Soutenance mémoire
Définition de la rhizosphère
La rhizosphère, décrite pour la première fois par Lorentz Hiltner en 1904, correspond au volume du sol adhérant aux racines caractérisé par des activités microbiennes intenses grâce aux composés organiques libérés par ces mêmes racines (Prescott et al., 2013 ; Kennedy, 2005). Elle représente une interface essentielle et active entre la plante et le sol par la présence de microorganismes dont le nombre et la diversité est fonction de l’effet rhizosphère. En effet, ce dernier définit tout changement physique, chimique ou biologique s’opérant directement ou indirectement au niveau de la rhizosphère du fait de la libération, par les plantes, d’un ensemble de composés aussi bien organiques qu’inorganiques (Duineveld et al., 1998, 2001 ; Badalucco et Kuikman, 2001 ; Baudoin et al., 2003). La rhizosphère se subdivise en trois parties dont l’endorhizosphère correspondant aux tissus corticaux des racines âgées (Dommergues et Mangenot, 1970), le rhizoplan qui est la surface même de la racine et constituant un milieu particulier pour les microorganismes (Prescott et al., 2013 ) et la rhizosphère éloignée qui est la fine couche de sol adhérant aux racines après avoir été secouées.
Les PGPR phytostimulatrices
Les PGPR phytostimulatrices influencent la croissance des plantes, en améliorant la biodisponibilité de certains nutriments, par exemple en fixant l’azote atmosphérique (Bloemberg et Lugtenberg, 2001) ou en solubilisant le phosphate (Richardson et al., 2009), en synthétisant des phytohormones comme des auxines, cytokinines, gibbérellines…etc (Steenhoudt et Vanderleyden, 2000 ; Vessey, 2003 ; Barea et al., 2005). L’expression de ces propriétés phytobénéfiques diffère selon l’espèce ou la variété de plante (Combes-Meynet, 2010 ; Remans et al., 2007) mais peut également avoir un effet contrasté selon le cultivar étudié. Cela a été observé dans le cas de la production d’acide indole acétique, une phytohormone de la classe des auxines, par une souche du genre Pseudomonas, dont l’effet sur la croissance racinaire était positif pour le cassis mais négatif pour le griottier (Dubeikovsky et al., 1993) suggérant de ce fait, qu’il existe un spectre d’hôte d’action chez les bactéries PGPR.
Le parasitisme
Le parasitisme met directement en jeu, deux microorganismes dont l’antagoniste reconnait spécifiquement sa cible et colonise ses organes entrainant ainsi sa destruction par sécrétion d’enzymes comme les protéases, les glucanases et les chitinases. En effet, du fait que la rhizosphère héberge une myriade et une diversité de microorganismes, elle constitue donc un milieu très favorable pour ce processus. Nombreux, sont les agents biologiques utilisant ce mode tels que certains actinomycètes qui produisent des chitinases et glucanases pour dégrader la paroi de Fusarium oxysporum (Sabaou et al., 1998 ; Schottel et al., 2001). Malgré l’usage de parasites en protection biologique, il existe des contraintes comme la nécessité d’un contact direct avec l’agent pathogène et la lenteur possible de la destruction de ce dernier (Fravel, 2005).
La brède mafane (Acmella oleracea)
C’est une plante herbacée annuelle de la famille des Asteraceae originaire de Brésil et se rencontre surtout dans les zones tropicale et subtropicale. Il s’agit d’une plante rameuse, touffue, rampante étalée à la base étant donné qu’elle s’enracine principalement au niveau des nœuds inférieurs. Les tiges et les branches sont cylindriques. Les feuilles opposées, sont simples, glabres, triangulaires et irrégulièrement crénelées ou dentées mais quelquefois entières. Le limbe mesure 2,5 à 5 cm de long, sur 1 à 4 cm de large et est pratiquement glabre sur les deux faces. De longs pédoncules axillaires ou terminaux portent des capitules solidaires constituant des inflorescences de couleur jaune.
Classification (Jansen, 1985)
Règne : Plantae
Classe : Equisetopsida
Ordre : Asterales
Famille : Asteraceae
Genre : Acmella
Espèce : oleracea (L.) R.K. Jansen
Nom vernaculaire : brède mafane, cresson de para, anamalaho
Les bactéries libres fixatrices d’azote
La réduction de l’azote atmosphérique en azote minéral assimilable est un processus biologique très important après la photosynthèse puisqu’elle rend cet élément atmosphérique disponible pour les plantes. Elle est cependant réalisée exclusivement par des procaryotes incluant plusieurs genres de bactéries tels que les Azotobacter, les Azospirillum, les cyanobactéries, et quelques espèces d’actinomycètes (Alexander, 1977 ; Ravikumar et al., 2007). L’isolement de ces bactéries libres fixatrices d’azote atmosphérique a été effectué sur milieu spécifique, le milieu Ashby’s mannitol agar, dans lequel le mannitol est la seule source de carbone (Subba, 1977) et dépourvu de source d’azote aussi bien organique que minérale. La composition du milieu est donnée dans l’annexe 2 et leur dénombrement a été effectué après 5 jours d’incubation à 28 °C dans une étuve bactériologique.
DISCUSSION
L’objectif de cette étude était d’isoler et de dénombrer différentes souches microbiennes issues des sols rhizosphériques de deux plantes maraîchères (malades et saines) aussi, de cribler les souches présentant des activités stimulatrices de la croissance de la plante (PGPR) ou antagonistes des phytopathogènes. L’expérimentation a été réalisée sur deux plantes maraichères différentes : le chou de Chine (Brassica chinensis) et la brède mafane (Acmella oleracea). Le nombre de bactéries des deux groupes fonctionnels, Pseudomonas fluorescents et Bactéries libres Fixatrices d’azote (BFN), diffère en fonction de l’état de santé des plantes tandis que pour les bactéries capables de solubiliser le phosphate (BSP) aucune différence significative n’a été enregistrée sur le nombre de bactéries isolées de la rhizosphère entre les plantes saines et les plantes malades et ce, pour les deux espèces de plantes maraichères. En effet, la rhizosphère des plantes malades contient moins ou pas du tout de colonies viables de Pseudomonas fluorescents et de BFN que celle des plantes saines. Cette différence pourrait être attribuée à la variation de la propriété biochimique du sol rhizosphérique des plantes malades qui devient défavorable pour certains groupes de microorganismes ou qui limite leur prolifération (Zhang et al., 2011). En fait, l’infection par l’agent phytopathogène entraine une modification au niveau de la physiologie de la plante et de ce fait au niveau des différentes substances qu’elle produit et excrète dans le milieu extérieur (Marschner et al,. 2004 ; Narula et al., 2009). Ce sont ces dernières, couramment appelées exsudat racinaire, qui influencent sur la structure et le fonctionnement des microorganismes vivant dans la rhizosphère (Philippot et al., 2006 ; Benizri et al., 2007). Huang et al. (2013) en travaillant avec des sols rhizosphériques de plants de tomates malades et saines ont constaté que le nombre de microorganismes rhizosphériques des plantes infectées est assez faible par rapport à celui enregistré pour les plantes saines. Ceci a été corroboré par Doornbos et al. (2012) qui ont rapporté que l’exsudat racinaire des plantes infectées par un agent phytopathogène contient des substances toxiques pour certains microorganismes bénéfiques. Cependant, une compétition avec l’agent phytopathogène en question pourrait également être à l’origine de ce phénomène comme il a été rapporté par Compant et al. (2005). L’acquisition des éléments essentiels comme l’azote, le phosphore, le carbone et même le fer reste parmi les causes les plus fréquentes de la compétition (Nihorimbere et al., 2011). Durant ce travail, les souches isolées et purifiées ont été également utilisées pour les tests des activités fonctionnelles dont l’expression du pouvoir antagoniste vis-à-vis des deux souches de champignons phytopathogènes, Aspergillus sp et Fusarium oxysporum, la capacité à produire des sidérophores notamment pour les Pseudomonas du groupe des fluorescents, la capacité à produire de l’AIA et enfin la capacité à solubiliser le phosphate. Pour chacun de ces tests, seul le facteur « état de santé » a été considéré, c’est-à-dire que l’étude réalisée n’a pas tenu compte du facteur« espèce végétale ». De ce fait, pour les souches de Pseudomonas fluorescents, issues de la rhizosphère des plantes malades et saines, obtenues lors de cette étude, aucune activité antagoniste n’a été enregistrée vis-à-vis de Fusarium oxysporum et d’Aspergillus sp in vitro. Or, généralement, les Pseudomonas fluorescents sont des agents antagonistes avec un pouvoir inhibiteur significatif pour ces deux champignons (Goud et Muralikrishnan, 2008 ; Zhang et al., 2011 ; Showkat et al., 2012). Les mêmes tendances ont été observées avec les souches de bactéries capables de solubiliser le phosphate excepté pour la souche BSP11/bs issue des plantes saines et BSP4/cm issue de plante malade. Ces deux dernières ont montré un pouvoir inhibiteur assez élevé, PI > 20 % selon notre échelle et par rapport aux autres souches, vis-à-vis de F. oxysporum. Yildiz et al. (2012) ont déjà rapporté cette propriété des BSP à inhiber la croissance in vitro du champignon phytopathogène F. oxysporum mais avec des souches isolées à partir des plantes en bonne santé. Cependant, l’une des souches isolées lors de cette étude et qui a présenté une activité contre ce champignon phytopathogène vient de la rhizosphère d’une plante malade et elle y a survécu puis développée ses propres fonctionnalités comme il a été déjà rapporté par Huang et al. (2013). Toutefois, cette absence de propriété antagoniste in vitro des autres souches peut également être liée à d’autres causes telles que le risque de modifications au niveau de la physiologie de l’agent phytopathogène qui devient de plus en plus marquée à la suite des repiquages successifs (Henni et al., 1994). Outre l’insuffisance des facteurs qui pourraient stimuler l’expression de leurs activités in vitro (Suprapta, 2012 ; Toua et al., 2013), l’influence du facteur temps lors de la culture in vitro des deux souches durant la confrontation pourrait être aussi la cause de cette absence de propriété antagoniste. Ces questions méritent encore une certaine mise au point ou des études plus approfondies étant donné que les deux agents phytopathogènes ont tous les deux un développement ultrarapide (Abubakar et al., 2013 ; Shehu et Bello, 2011 ; Gupta et al., 2010). Quarante-cinq pour cent (45 %) des souches isolées à partir des plantes malades possèdent plus d’une activité PGPR. La production de sidérophores et la production d’AIA étant les deux caractéristiques les plus rencontrées notamment pour les souches de Pseudomonas fluorescents. Cette propriété des Pseudomonas fluorescents à produire des sidérophores pour la chélation des ions ferriques est déjà très connue et a été signalée par plusieurs auteurs (Kannahi et Senbagam, 2014 ; Manivannan et al., 2012 ; Meyer, 1987). Karnwal (2009) a également rapporté la capacité de souches de Pseudomonas fluorescents à produire de l’AIA. Ce qui fait de ce genre l’un des candidats les plus prisés des PGPR pour les inoculations microbiennes (Glick, 1995 ; van Dyke et Prosser, 2000 ; Lemanceau, 1992). En effet, ces deux pouvoirs sont plus efficaces et rendent les souches qui les possèdent beaucoup plus compétitives dans la rhizosphère pour l’acquisition de l’ion ferrique tout en favorisant le développement racinaire de la plante par l’intermédiaire de l’AIA (Ahemad et Kibret, 2014). Par contre, certaines souches capables de solubiliser les phosphates ont eu des réponses très marquées vis-à-vis des champignons phytopathogènes F. oxysporum et Aspergillus sp. Cela signifie que, outre la production de substances qui leur permet de mobiliser le phosphate par compétition, ces souches produisent des substances antifongiques dont l’efficacité varie d’une souche à une autre. Cependant, comparé avec les travaux effectués par Suprapta (2012) qui a obtenu plus de 50 % contre les mêmes champignons phytopathogènes, le pourcentage d’inhibition obtenu lors de cette étude a été relativement faible. Ce qui ne signifie pas forcément que les souches isolées ne sont pas actives. Il se pourrait que les conditions in vitro ne soient pas optimales pour l’expression de leur capacité inhibitrice ou qu’elles possèdent d’autres fonctions que l’inhibition directe de ces deux agents pathogènes.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LA RHIZOSPHERE : source d’agents biologiques performants
I-1. Définition de la rhizosphère
I-2. Rhizodéposition
II. DIVERSITE DE LA MICROFLORE TELLURIQUE BENEFIQUE
II-1. Les Bactéries
II-2. Les Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (Plant Growth Promoting Rhizobacteria ou PGPR)
II-2-1. Les PGPR phytostimulatrices
II-2-2. Les PGPR phytoprotectrices
III. LUTTE ET INTERACTIONS BIOLOGIQUES ANTAGONISTES DANS LA RHIZOSPHERE
III-1. Définition de la lutte biologique
III-2. Lutte biologique avec des microorganismes rhizosphériques antagonistes
III-2-1. L’antibiose
III-2-2. La compétition
III-2-3. Le parasitisme
III-2-4. Induction des mécanismes de défense de la plante
MATERIELS ET METHODES
A. LES MATERIELS D’ETUDE
I. Le site d’étude
II. Les espèces végétales
II-1. La brède mafane
II-2. Le chou de Chine
III. Les souches fongiques phytopathogènes
B. METHODOLOGIE
I. Technique d’isolement des microorganismes rhizosphériques
I-1. Préparation de la suspension – dilution de sol
I-2. Ensemencement et étalement sur milieu de culture solidifié
II. Dénombrement de microorganismes rhizosphériques fonctionnels cultivables
II-1. Les bactéries libres fixatrices d’azote
II-2. Les bactéries capables de solubiliser le phosphate (BSP)
II-3. Les Pseudomonas du groupe des fluorescents
III. Isolement des colonies et purification bactérienne
IV. Conservation des souches bactériennes
V. Test d’antagonisme des souches microbiennes vis-à-vis de Fusarium oxysporum et Aspergillus sp
V-1. Test d’antagonisme in vitro
V-1-1. Déroulement de la confrontation
V-1-2. Lecture des résultats
VI. Test de production de l’acide indole-3-acétique (AIA)
VII. Analyse statistique des données
RESULTATS
I. Dénombrement de la microflore rhizosphérique
II. Nombre de souches de Pseudomonas, de BSP et de BFN pour les deux plantes
III. Test d’antagonisme in vitro
III-1. Pouvoir inhibiteur des souches de Pseudomonas fluorescents vis-à-vis de Fusarium oxysporum et d’Aspergillus sp
III-2. Test d’antagonisme des BSP vis-à-vis de Fusarium oxysporum et d’Aspergillus sp
IV. Production d’acide indole-3-acétique
V. Solubilisation du phosphate par les bactéries rhizosphériques
DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
ABSTRACT
RESUME
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