SELECTION AU CHAMP POUR LE DEVELOPPEMENT DE LIGNEES PRODUCTIVES

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Conduite de la Mutagenèse in vitro :

Le protocole utilisé lors des expérimentations est celui utilisé au laboratoire d’amélioration des plantes de la « FAO/IAEA Plant Breeding Unit Seibersdorf » Vienne, Autriche.

Induction de cals à partir de l’embryon mature

L’induction de cals comprend trois étapes : la désinfection des graines, la mise en culture des graines et la préparation des unités embryogènes. Toutes les manipulations se font sous hotte à flux laminaire.
Désinfection des graines : Les graines de chaque variété de riz ont été décortiquées, stérilisées à l’alcool éthanol 70% ndantpe 5 minutes, puis désinfectées dans de l’eau de javel commercial (hypochlorite de sodium NaOCl 5.75%) avec 2 gouttes de Tween 20 pendant 20 minutes, puis rincées 3-4 fois avecde l’eau distillée stérile.
Mise en culture des graines : Ces graines désinfectées sont ensuite cultivées dans des boîtes de Pétri contenant les milieux d’induction. Huit (8) types de milieux ont été essayés pour produire des cals. Les caractéristique étant les suivantes :
o Milieu A : milieu de base MS (composition organique et inorganique) décrit par Murashige et Skoog (1962), avec 2mg/l de 2,4-D ; 0.5mg/l Kinétine ; 30g/l de sucrose et 5.5g/l d’agarose I-A.
o Milieu B : milieu A + 8g/l d’agarose I-A.
o Milieu C : milieu de base MS (5519) avec 100mg/l de Myo-Inositol et 0.4mg/l Thiamine-HCl, avec 2mg/l 2,4-D ; 0.2mg/l BAP et 50 mg/l Proline, 6% de sucrose, 5g/l d’agarose I-A.
o Milieu D : milieu C + 8g/l d’agarose I-A.
o Milieu F : milieu de base LS décrit par Linsmaier et Skoog (1965), avec 2mg/l de 2,4-D, 1mg/l Thiamine-HCl, 100mg/l Inositol,30g/l sucrose, 8g/l agarose I-A.
o Milieu G : milieu de base MS avec 2mg/l 2,4-D, 1g/l Caséine hydrolysat, 30g/l sucrose, 8g/l agarose I-A.
o Milieu H : milieu de base LS avec 100mg/l Tryptophane, 1mg/l 2,4-D, 0.3mg/l Kinétine, 30g/l sucrose, solidifié par 8g/l d’agarose I-A.
o Milieu I: milieu de base MS avec 2mg/l BAP, 1mg/l Kinétine, 1mg/l NAA, 30g/l sucrose, 8mg/l agarose I-A.

Matériels et méthodes

Huit (8) graines par boîte de Pétri par variété ontété cultivées avec 6 répétitions. Les boîtes de Pétri scellées avec du parafilm ont étéardéesg dans des cartons à l’obscurité dans la chambre de culture à 25 ± 2°C, pendant deux moi s, jusqu’à l’obtention de cals de grande taille environ 1.3 cm. Préparation des cals pour l’irradiation : Les cals de grandes tailles sont subdivisées pour obtenir un nombre maximum de cals. Ces cals à traiter doivent avoir une taille comprise entre 0.8 à 1.6 cm de diamètre, car les cals plus gros, présentant un état de différenciation plus avancé, amènent à des fréquences très faibles des mutations. Tandis que les cals de petite taille ne résistent pas au choc dû à l’irradiation.
Les graines contaminées et les cals induits (embryogènes et non embryogènes) ont été évalués. Le pourcentage de contamination a été évalué par nombrele de tubes contaminés sur le nombre total de tubes cultivés.

Induction de la mutation au niveau des cals induits

Des cals âgés de huit semaines, issus de la culture d’embryon in vitro, de tailles environ de 6-8mm sont placés dans un milieu de culture frais et subissent l’irradiation par le rayon gamma (γ) en utilisant le Cobalt 60 (60Co) comme source de radiation. Cet agent mutagène physique a été choisi car c’est le plus utilisé en amélioration des plantes, à cause de ses caractéristiques « longueur d’onde la plus courte, (inférieure à 1 Angström), radiation très pénétrante et un niveau d’énergie élevé » supérieurà10 Mev (IAEA, 1977 ; IAEA, 1995 ; VAN HARTEN, 1998). Après le test de radio sensitivité de variétés de riz malagasy
« Malady, Rojofotsy, et IR 58614 » (RAKOTOARISOA, 2001), les doses suivantes 0, 10, 15, 20Gy ont été choisies et appliquées pour chaque variété étudiée, de chaque milieu « A, B, C, D, » (en 11/12/00, dont le taux de dose était de 28.6 rad/mn ou 0.286 Gy/mn), et pour les milieux « F, G, H, I, » avec le taux de dose de 28 rad/mn ou 0.28 Gy/mn le 31/01/01).
– La dose : C’est l’énergie émise par une source.
– La dose absorbée ou débit de dose exprimée en rad/sec ou rad /mn: indique la quantité d’énergie absorbée par l’objet irradié pendant l’unité de temps donné à partir d’une source de radiation. L’unité est le « RADIAN » (rad).
La dose absorbée D est le quotient du taux de dose ΔD par l’intervalle de temps Δt
D : est exprimé en rad / heure, ou rad/ minute ou rad /seconde.
Δ D : exprime le taux de dose du rayon gamma au jour de l’irradiation. L’ancienne unité
« radian » est remplacée par le «Gray » notée par le symbole « Gy ». C’est l’unité du système international (SI) utilisée pour quantifier la dose de radiation absorbée.
1 Gy (Gray) = 100rad, ou 1 krad=10Gy (IAEA, 1995)

Traitement des cals après irradiation

Notre but étant de développer des lignées productives et des lignées tolérantes au froid. Les cals sont divisés en trois lots, recevant respectivement les traitements après irradiation:
– à basse température,
– à 28°C,
– et transférer immédiatement dans le milieu de régénération.

Traitements des cals à basse température

Le premier lot de cals a été transféré dans un milieu frais de multiplication (milieu d’induction). Ensuite, les boîtes de Pétri ont étéscellées à l’aide d’un parafilm et ont été gardées dans l’incubateur à 16°C pendant 4 semaines , ensuite à 12°C pendant 4 semaines, puis les cals ont été passés à la sélection vitro.

Traitement des cals à la température 28°C

Le second lot de cals servant de témoin a été gardéàla température de la salle (28°C) pendant la même période de 2 mois que ceux gardésbasseà température.
Le développement des cals et la régénération des antulespl de ce témoin sont à comparer avec ceux gardés à basse température pendant la même période.

Transfert immédiat des cals pour la régénération après irradiation

Ce troisième lot de cals a été transféré immédiatement sur un milieu de culture frais pour la régénération des plantules après irradiation.
Cette manipulation sert de comparer l’effet de l’ir radiation sur la production des plantules putatives mutantes M1, avec le groupe gardé à la température ambiante pendant deux mois.
Trois types de milieu ont été essayés pour tous lestraitements afin d’obtenir un grand nombre de plantules putatives mutantes, dont les milieux J, K et L.
Avant la culture, les cals ont été déshydratés dansune boîte de Pétri contenant un papier filtre stérile pendant 24 heures pour accélérer la régénération.
Pour la variétéjaponica, nous avons utilisé le milieu J pour la régénération en plantules, tandis que pour les variétésindica, deux milieux K et L ont été utilisés.
o Milieu J : milieu de base MS additionné avec 1mg/l de Kinétine, 1mg/l NAA, 30g/l sucrose, 1.7g/l gelrite, pH 5.8.
o Milieu K : milieu de base MS avec 2mg/l de BAP, 1mg/l NAA, 1mg/l de Kinétine, 30g/l sucrose, 8g/l d’agarose I-A. pH 5.8.
o Milieu L : milieu de base N6 décrit par CHU C.C. et al. (1976), avec des vitamines MS, 2mg/l BAP, 1mg/l Kinétine, 30g/l sucrose, 8g/ld’agarose I-A. pH 5.8.
Les boîtes de Pétri ont été scellées avec du parafilm et maintenues dans la chambre de croissance à la température (25 ± 2) °C, de lumino sité aux environs de 65 µmol/s/m2 (3500Klux), de photopériode 16 heures à la lumière et 8 heures à l’obscurité jusqu’à l’initiation de jeunes plantules. Le pourcentage de plantules régénérées a été calculé à partir du rapport entre le nombre de cals produisant des plantules et le nombre total des cals transférés dans le milieu de régénération, pour chaque milieu et chaque variét .
Les plantules vertes ont été ensuite transférées nsda un tube renfermant du milieu MS (MURASHIGE et SKOOG, 1962) ajouté de 30 g/l de sucrose en absence d’hormone, solidifié de 1.8g de phytagel pour le développement des racines des plantules.
Afin de déterminer l’effet des différents facteurs (dose d’irradiation, température, durée d’emmagasinage) sur le développement des calset la croissance des plantules, la sélection in vitro a été effectuée.

Mode de sélection in vitro

La culture de cals a été utilisée pour la sélection in vitro. (HAMISH et al, 1989). La sélection pour la résistance à l’irradiation, ou au facteur externe du milieu est l’approche la plus pratiquée à la sélection in vitro. Celle-ci consiste à incuber la masse de culture sous différentes conditions (température, durée d’incubation et dose d’irradiation), et seules les cellules résistantes qui se développent, sont ensuite récupérées. La sélectionin vitro raccourcit considérablement le temps pour l’obtention d’un caractère désirable.
Le critère de sélection des calsà une certaine condition que ce soit : l’irradiat ion, la température ou la durée d’incubation, est basé sur« la couleur des cals». Les cals de couleur « blanc jaunâtre » sont considérés comme tolérantsà une condition donnée, moyennement tolérant s’ils sont de couleur « marron » donc en voie de dépérissement, et ne supporte plus la condition quand il est de couleur « noir, aspect nécrosé », c’est-à-dire les cellules sont mortes.
Le critère de sélection in vitro des plantules,la variation génétique est très commune dans les plantules dérivées de la mutationin vitro. L’expression d’un faible changement phénotypique est considérée comme modifications cytologiques dans les plantules régénérées à partir de tissus de cals (REMOTTI, 1998). Alors, les plantules tolérantes à une telle condition du milieu se développent bien et dans le cas contraire, elles meurent ou se développent mal.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
MATERIELS ET METHODES
Introduction
1ère partie : MUTAGENESE IN VITRO : INDUCTION DE LA MUTATION DANS LES MATERIELS VEGETAUX ET PRODUCTION DE GRAINES DE 1ère génération M1
I- Le matériel végétal utilisé
II – Conduite de la Mutagenèse in vitro
II–1- Induction de cals à partir de l’embryon mature
II -2- Induction de la mutation au niveau des cals induits
II -3 – Traitement des cals après irradiation
II-3-1- Traitements des cals à basse température
II-3-2-Traitement des cals à la température 28°C
II-3-3-Transfert immédiat des cals pour la régénération après irradiation
II-4- Mode de sélection in vitro
II-5-Acclimatation en serre
II-6- Production de graines M1
2ème partie: SELECTION AU CHAMP POUR LE DEVELOPPEMENT DE LIGNEES PRODUCTIVES
I- Première évaluation au champ 2001-2002
I-1-Le matériel végétal
I-2- Les caractéristiques du site d’expérimentation
I-3-Conduite expérimentale
I-3-1- La germination
I-3-2- La préparation du champ de rizière
I-3-3- Choix du système de culture
I-3-4- Le repiquage
I-3-5- Fertilisation du sol
I-3-6– Entretien des dispositifs
I-3-7- La récolte
I-3-8- Méthodes de suivi
I-4- Les paramètres biologiques du riz considérés
I-5- Méthodes et critères de sélection de lignées intéressantes
II- Deuxième (2002-2003) et troisième sélection au champ (2003-2004)
II-1- Matériels végétaux
II-2- Conduite expérimentale
II-3-Méthodes de suivi et d’observation, critères de sélection des mutants utiles
III- Evaluation au champ du rendement des dernières lignées sélectionnées (2004-2005)
III- 1-Matériels végétaux
III-2- Caractéristiques du site d’étude
III-3-Conduite expérimentale
III-4-Méthodes de suivi et d’observation
3ème partie : SELECTION POUR LE DEVELOPPEMENT DE LIGNEES TOLERANTES AU FROID PENDANT LA PHASE VEGETATIVE DE L’HIVER (2001-2002)
I- Première sélection au champ en hiver (2001-2002)
I-1-Choix du matériel végétal
I-2-Les caractéristiques du site d’expérimentation
I-3-Conduite expérimentale
I-4- Observations et paramètres à considérer
I-5- La technique d’échantillonnage et la méthode de sélection 34
I-6- Méthodes de suivi et de comptage
II- Deuxième sélection au champ en hiver (2002-2003)
II-1-Matériel végétal
II-2- Conduite expérimentale
III- Troisième sélection : Tests en conditions contrôlées de la germination à la phase végétative (2003-2004)
III-1-But de la manipulation
III-2- Choix du matériel végétal
III-3- Conduite expérimentale
III- 3-1-Méthodes et critères de sélection des mutants utiles37
III-3-2-Méthodes de suivi et d’observation
III-3-3-Méthode de mesure de la stérilité des épillets
IV– Evaluation au champ du rendement des lignées M4 issues du test en conditions contrôlées (pendant la saison d’hiver du mois de juillet 2004 jusqu’au mois de janvier 2005 de l’été suivant).
IV- 1- Matériels végétaux
IV- 2- Les caractéristiques du site d’étude
IV- 3-Dispositifs d’expérimentation
IV- 4- Méthodes de suivi et d’observation
V – ETUDES STATISTIQUES DES RESULTATS
IV-1- Pour le développement de lignées productives
IV-2- Pour le développement de lignées tolérantes au froid
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
1ère partie : RESULTATS SUR LA MUTAGENESE in vitro
I- Production de cals
I-1-Cals induits pour les trois variétés dans les huit milieux de cultures
I-2-Production de cals embryogènes
II- Effets des traitements à différentes températures des cals irradiés
II-1- Effets des traitements des cals irradiés à 28°C et à 16°C pendant un mois
II-2- Effets des traitements des cals irradiés à 28°C et à 12°C pendant un mois
III- Production de plantules
III-1-Régénération des plantules issues de cals incubés de 1 mois à 16°C puis de 1 mois à 12°C
III-2-Régénération des plantules issues de cals incubés à la température de 28°C pendant 2 mois
III-3- Régénération des plantules après l’induction de la mutation au niveau des cals
IV – Enracinement et acclimatation
IV-1- Rendement en plantules acclimatées survivantes issues des cals traités à 16°C pendant 1 mois puis à 12°C pendant 1 mois et nombre de graines obtenus de ces plantes
IV-2- Rendement en plantules acclimatées survivantes issues de culture prolongée de cals pendant 2 mois à 28°C et nombre de graines obtenues de ces plantes
IV-3- Rendement en plantules acclimatées survivantes issues de cals irradiés transférés immédiatement dans le milieu de régénération et nombre de graines obtenues
2ème partie : RESULTATS DES EXPERIMENTATIONS AU CHAMP pour le DEVELOPPEMENT DE LIGNEES MUTANTES PRODUCTIVES
I- Résultats de la première sélection (2001-2002)
I-1- Germination
I-1-1- Taux de germination
I-1-2- Croissance des plantules au cours de la germination
I-2- Caractères agronomiques des Rojofotsy 0, 10, 20 Gy lors de la première sélection au champ (2001-2002)
I-3-Etude comparative de la croissance et du développement de la lignée M1- 20Gy) à celui de Rojofotsy témoin (0 Gy) au champ
I-4- Stades phénologiques de Rojofotsy 0 et 20Gy
I-5-Fertilité des graines par plante
II- Résultats de la deuxième sélection de la lignée M2-8 (2002-2003)
II-1- Caractères agronomiques de la lignée M2-8 : Moyenne des « hauteurs, nombre de talles et nombre de feuilles par plante »
II-2- Différents stades phénologiques de la lignée M2-8 au cours de la deuxième sélection (2002-2003)
II-3- Fertilité des graines par plante
III- Résultats de la troisième sélection (2003-04)
III-1-Caractères agronomiques de la lignée M3-15
III-2- Stades phénologiques de la lignée de riz M3-15
III-3- Fertilité des graines par plante ..
IV- Impact de l’irradiation sur les caractères agronomiques des plantes sélectionnées M4-n°6, 10, 11
IV-1- Effet de l’irradiation sur la hauteur des plantes
IV-2- Effet de l’irradiation sur le nombre de talles
IV-3- Effet de l’irradiation sur le nombre de feuilles par plante
IV-4- Effet de l’irradiation sur le nombre de graines fertiles et stériles par plante
IV-5- Effet de l’irradiation sur le ‘’Poids de 1000 grains’’
IV-6- Effet de l’irradiation sur le rendement
V- Description des caractères morphologiques et physiologiques distinctifs de la lignée M4-n°6-n°10-n°11
V-1-Les caractères distinctifs des lignées sélectionnées
V-2- Les stades phénologiques et l’indice de maladie des lignées M4-10Gy n°6- 10 et 11.
3ème partie : RESULTATS POUR LE DEVELOPPEMENT DE LIGNEES TOLERANTES AU FROID PENDANT LA PHASE VEGETATIVE
I- Résultats de la 1ère sélection au champ pour la tolérance au froid (Juillet 2001- Janvier 2002)
I-1-Germination
I-2-Pourcentage des plantes survivantes durant la phase végétative : Juillet – Septembre 2001
I-3- Etude comparative de la croissance et du développement des plantes de riz pendant la phase végétative au champ
I-4- Evaluation des caractères des lignées
I-5- Stades phénologiques des lignées sélectionnées
I-6-Fertilité des panicules
II- Résultats de la 2ème sélection au champ en hiver (2002-2003)
II-1- Caractères agronomiques des lignées sélectionnées
II-2- Caractères phénologiques des lignées sélectionnées
II-3- Fertilité des cinq plantes sélectionnées de chaque lignée pendant la deuxième sélection
III- Test dans les conditions contrôlées
III-1-Germination des graines dans les conditions contrôlées
III-2-Croissance des plantules dans les conditions contrôlées
III-3-Caractères agronomiques des lignées issues du test dans les conditions contrôlées
III-4-Caractères physiologiques des dernières lignées M4
IV- Impact de l’irradiation et de la température sur quelques caractères agronomiques des lignées issues du test en condition contrôlées (M4).
IV-1- Effet de la température et de l’irradiation sur la hauteur des plantes
IV-2- Effet de l’irradiation et de la température sur le nombre de graines Fertiles
IV-3- Effet de l’irradiation et de la température sur la stérilité des épillets
IV-4- Effet de la température et de l’irradiation sur la distance auriculaire
IV-5- Effet de la température et de l’irradiation sur le poids de mille graines
IV-6- Evaluation du rendement des lignées M4 obtenues
V- Description des caractères morphologiques et physiologiques distinctifs des dernières lignées putatives mutantes tolérantes au froid M4 (pendant la germination et la phase végétative)
DISCUSSION GENERALE
CONCLUSION GENERALE

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