Scedosporium apiospermum

Scedosporium apiospermum

La colonisation des cavités chez les patients atteints de mucoviscidose

S. apiospermum est capable de profiter d’un terrain fragilisé et de coloniser des cavités comme les poumons et les sinus par inhalation des spores. Il entraîne alors des allergies broncho-pulmonaires (ABP), des kystes fongiques pulmonaires, des sinusites, des otites et peut notamment s’observer dans l’appareil pulmonaire d’un patient atteint de pneumopathie chronique, dont la mucoviscidose. S. apiospermum est le deuxième champignon filamenteux rencontré dans les infections respiratoires chroniques dans le cadre de la mucoviscidose.La mucoviscidose, ou fibrose kystique du pancréas, est la plus fréquente des maladies génétiques héréditaires graves dans la race blanche caucasienne et est transmise selon le mode autosomique récessif [1]. Il s’agit d’une exocrinopathie généralisée, touchant de nombreuses glandes, notamment les glandes sudoripares. Elle est causée par une mutation au niveau du gène Cystic Fibrosis (CF) situé sur le chromosome. Il code pour la protéine Cystic Fibrosis Transmembranes (CFTR) qui intervient, au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales, dans la régulation du canal chlore. La mutation ∆F508 de ce gène, la plus répandue, cause un dysfonctionnement de cette protéine CFTR, ce qui a pour conséquence une diminution de la perméabilité épithéliale au chlore. Ce phénomène est associé, dans les voies aériennes, à une réabsorption accrue de sodium. Ainsi, une déshydratation des sécrétions bronchiques se créée, altérant la clairance mucociliaire et favorisant de ce fait les complications infectieuses et obstructives. Au final, l’épaississement des sécrétions des glandes exocrines s’associe à une déshydratation, provoquant une obstruction qui conduit à une altération progressive des parenchymes initialement normaux. La mucoviscidose réalise donc une exocrinopathie généralisée affectant également l’appareil respiratoire, le tube digestif et ses annexes (pancréas, foie et voies biliaires), mais également le tractus génital . Dans le cadre de la mucoviscidose, les infections et complications bronchopulmonaires influent souvent sur le pronostic vital des patients. Ce met en place alors un « cercle vicieux » entre infections et inflammation : l’inflammation s’accompagne d’une défaillance locale des défenses immunitaires de l’hôte qui favorise à son tour les infections .Ce cycle sans fin aboutit à une destruction tissulaire dans l’arbre bronchopulmonaire.

Facteurs de virulence

Scedosporium apiospermum est un pathogène opportuniste, récemment classé dans les pathogènes émergents. En effet, l’analyse de cas cliniques montre une évolution du spectre clinique avec une apparition de maladies opportunistes depuis 1980 .. De ce fait, de nombreuses études ont vu le jour vis-à-vis de ce champignon pour comprendre sa pathogénicité.Les principaux facteurs de virulence de S. apiospermum sont les métalloprotéinases, les sérinesprotéases et les sidérophores. Les métalloprotéinases possèdent la capacité de dégrader les tissus de l’hôte par élimination de la laminine et la fibronectine de la matrice extracellulaire. Cette fibronectine étant activatrice des macrophages, le champignon peut alors échapper aux défenses de l’hôte. De plus, ces peptidases extracellulaires sont capables de cliver les molécules d’Immunoglobulines G (IgG), les mucines et fétuines des surfaces des muqueuses et d’hydrolyser l’albumine et l’hémoglobine [6]. Chez les patients atteints de la mucoviscidose, des protéases produites par des agents pathogènes fongiques (Aspergillus fumigatus, S. apiospermum…) seraient responsables dans une moindre mesure de l’apparition des lésions pulmonaires. Elles dégraderaient les protéines de l’organisme hôte comme la laminine de la membrane basale et le fibrinogène ou de manière indirecte par des mécanismes d’hypersensibilité. Les sidérophores auraient la capacité de capter le fer contenu dans les protéines de l’hôte, notamment la ferritine et la transferrine. Cette capacité pourrait jouer un rôle important dans la diffusion de S. apiospermum dans le cerveau. A ce jour, 2 sidérophores de type hydroxamate ont étés identifiés : l’acide dimérumique et le Nα-méthyl coprogène B, ce dernier étant spécifique de S. apiospermum. Deux autres facteurs de virulence ont été découverts récemment : l’α-glucane ainsi qu’une Heat Shock Protein 60 (Hsp60) [10]. La catalase est quant à elle suspectée de jouer un rôle dans la pathogénicité du champignon mais son rôle est encore mal connu [11].

Diagnostic

Le diagnostic des infections à S. apiospermum est fondé sur les réponses histologiques et cytologiques de l’organisme infecté [9]. L’absence de méthode de diagnostic adaptée rend difficile l’évaluation de la responsabilité de ce champignon dans des infections parfois mortelles car les symptômes et les lésions infligés par S. apiospermum sont similaires à d’autres pathogènes fongiques plus connus comme A. fumigatus. Actuellement il y a plusieurs méthodes de diagnostics. La technique classique est basée sur la culture et l’identification du champignon selon des critères morphologiques. C’est une technique lente car le champignon peut nécessiter jusqu’à 14 jours de culture. Des milieux de culture plus sélectifs comme le milieu SceSel+ permettent de mieux isoler S. apiospermum des autres champignons filamenteux. Un examen direct est aussi possible grâce à des colorations histochimiques et par microscopie à fluorescence. Kaufman et al., ont décrit la détection de S. apiospermum par microscopie à fluorescence avec des anticorps polyclonaux fluorescents [13]. Toutefois, les hyphes ramifiés et septés de ce champignon sont similaires à ceux d’Aspergillus, de Fusarium et d’espèces de champignons noirs, ce qui rend la différenciation difficile [6]. Une sérologie par électrosynérèse peut être réalisée mais des champignons tels qu’Aspergillus fumigatus peuvent présenter des réactions croisées. En revanche, un peptidorhamnomannane isolé par Pinto et al. et spécifique de S. apiospermum pourrait être utilisé comme antigène pour des méthodes de diagnostic sérologiques [12]. Enfin, les techniques de biologie moléculaire sont de plus en plus associées aux techniques classiques car elles permettent d’identifier précisément le champignon [6]. Toutefois, le différentiel entre simple colonisation et infection ne peuvent être affirmés par cette approche. Wedde et al ont réussis à différencier P. boydii / S. apiospermum et S. prolificans par PCR conventionnelle [14]. D’autres techniques de PCR conventionnelles, en temps réel, multiplex ou par des puces d’oligonucléotides ont été développées mais restent lourdes à mettre en œuvre et ne sont pas encore accessibles à tous les laboratoires. Dans le cas de mycétomes, des radiologies peuvent aider au diagnostic.

Thérapeutique

Un diagnostic précis est primordial pour administrer le traitement antifongique adapté, cela s’applique encore plus pour les patients immunodéprimés. Pour les mycétomes et autres infections localisées, une intervention chirurgicale basée sur l’exérèse des tissus lésés est appliquée. S. apiospermum est résistant à l’amphotéricine B, à la 5 fluorocytosine et à la majorité des dérivés azolés. Seulement les azolés de type kétoconazole et l’itraconazole semblent donner de bonnes réponses thérapeutiques, utilisées avec les doses adéquates sur de longues durées. Le voriconazole et le ravuconazole, de nouvelles molécules classées dans les triazolés, ont une activité satisfaisante et constante. Il y a cependant une contradiction entre les résultats in vitro et in vivo concernant l’amphotéricine B. La méthode la plus prometteuse semble être une association de 2 antifongiques : l’amphtéricine B et le fluconazole. De plus, l’association d’antifongiques pourrait s’accompagner d’une stimulation du système immunitaire de l’hôte par l’interféron-γ [14] et par l’interleukine 15 [15], en particulier pour les infections disséminées.

Table des matières

GLOSSAIRE
PRÉSENTATION DU GEIHP
1. Le laboratoire
2. L’organisation
3. La thématique de recherche
I. INTRODUCTION
II. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Scedosporium apiospermum
1.1. Taxonomie
1.1.1. Caractères culturaux
1.1.2. Morphologie macroscopique
1.1.3. Morphologie microscopique
1.1.4. Habitat
1.2. Pouvoir pathogène
1.2.1. Pathologies
a) Inoculation suite à un traumatisme
b) La dissémination invasive
c) La colonisation des cavités chez les patients atteints de mucoviscidose
1.2.2. Facteurs de virulence
1.2.3. Diagnostic
1.2.4. Thérapeutique
2. Les catalases
2.1. Les catalases typiques dites monofonctionnelles.
2.2. Les catalases-peroxydases
2.3. Les catalases non-héminiques dites à manganèse
III. MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Matériel biologique
1.1. Souche utilisée
1.2. Entretien du champignon
1.3. Culture en milieu liquide
1.4. Extraction des constituants cellulaires
2. Fractionnement par chromatographie
2.1. Chromatographie échangeuse d’anions (CEA)
2.2. Chromatographie d’Interactions Hydrophobes
2.3. Chromatographie de Gel Filtration
2.4. Analyses électrophorétiques
2.4.1. Migration dans un gel de polyacrylamide
2.4.2. Coloration au Bleu de Coomassie
2.4.3. Coloration à l’argent
2.4.4. Western Blot
2.4.5. Immunodétection sur membrane
3. Recherche de l’activité catalasique
3.1. Par production d’oxygène
3.2. Coloration négative de Woodbury et Coll
4. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
5. Production d’anticorps monoclonaux
5.1. Immunisation des souris
5.2. Amplification du myélocyte P3X63 Ag8
5.3. Préparation et dépôt des macrophages
5.4. Récupération des splénocytes
5.5. Récupération des P3X63 Ag8
5.6. Hybridation somatique (Fusion)
IV. RÉSULTATS
1. Analyse de l’extrait fongique de Scedosporium apiospermum
2. Purification de la catalase A2.
2.1. Purification partielle par DEAE
2.2. Purification de la catalase A2
3. Immunisation des souris
3.1. Contrôle d’immunisation des souris
3.2. Réactivité des IS en Western-Blot
4. Fusion et clonage
4.1. Rendement des fusions
4.2. Criblage primaire
4.3. Criblage secondaire
4.4. Clonage
4.5. Immunoréactivité sur membrane
V. DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE
TABLE DES ILLUSTRATIONS
TABLE DES TABLEAUX
TABLE DES ANNEXES

Télécharger le rapport complet