSION GENERALE, CONCLUSION ET PERSPECTIVES
IV.1. DISCUSSION GENERALE
IV.1.1. Impact du génome cytoplasmique sur la régulation du transcriptome et l’élaboration du phénotype
IV.1.1.1. La mitochondrie dans l’élaboration de la morphologie florale, foliaire et du fruit
IV.1.1.2. Les effets de la mitochondrie dans l’élaboration de la qualité des fruits
IV.1.1.3. Mitochondrie et régulation du génome nucléaire
IV.1.2. Expression du génome et élaboration du phénotype chez les allopolyploïdes d’agrumes
IV.1.2.1. Effets de l’allopolyploïdisation sur le phénotype: contribution inégale des parents à l’élaboration des caractères phénotypiques
IV.1.2.2. Une expression non additive du transcriptome concordante avec l’absence de codominance pour l’hérédité de nombreux caractères phénotypiques chez les allopolyploïdes
IV.2. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
IV.2.1. Effet de l’interaction génome nucléaire-génome mitochondrial sur l’élaboration du phénotype et l’expression génomique
IV.2.1.1. Influence de l’origine de la mitochondrie sur le phénotype
IV.2.1.2. Effet de la mitochondrie sur l’expression des gènes d’origine nucléaire
IV.2.2. Les perpectives pour l’amélioration des agrumes
IV.2.3. Effet de l’allopolyploïdisation sur l’élaboration du phénotype et l’expression génétique
IV.2.3.1. Elaboration du phénotype chez un allotétraploïde
IV.2.3.2. Expression du transcriptome chez un allotétraploïde
IV.2.4. Perspectives de l’allotétraploïdisation pour l’amélioration des agrumes
V. REFFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
VI. ANNEXES