Rôles de la Top1 dans la signalisation et réparation des dommages à l’ADN

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Rôle dans le développement embryonnaire

L’expression ectopique de RND1, par injection de l’ARN de RND1 dans des embryons de Xénope au stade 4 cellules, entraîne une perte de l’adhésion cellulaire au stade blastula. La surexpression de RhoA, par co-injection au stade 4 cellules, réverse cet effet (Wunnenberg-Stapleton et al., 1999). L’inhibition de RND1, par un antisens injecté à l’embryon de Xénope, induit une perte d’élongation de la notochorde pendant la gastrulation (Figure 15A), une perte d’élongation de la coiffe animale (Figure 15B) et une augmentation de l’adhésion cellulaire dépendante de la cadhérine (Figure 15C). Tous ces effets sont rétablis par injection de l’ARNm de RND1 (Figure 15 A, B et C) (Ogata et al., 2007). L’inhibition de l’adhésion cellulaire par RND1 est réalisée via la liaison avec la protéine transmembranaire FLRT3 (Fibronectin Leucine Rich Transmembrane 3), mais également avec le récepteur à la nétrine : Unc5B (Karaulanov et al., 2009; Ogata et al., 2007). L’interaction entre RND1 et FLRT3 inhibe l’adhésion cellulaire en diminuant le niveau de C-cadhérine présent à la surface de la cellule via l’internalisation de la C-cadhérine dans le cytosoplasme. En revanche, l’effet de l’interaction avec Unc5B sur l’internalisation de C-cadhérine n’a pas été exploré.
Figure 15 : Effets de RND1 sur le développement embryonnaire du Xénope. (A) Les cellules de la notochorde d’embryons de Xénope sont localisées par la technique d’hybridation in situ. L’inhibition de RND1 par injection d’un antisens (RND1 MO) entraîne la perte d’élongation de la notochorde. L’effet est rétabli par l’injection de l’ARNm de RND1.
(B) Explants de coiffes animales d’embryons de Xénope. L’injection RND1 MO bloque l’élongation des coiffes. L’effet est rétabli par l’injection de l’ARNm de RND1 (HA-RND1). (C) RND1 MO augmente l’adhésion des cellules du mésoderme dorsal de façon dépendante à la cadhérine. L’effet est inhibé par ajout de l’ARNm de RND1 (D’après Ogata et al., 2007).
Il a également été montré que RND1 joue un rôle dans la somitogenèse, processus permettant la différentiation et la segmentation des somites à partir du mésoderme. Dans ce mécanisme, RND1 est sous le contrôle de la voie Notch (Goda et al., 2009).

Rôle dans l’angiogenèse

L’expression de RND1 est induite par le facteur de croissance VEGF via l’interaction transitoire de NFATc1 avec le promoteur de RND1 dans les cellules endothéliales du cordon ombilical HUVEC. Cette induction permet de moduler l’activité de RhoA et ainsi de limiter l’angiogenèse (Figure 16). En effet dans les cellules HUVEC, l’inhibition de RND1 augmente l’activation de RhoA médié par VEGF. Cette hyperactivation entraîne une augmentation de la perméabilité de l’endothélium, de la migration et de la formation de néo-vaisseaux (Suehiro et al., 2014).

Expression de RND1 dans les tumeurs

L’expression de RND1 dans les cancers varie en fonction de l’origine de la tumeur, de son agressivité ou encore du stade de la maladie.
Deux premières études ont permis d’identifier RND1 comme potentiel gène suppresseur de tumeurs dans l’adénocarcinome du pancréas et le carcinome adénoïde kystique. En effet la région 12q12-q13 du chromosome 12 comprenant RND1 est fréquemment délétée dans ces cancers (Aguirre et al., 2004; Rutherford et al., 2005). Différentes analyses bioinformatiques menées par Okada et al. montrent qu’une plus faible expression de RND1 est retrouvée dans les cancers du sein les plus agressifs par rapport aux moins agressifs. De plus, cette baisse est associée à la formation de métastases (Okada et al., 2015). Dans 17% des carcinomes primaires du sein, la perte d’un allèle de RND1 a été observée. Cependant aucune délétion homozygote n’a été rapportée. Ainsi, l’inhibition de l’expression de RND1 ne dépend pas uniquement de mécanismes génétiques mais également épigénétiques. En effet, l’expression de RND1 dans les cancers du sein est réprimée par la méthylation de son promoteur (Okada et al., 2015). Néanmoins, les résultats sur l’expression de RND1 dans les cancers du sein divergent. En effet, Shen et al. ont montré que l’expression de RND1 est augmentée dans les lignées MDA-MB-231 et SK-BR-3 par rapport aux lignées MCF-10A et MCF-7 possédant un plus faible pouvoir métastatique (Shen et al., 2014). De plus, une ancienne étude avait rapporté une augmentation de l’ARNm de RND1 dans les tumeurs mammaires par rapport aux tissus sains (Jiang et al., 2003).
L’expression de RND1 est diminuée dans les carcinomes hépato-cellulaires (CHC) et cette baisse progresse avec le stade avancé de la maladie (Komatsu et al., 2017). De même que dans l’étude d’Okada et al., l’expression de RND1 est réprimée par la méthylation de son promoteur.
Contrairement aux cancers du sein et aux CHC où le promoteur de RND1 est hyperméthylé, celui-ci est hypométhylé dans les cancers gastriques. Par conséquence, l’ARNm de RND1 est augmenté dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux tissus sains (Nishigaki et al., 2005a).
RND1 est également surexprimée dans le carcinome épidermoïde de l’œsophage (CEO) (Xiang et al., 2016).
Par ailleurs, des analyses transcriptomiques montrent une inhibition de RND1 dans le glioblastome (Cf article 2).
Certaines mutations de RND1 ont été identifiées dans les cancers. Parmi 96 échantillons de cancers du sein, 4 mutations faux-sens dans la séquence de RND1 ont été rapportées (G70R, F180C, E98D, M185V). Ces mutations concernent des acides aminés hautement conservés au cours de l’évolution. Il a notamment été observé que les mutations G70R, F180C et E98D entraînent la perte de l’interaction entre RND1 et la plexine B1 (Okada et al., 2015). De plus, des analyses TCGA (The Cancer Genome Atlas) indiquent que RND1 est inhibée par mutation inactivatrice dans 3,9% des mélanomes (Okada et al., 2015).

Fonctions de RND1 dans les cancers

Dans la lignée MCF-10A de cellules épithéliales mammaires, l’inhibition de RND1 par shRNA (short hairpin RNA) entraine le processus de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) via l’internalisation et l’inhibition de la E-cadhérine (E-cad) ainsi que la surexpression de la N-cadhérine (N-Cad). L’effet de RND1 sur l’EMT dépend de sa liaison avec la plexine B1. Cette liaison entraîne l’activation du domaine GAP de la plexine et l’inhibition de la signalisation de Ras via l’inhibition de l’activation de la protéine Rap1 (Figure 17). De plus, l’inhibition de RND1 permet l’activation de la réponse aux dommages à l’ADN observée par l’augmentation de Chk2 et de la forme phosphorylée de H2AX (γH2AX). Par ailleurs, l’inhibition de RND1 entraîne une hyperprolifération transitoire des cellules puis l’arrêt précoce du cycle cellulaire et la sénescence des cellules via l’induction de p27. Cependant, certaines cellules déplétées pour RND1 résistent à la sénescence en surexprimant c-Myc ce qui permet d’inhiber p27. L’expression de Myc confère alors à ces cellules des propriétés hyperprolifératives et invasives.
In vivo, RND1 inhibe l’initiation mais également la progression tumorale. Des cellules épithéliales mammaires, Comma-D, non tumorigènes déficientes en RND1 par shRNA ont été injectées à des souris. L’inhibition de RND1 dans ces cellules leur a permis d’acquérir des propriétés liées à l’EMT et a entraîné la formation de tumeurs chez la souris (Figure 18A). De plus, l’injection à des souris de cellules tumorales mammaires 4T1 surexprimant RND1 mène à un retard de croissance de la tumeur primaire (Figure 18B) ainsi que diminue la formation de métastases dans les poumons (Figure 18C) (Okada et al., 2015).
Figure 18 : Effets de RND1 l’inhibition de la tumorigenèse mammaire et la formation de métastatses. (A) Les cellules épithéliales mammaires Comma-D transduites avec un lentivirus Shtrl ou deux ShRND1 ont été injectées à des souris. Le volume de la tumeur a été mesuré aux temps indiqués. (B et C) Les cellules tumorales mammaires 4T1 transfectées avec un plasmide contrôle ou un plasmide HA-RND1 ont été injectées à des souris. Le volume de la tumeur a été mesuré aux temps indiqués (B). Image représentative d’une coupe histologique de poumons et quantification de la présence de métastases pulmonaires dans les souris injectées avec le plasmide contrôle vs. RND1 (C) (D’après Okada et al., 2015).
A l’inverse, dans la lignée du cancer du sein MDA-MB-231, l’expression ectopique de RND1 entraîne l’augmentation de la migration et l’invasion des cellules. Dans cette même lignée, l’inhibition de RND1 par shRNA induit l’expression de la E-cad. Dans ce modèle, l’expression de RND1 permet de réverser les effets inhibiteurs du facteur de transcription Oct4 sur le processus métastatique (Shen et al., 2014). Ainsi, le rôle de RND1 dans le cancer du sein est controversé. L’inhibition de RND1 par siRNA dans des lignées d’HCC augmente la prolifération et l’invasion des cellules (Komatsu et al., 2017). De même que dans l’étude d’Okada et al., l’expression de RND1 est inversement corrélée aux taux des protéines Ras et c-Myc.
La surexpression de RND1 dans deux lignées de CEO : KYSE150 et KYSE180 entraîne une augmentation de la croissance cellulaire et de la migration via notamment l’activation de la voie ERK. In vivo, l’inhibition de RND1 dans des cellules KYSE180 injectées à des souris diminue la formation de métastases (Xiang et al., 2016).
Ces données rapportent un rôle pro-tumoral ou anti-tumoral de RND1 en fonction du contexte cellulaire.
Récemment, une étude effectuée en collaboration avec l’équipe du Pr E. Cohen-Jonathan Moyal et du Dr C. Toulas du CRCT s’est intéressée au rôle de RND1 dans le glioblastome (Cf article 2). La récidive dans le traitement du glioblastome pourrait s’expliquer par la présence de cellules souches tumorales de glioblastome (CSG) dans la zone périventriculaire du cerveau (ZPV). Ces cellules sont dotées d’une capacité migratoire supérieure à celles situées dans la zone corticale (ZC). Une expression plus faible de RND1 est retrouvée dans les CSG ZPV en comparaison aux CSG ZC. La surexpression de RDN1 dans les CSG ZPV inhibe leur migration. Ce travail permet de souligner le rôle anti-tumoral de RND1 dans le glioblastome.

Facteur pronostique

RND1 a été nouvellement identifié comme biomarqueur prédictif de la maladie dans les CHC (Komatsu et al., 2017), les glioblastomes (Cf article 2) et les cancers du sein ER-, c’est-à-dire n’exprimant pas le récepteur aux œstrogènes (Okada et al., 2015). Dans ces tumeurs, une faible expression de RND1 est associée à un mauvais pronostic.
Cependant, une ancienne étude avait rapporté qu’une augmentation de l’expression de RND1 dans les cancers du sein était associée à l’avancement du stade de la malade et également à une rechute des patients (Jiang et al., 2003). Ces données confirment le double rôle de RND1 dans le cancer du sein.

Effet de RND1 sur la sensibilité des cellules aux anticancéreux

Il existe actuellement peu de données relatant l’effet de l’expression de RND1 sur la sensibilité des cellules aux cytotoxiques. Il a uniquement été rapporté que l’inhibition de RND1 par siRNA induit la résistance des cellules d’HCC au traitement par le cisplatine (Komatsu et al., 2017).

La topoisomérase I nucléaire (Top1)

Organisation structurale de Top1

Le gène TOP1 humain, localisé au niveau du chromosome 20q11.2-13.11, code pour une protéine de 91 kDa subdivisée en 4 domaines distincts (Figure 20) (Champoux, 2001; Redinbo et al., 1998; Stewart et al., 1996) :
– le domaine N-terminal : Ce domaine est le plus variable et n’est pas essentiel pour l’activité de relaxation in vitro (Stewart et al., 1997). Il contient plusieurs signaux de localisation nucléaire et des sites de liaison à différentes protéines comme certains facteurs de transcription (TBP : TATA-binding protein, p53…) et WRN (Werner Syndrome RecQ Like Helicase).
– le domaine central (Core) : Ce domaine, hautement conservé, est nécessaire à l’activité enzymatique de la Top1. Il est formé de trois sous-domaines qui encerclent la molécule d’ADN comme une pince. La première moitié de la pince comprend les sous-domaines I et II. L’autre moitié est composée du sous-domaine III contenant la totalité des résidus requis pour l’activité catalytique de la Top1, à l’exception de la tyrosine catalytique.
– le domaine Linker : Comme pour le domaine N-ter, il n’est pas requis pour l’activité de la Top1 in vitro. Il permet de relier le sous-domaine III au domaine C-ter. Sa localisation parallèle à la molécule d’ADN lui permet de contrôler la rotation du brin clivé pendant l’étape de relaxation.
– le domaine C-terminal : Ce domaine est le plus conservé. Il contient la tyrosine kinase catalytique T723 permettant la liaison covalente avec l’extrémité 3’ du brin coupé, étape nécessaire à la relaxation des surenroulements de l’ADN.
Figure 20 : Schéma des domaines et structure 3D de la Top1 nucléaire humaine. (A) Organisation des 4 domaines de la protéine Top1 constituée de 765 acides aminés. Le domaine core est divisé en 3 sous-domaines. Les 5 acides aminés nécessaires à l’activité catalytique de la Top1 sont indiqués. Quatre sont situés au niveau du sous-domaine III (Arg488, Lys532, Arg590 et His632) et la tyrosine catalytique (Tyr723) se trouve en C-ter. (B) Structure cristallographique du complexe Top1-ADN. Le brin d’ADN clivé est représenté en violet, celui qui est intact est en marron. Les domaines core et C-ter forment une pince autour de la molécule d’ADN. Ces deux domaines sont reliés par le domaine linker, situé parallèlement à l’ADN. Le résidu tyrosine catalytique 723 forme la liaison covalente au brin d’ADN clivé. Le brin coupé peut alors effectuer une rotation autour du brin intact (D’après Capranico et al., 2017).

Cycle catalytique

Le cycle catalytique de la Top1 est divisé en quatre étapes (Figure 21) :
1) Liaison non covalente de la Top1 à l’ADN : La Top1 se lie préférentiellement sur l’ADN surenroulé (Camilloni et al., 1988; Krogh et al., 1991). Même si la Top1 ne reconnait pas de séquences spécifiques sur l’ADN, elle lie l’ADN au niveau de sites « privilégiés » contenant le motif : 5’- (A/T) (G/C) (A/T) T -3’. Le dernier résidu thymine correspond au site de clivage de la Top1 (Jaxel et al., 1991). Au moment de la liaison, la Top1 s’enveloppe autour de l’ADN en formant une pince (Redinbo et al., 1998).
2) Clivage d’un brin d’ADN : la Top1 coupe un brin de la double hélice par réaction de transestérification qui permet la formation d’un lien covalent entre la tyrosine catalytique (Tyr723) et l’extrémité 3’ du brin clivé (Champoux, 1981). Le complexe covalent transitoire ADN-Top1 est appelé complexe de clivage (Top1cc).
3) Rotation contrôlée : La suppression d’un supertour d’ADN est obtenue via la rotation du brin clivé en aval du complexe autour du brin intact. Cette relaxation se déroule selon un mécanisme de « rotation contrôlée » (Stewart et al., 1998). En effet, la rotation est ralentie par des frictions entre l’ADN et la cavité de l’enzyme (Koster et al., 2005).
4) Religation : La continuité du brin d’ADN est restaurée après religation de la cassure par réversion de la liaison covalente. Ce mécanisme résulte de la réaction inverse de transestérification via attaque de la liaison Top1-ADN 3’tyrosyl phosphodiester par l’extrémité 5’-OH libre du brin clivé (Stewart et al., 1998). La Top1 est alors dissociée de l’ADN.
Dans les conditions normales, l’étape de religation est favorisée. De ce fait, les Top1cc sont transitoires et peu détectables. De plus, l’activité de la Top1 est très rapide (environ 6000 cycles catalytiques / minute) (Seol et al., 2012).

Fonctions biologiques de la Top1

L’activité de la Top1 est essentielle pour la réplication, la transcription, la réparation de l’ADN, le modelage de la chromatine ou encore l’assemblage des nucléosomes.

Relaxation des surenroulements de l’ADN au cours de la réplication et de la transcription

Le rôle principal de la Top1 consiste à maintenir l’ADN dans un état topologique relaxé en supprimant les surenroulements générés pendant la transcription et la réplication (Wang, 2002). La Top1 peut relaxer les surenroulements à la fois positifs et négatifs avec toutefois une préférence pour les surenroulements positifs (McClendon and Osheroff, 2006). De par ce rôle, la Top1 va impacter la réplication et la transcription.

Réplication

La Top1 est localisée aux origines de réplication (Abdurashidova et al., 2007; Falaschi, 2009). L’initiation de la réplication nécessite la séparation des brins parentaux de l’ADN. Des surenroulements négatifs sont générés aux origines de réplication. Des surenroulements positifs surviennent devant les fourches de réplication situés à proximité de régions où l’ADN n’est pas libre de tourner puisqu’il est rattaché à une barrière dite « topologique » comme par exemple des sites d’attachements à la matrice nucléaire. Ces surenroulements positifs sont supprimés par la Top1, ce qui permet la progression de la fourche de réplication (Figure 22) (Pommier et al., 2016b). L’élongation de la réplication génère la formation de surenroulements positifs (dans le sens de la double hélice) et négatifs (dans le sens inverse) devant et derrière la fourche de réplication respectivement (Pommier et al., 2016b; Wang, 2002). Ces surenroulements sont enlevés par la Top1 (Figure 22). Le chargement de la Top1 près de la fourche est facilité par le complexe de remodelage de la chromatine BAZ1B-SMARCA5 (Bromodomain adjacent to zinc finger domain 1B – SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin A5) (Ribeyre et al., 2016). Dans les cellules HCT116, la déplétion de la Top1 par ShRNA entraîne un ralentissement de la progression de la fourche de réplication (0.7 kb/min dans les HCT116 shTop1 vs 1.1 kb/min dans les HCT116 ShCtrl) et une augmentation de son nombre de pauses ou d’arrêts (Tuduri et al., 2009). Cependant, les cellules HCT116 ShTop1 compensent ces effets inhibiteurs sur l’élongation en augmentant l’initiation de la réplication (Tuduri et al., 2009).
Figure 22 : Rôles de la Top1 dans la réplication. (A) La Top1 supprime les surenroulements positifs (Sc+) lors de l’initiation de la réplication. (B) La Top1 enlève les surenroulements positifs (Sc+) et négatifs (Sc-) situés respectivement devant et derrière la fourche de réplication pendant l’étape d’élongation de la réplication. (D’après Pommier et al., 2016b).

Transcription

Chez la levure, l’absence seule de la Top1 ou de la Top2 n’a pas d’effet sur la transcription des ARNm (ARN messager) et des ARNr (ARN ribosomique) tandis que leur absence concomitante induit une diminution drastique de la synthèse des ARNm et des ARNr (Brill et al., 1987). La Top1 est préférentiellement associée aux gènes hautement transcrits (Khobta et al., 2006; Kroeger and Rowe, 1992; Zhang et al., 1988). La fonction principale de la Top1 dans la transcription est d’enlever les surenroulements crées au cours de l’élongation par son rôle dans la relaxation (Figure 23). Outre cette fonction dépendante de son activité catalytique, la Top1 régule la transcription des ARNm eucaryotes par d’autres mécanismes (Figure 23).

Table des matières

INTRODUCTION
I. La GTPase Rho RND1
I.1. Les GTPases Rho
I.1.1. Organisation phylogénétique
I.1.2. Structure des GTPases Rho
I.1.3. Régulation des GTPases Rho « classiques »
I.1.4. Fonctions biologiques des GTPases Rho
I.1.4.1 Fonctions classiques
I.1.4.2 Rôle dans la réponse aux génotoxiques et à l’hypoxie
I.2. La GTPase RND1
I.2.1. La famille des RND
I.2.1.1 Identification de la famille RND
I.2.1.2 Structure des protéines RND
I.2.2. Expression et localisation de RND1
I.2.2.1 Expression tissulaire et cellulaire de RND1
I.2.2.2 Localisation cellulaire de RND1
I.2.3. Régulation de l’expression de RND1
I.2.3.1 Régulation transcriptionnelle et post transcriptionnelle
I.2.3.2 Régulation post-traductionnelle
I.2.4. Fonctions biologiques de RND1
I.2.4.1 Régulation de la morphologie cellulaire et du cytosquelette d’actine
I.2.4.2 Formation des connexions nerveuses
I.2.4.3 Rôle dans le développement embryonnaire.
I.2.4.4 Rôle dans l’angiogenèse
I.2.4.5 RND1 et cancer
II. Les inhibiteurs de la topoisomérase I
II.1. Les ADN topoisomérases
II.2. La topoisomérase I nucléaire (Top1)
II.2.1. Organisation structurale de Top1
II.2.2. Cycle catalytique
II.2.3. Fonctions biologiques de la Top1
II.2.3.1 Relaxation des surenroulements de l’ADN au cours de la réplication et de la transcription
II.2.3.2 Rôles de la Top1 dans la signalisation et réparation des dommages à l’ADN
II.3. Les inhibiteurs de la topoisomérase I
II.3.1. Les inhibiteurs camptothécines
II.3.2. Inhibiteurs non CPT
II.4. Conséquences cellulaires de la CPT
II.4.1. Effets sur la réplication
II.4.2. Effets sur la transcription
II.4.3. Réparation des Top1cc irréversibles induits par la CPT
II.4.4. Production de DSB réplicationnelles et transcriptionnelles
II.4.4.1 DSB réplicationnelles
II.4.4.2 DSB transcriptionnelles
II.4.5. Conséquences cellulaire des DSB induites par la CPT
II.4.5.1 Activation de la DDR en réponse aux DSB induites par la CPT
II.4.5.2 Réparation des DSB induites par la CPT
II.4.5.3 Apoptose induite par la CPT
III. La protéine PARP1
III.1. Famille PARP et PARylation
III.1.1. PARylation
III.1.2. Mécanismes de la liaison du PAR sur les protéines
III.1.2.1 Le motif PBM
III.1.2.2 Le domaine macro
III.1.2.3 Le domaine PBZ
III.1.2.4 Le domaine WWE
III.1.3. Catabolisme de PAR
III.1.4. Classifications des PARP
III.1.4.1 Les PARP ADN-dépendantes
III.1.4.2 Les tankyrases
III.1.4.3 Les PARP à doigt de zinc de type CCCH
III.1.4.4 Les macro-PARP
III.1.4.5 Les autres PARP
III.2. Les fonctions biologiques de PARP1
III.2.1. Rôles de PARP1 dans la réparation des dommages à l’ADN
III.2.1.1 Rôles de PARP1 dans la réparation des lésions simple-brin de l’ADN
III.2.1.2 Rôles de PARP1 dans la réparation des DSB
III.2.2. Rôles de PARP1 dans le remodelage de la chromatine
III.2.2.1 Action directe de PARP1 sur la chromatine
III.2.2.2 Action indirecte de PARP1 sur la chromatine
III.2.3. Rôles de PARP1 dans la transcription
III.2.3.1 En l’absence de dommages de l’ADN
III.2.3.2 Au niveau du dommage de l’ADN
III.2.4. Rôles de PARP1 dans la stabilisation de l’ARNm
III.2.5. Rôles de PARP1 dans la réplication
III.3. Inhibiteurs de PARP
III.4. Utilisation thérapeutique des inhibiteurs de PARP dans les cancers
III.4.1. Association à la chimiothérapie et à la radiothérapie
III.4.2. Létalité synthétique
III.4.3. La résistance aux inhibiteurs de PARP
III.5. Liens entre PARP1 et Top1
OBJECTIFS
RESULTATS
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE

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