RT-PCR EN TEMPS REEL DES POLIOVIRUS DERIVES DES SOUCHES VACCINALES

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SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LA POLIOMYELITE ET LE POLIOVIRUS

La poliomyélite est une maladie grave et contagieuse touchant principalement les enfants de moins de 5 ans, chez qui elle peut entraîner une paralysie flasque aigüe (PFA) irréversible dans moins de 1% des cas, voiremortelle chez 5 à 10% des sujets paralysés en cas d’atteinte des muscles respiratoires. La fièvre, l’asthénie, les céphalées, les vomissements, la raideur de la nuqueet les douleurs dans les membres constituent les premiers symptômes (Organisation Mondiale De La Santé 2014)
Le Poliovirus appartient à la famille des Picornaviridae, au genre Enterovirus et à l’espèce des Entérovirus-C (EV-C). Il est généralement pathogène chez l’Homme avec tropisme pour le tractus digestif et le système nerveux. Il s’agit d’un virus non enveloppé de taille comprise entre 27 à 30 nm, formé par 60 copies de chacune des protéines de structure (VP1, VP2, VP3 et VP4) dont l’assemblage forme la capside icosaédrique. Un ARN monocaténaire de polarité positive, constitué de 7 441 nucléotides (nt), représente le génome. LePoliovirus est subdivisé en 3 sérotypes (PV 1 à 3) qui se distinguent au niveau de la région VP1. Sur sa capside se trouve une structure spécifique au récepteur cellulaire de poliovirus (PVR), le CD155 humain, lui permettant d’adhérer aux cellules humaines hôtes (Eckard et al. 1993).
Les PV sont résistants au pH acide, à l’alcool 70°, à l’éther, au déoxycholate de sodium et aux détergents. De ce fait, ils peuvent ester des semaines dans l’environnement et peuvent être conservés pendant esd années à -20°C. Cependant, ils sont détruits par les agents oxydants, le formol, le béta-propionolactone et le rayonnement UV (Koike et al. 1990).
Le génome comporte plusieurs régions:
La région 5’ non codante ou 5’RNC (600 – 1200 nt) :
-> Elle est conservée chez tous les Entérovirus (possibilité de diagnostic par PCR pour l’ensemble du genre Enterovirus).
-> Elle est est importante pour la multiplication virale (traduction et encapsidation) et la virulence.
-> Elle comprend une structure secondaire dénommée« Internal Ribosome Entry Site » (IRES) au niveau de laquelle la traduction est initiée.
La région 3’ non codante ou 3’RNC (50 – 100 nt) :
->Elle est importante pour la synthèse du brin complémentaire (ARN-)
VPg : Protéine terminale commune chez tous les Picornavirus (acquise lors de la maturation).
PolyA : Poly-adénylation (acquise lors de la maturation).
VP1, VP2, VP3, VP4 : Polyprotéines virale qui déterminent le tropisme tissulaire c’est-à-dire la pathogénicité du virus.

CARACTERISTIQUES DES POLIOVIRUS

Les Poliovirus existent en trois sérotypes (PV1, PV2, PV3). Ils n’ont aucune communauté antigénique, impliquant ainsi la trivalence du vaccin antipoliomyélitique.
Les types de virus sont définis par la séquence codante de la capside qui est hautement conservée. Par contre, les séquences noncapsidiques- et non codantes sont instables et constituent les cibles de diverses recombinaisons et mutations. Virus à ARN, ils ont plus de tendance à muter lors de la réplication, comparés aux virus à ADN, en raison de l’inaptitude de l’ARN polymérase à corriger les erreurs de réplication par l’absence de l’activité 3’→ 5’ . Une réactivité immunologique croisée est observée entre les sérotypes : celle, entre lestypes 1 et 2 par exemple où la présence des anticorps anti-PV2, confère une protection significative contre le PV1.
Les poliovirus présentent également des différencesintratypiques avec possibilité de différenciation par la technique dedifférenciation intratypiques (DIT) entre les souches sauvages (PVS) et vaccinales (SL : Sabin-like). Un test de VDPV par réaction de reverse transcription et amplification génique en temps réel (rRT-PCR), est également applicable sur les SL afin d’identifier les SL mutants. La variabilité entre ces souches s’observe au niveau de la séquence du VP1 selon les proportions suivantes :
-Sabin-like : séquence ayant moins de 1% de différence avec celle du virus vaccinal Sabin ;
-VDPV : séquence ayant entre 1% à 15% de différenceavec celle du virus vaccinal Sabin ;
-PVS : séquence ayant une différence supérieure à 5%1 avec celle du vaccin Sabin sauf pour le PVS-3 dont la différenceaffecte 11 nucléotides seulement.
Les PVS se caractérisent surtout par leur haute neurovirulence contrairement au PV vaccinaux. Des acides nucléiques et des acides aminés précis dans leurs séquences polypeptidiques leurs confère cette neurovirulence (les sites de mutation sont mis entre-parenthèse) :
– Pour le PVS-1 : A480 et A189 (5’UTR), Ala65 (VP4), Leu225 (VP3), Leu134 et Ala106 (VP1), Tyr73 (3Dpol).
– Pour le PVS-2 : Acide aminé en position 481 (5’UTR) et 143 (VP1).
– Pour le PVS-3 :C472 (5’UTR), Ser91 (VP3), Ile6 (VP1)
Toutefois, comme les souches vaccinales sont des virus vivants atténués, elles peuvent se multiplier dans l’intestin et pourraient retrouver leur pouvoir neurovirulent par le mécanisme de réversion(Office Féderal De La Santé Publique 2010)
Le PV peut se multiplier et être isoléin vitro sur la lignée cellulaire L20B (lignée transgénique provenant de cellules de souri dans lesquelles le récepteur de Poliovirus humain CD155 a été implanté)(Koike. et al. 1990, Eckard et al. 1993, Luis et al. 2007)

MODE DE TRANSMISSION ET IMPLICATION

Le mode de transmission du virus se fait généralement par voie féco-orale car les poliovirus se répliquent continuellement dans l’intestin pendant plusieurs semaines, voire des mois, et sont donc excrétés avec les fèces.
Comme ils sont également présents dans la muqueusenaso-pharyngiale durant les deux premières semaines de l’infection, la transmission par voie oro-pharyngée durant cette période est aussi possible.
L’infectiosité est très importante et au moment oùun cas est reconnu, 90 à 100% des personnes en contact étroit sont susceptibles d’être infectées bien que la majorité des cas soit asymptomatiques (« plus de 99% des infections au poliovirus procède sans paralysie ») ou se manifeste par des symptômes non spécifiques légers (syndrome grippal ou gastro-intestinal). (Hovi et al. 2012)

MATERIEL ET METHODES

ISOLEMENT SUR CELLULES

TRAITEMENT DES SELLES

Le traitement des selles a pour objectif d’éliminer les microorganismes (bactéries, champignons) autres que les entéroviruset de neutraliser les lipides. Il consiste à traiter les prélèvements de selles avecdu chloroforme.

PRELEVEMENT DE SELLES

En décembre 2014, 356 prélèvements de selles d’enfants sains dans la commune rurale de Befotaka Nord du district d’Analalava, de la région de Sofia sont collectés à la suite de la détection de virus vaccinal muté chez un enfant atteint de poliomyélite. Ils sont conservés à -20°C jusqu’à leur manipulation au laboratoire.

PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS) : TAMPON PHOSPHATE SALINE

Le PBS est nécessaire pour préparer les suspensionsde selles et pour stabiliser les entérovirus par la présence d’ions calcium et magnésium.
La solution de PBS est préparée à partir des 3 solutions notées A, B, C. Elle est composée de 8 volumes de solution A, 1 volume de solution B et 1 volume de C.
Solution A:
-NaCl 8,00 g
– KCl 0,20 g
– Na2HPO4 1,15 g
-KH2PO4 0,20 g
– Les composants ci-desssus sont dissouts dans 800 ml d’eau bidistillée et sont mis sur agitation magnétique pendant 15 min.
– Le volume est complété jusqu’à 1000 ml avec de l’eau bidistillée puis le mélange est stérilisé à l’autoclave pendant 20 minà 120°C.
Solution B :
– 0,10 g de MgCl26H2O est dissout dans 100 ml d’eau bidistillée puis stérilisé à l’autoclave pendant 20 min à 120°C.
Solution C :
– 0.10 g de CaCl2 est dissout dans 100 ml d’eau bidistillée puis stérilisé à l’autoclave pendant 20 min à 120°C.
Ainsi pour avoir 1000 ml de PBS, 800ml de la solution A sont mélangés à 100ml de la solution B et 100ml de la solution C Puis, 20 ml de solution d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine) sont ajoutées à un volume de 1000 ml de PBS.
10ml de fungizone à 250 µg/ml est ensuite additionn é au mélange précédent. La solution de PBS peut être conservée à +4°C pendant 1 mois au plus.

TRAITEMENT DES SELLES

Dans des tubes Falcon de 15 ml bien étiquetés sontmis 10 ml de PBS, 1 ml de chloroforme, des billes de verre (2 si grandes ou 5 si petites) et 2 g de selle environ (de taille à peu près comme l’ongle du pouce) si so lide et environ 2 ml de suspension si liquide.
Le tout est bien mélangé au shaker pendant 20min à170 tours/min. Après une centrifugation pendant 20min à 1 500 g/min et à +4° C, le surnageant de selle est récupéré (extraits ou inoculum) dans des cryotubespréalablement étiquetés puis conservé à -20°C.

ISOLEMENT SUR CELLULES

PRINCIPE

L’isolement sur cellules des Entérovirus consiste à inoculer des extraits de selles dans des lignées cellulaires sensibles (RD et HEp-2c pour les Entérovirus et L20B pour les Poliovirus) à des fins de diagnostic par l ’observation d’un effet cytopathogène ou ECP qui se définit par des altérations métaboliques, biochimiques et morphologiques de la cellule hôte infectée par un virus. Chez les picornavirus, l’ECP se manifeste par un arrondissement, détachement puis lyse des groupes de cellules.

LIGNEES CELLULAIRES

Il s’agit de lignées constituées de cellules hétéroploides pouvant être subcultivées indéfiniment et ayant perdu l’inhibition de contact.
La lignée HEp2-c est issue d’un cancer humain, le carcinome du larynx. La lignée RD provient d’un Rhabdomyosarcome humain. La lignée L20B d’origine murine et génétiquement modifiée est rendue spécifique pour les PV par introduction dans son génome du gène CD155 codant pour un récepteur du poliovirus
(Thouvenot et al. 2004).

NUMERATION DES CELLULES OU COMPTAGE

Une petite quantité de suspension cellulaire est prélevée et diluée au demi avec du bleu trypan. 40 µl de ce mélange est monté entreune lamelle et une lame (cellule de Malassez) sur microscope pour le comptage des cellules généralement lues diagonalement sur 10 cases. Le nombre de cellules par case est ensuite calculé et la dilution sera faite en tenant compte des normes de concentration finale déjà établies d’après le tableau 1. A cette concentration, le tapis cellulaire sera confluent et donc prêt pour être inoculé en 48h pour les tubes de cturel ou en une semaine pour les flacons de 75cm2.
Enfin, la suspension cellulaire diluée est répartiedans les tubes de culture sous un volume de 1 ml/tube puis incubée à 36°C pendant 48h à 72h. Cette dilution de la suspension cellulaire pour le tube de culture est illustrée par l’exemple d’application numérique ci-après:
Exemple :
Le nombre de cellules RD comptées sur les 10 casesest égal à 60 cellules, soit, 6×105 cellules par case.
Or, le coefficient de dilution est égal à ½
Donc, la concentration initiale (Ci) est égale à 2 x 6×105 cellules/ml Pour le calcul du volume initial (Vi), d’après Ci x Vi = Cf x Vf Vi = Cf x Vf / Ci
Soit Vi= 5×104 / 12×105 = 5/120
Ainsi, 5 ml de suspension cellulaire sont ajoutés à 120 ml de milieu de croissance.

PASSAGE CELLULAIRE

Les lignées de cellules sont conservées sous formecongelée à -80°C ou dans de l’azote liquide à -180°C en présence de conserva teur constitué du milieu de croissance additionné de 20 à 30% de sérum et de 5 à 10% d’un agent cryoprotecteur qui est le diméthylsulfoxide (DMSO).
La concentration cellulaire doit être généralemententre 1,5 à 5 millions de cellules/ml pour une bonne conservation jusqu’à leu rs premières utilisations (Thouvenot et al. 2004).
Les cultures cellulaires peuvent se faire en fonction du besoin en cellules. 2 2

PREPARATION DU MILIEU DE CROISSANCE

Le milieu de croissance est composé principalement de Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), de 1% de L-Glutamine à 2 mM, de Pénicilline-Stréptomycine d’HEPES à 1M et de 5% et 10% du sérumde veau fœtal (SVF) pour la lignée HEp-2c et les RD, L20B respectivement.
Ce milieu de croissance est ensuite chauffé au bain-marie à 37°C.

PREPARATION DES CELLULES EN CULTURE SUR TUBES A FOND PLAT

Selon le même procédé de passage cellulaire décritdans le paragraphe II-1-2-4, autant de cellules en culture sur des tubes à fond plats que d’extraits de selles à inoculer sont préparés.
Ainsi, une culture cellulaire bien confluente cultivée généralement sur un flacon de 75cm2 est utilisée comme point de départ.
Elle est d’abord soumise à un lavage avec 2 × 10 ml de PBS. Un volume de 0,5 ml de solution de trypsine-versène est ajouté avantune incubation à 37°C afin de couper les liaisons cellulaires. Au bout d’une minute environ, la suspension cellulaire résultante est tapotée afin de bien séparer et décoller les cellules de la surface.
10 ml de milieu de croissance y sont ajoutés pour former la suspension cellulaire finale qui va être répartie dans les tubes à fond plat dans lesquels les virus vont être inoculés.

INOCULATION SUR CELLULES

L’intégrité des cellules est d’abord vérifiée sur icroscopem inversé afin de pouvoir valider les cellules pour l’inoculation. Les tubes sont ensuite identifiés en spécifiant les types de cellules, le nombre de passage et la date d’inoculation sans oublier d’assigner un tube témoin négatif (contrôle cellule).
Le milieu de croissance est jeté et remplacé par lemilieu de survie dont la composition et la quantité sont identiques à celles du milieu de croissance. De concentration plus faible, le milieu de survie maintient les cellules en vie mais ne leur permet plus de croître.
Par la suite, 0,2 ml de surnageant de selle est inoculé et mis en incubation dans l’étuve à 36°C.

SUIVI DES ECP

Après inoculation, le tube est contrôlé quotidiennement sur un microscope inversé pendant 5 jours pour observer d’éventuel ECP.
Si au bout des 5 jours, aucun ECP n’est apparu, les tubes seront congelés puis décongelés et 0,2 ml de ces surnageants seront inoculés dans de nouveaux tubes de culture. Une telle pratique est appelée « passage aveugle » (World Health Organization 2004)

Table des matières

I- INTRODUCTION
II- GENERALITES
II-1- SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LA POLIOMYELITE ET LE POLIOVIRUS
II-2- CARACTERISTIQUES DES POLIOVIRUS
II-3- MODE DE TRANSMISSION ET IMPLICATION
III- MATERIEL ET METHODES
III-1- ISOLEMENT SUR CELLULES
III-1-1- Traitement des selles
III-1-2- Isolement sur cellules
III-2- DIFFERENCIATION INTRA-TYPIQUE DES POLIOVIRUS
III-2-1- Principe
III-2-2- Technique de DIT
III-3- RT-PCR EN TEMPS REEL DES POLIOVIRUS DERIVES DES SOUCHES VACCINALES
III-3-1- Principe
III-3-2- Résultats attendus et interprétations
III-4- SEQUENÇAGE
III-4-1- Extraction du génome viral
III-4-2- Transcription inverse
III-4-3- Polymérase Chain Réaction (PCR) classique
III-4-4- Migration sur gel d’agarose (électrophorèse)
III-4-5- Correction et nettoyage des séquences
IV- RESULTATS
IV-1- CULTURE CELLULAIRE
IV-2- IDENTIFICATION DES POLIOVIRUS
IV-3- ANALYSE DES SEQUENCES
IV-4- ARBRE PHYLOGENETIQUE
V- DISCUSSIONS
VI- CONCLUSION ET PERSPECTIVES
VII- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE 1 : CARACTERISTIQUES DES AMORCES UTILISEES EN PCR EN TEMPS REEL POUR LA DIT
ANNEXE 2 : AMORCES UTILISEES EN PCR EN TEMPS REEL POUR LE TEST VDPV
ANNEXE 3 : APPAREILS UTILISES POUR LA PCR EN TEMPS REEL

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