Soutenance mémoire
Rôles de la dégradation des protéines et importance du système Ubiquitine-Protéasome
La dégradation intracellulaire des protéines est un processus fondamental qui a lieu dans tous les organismes, depuis les bactéries jusqu’aux êtres humains. L’idée que tous les composants de la matière vivante, en particulier les protéines, sont dans un état perpétuel de renouvellement, n’est apparue qu’avec Schoenheimer (Schoenheimer & Clarke, 1942). Selon la théorie de Schimke (Schimke, 1970), la dégradation continuelle des protéines est nécessaire pour réguler les concentrations intracellulaires des enzymes qui contrôlent toutes les réactions métaboliques, ainsi que le contenu général de toutes les autres protéines, en réponse aux modifications physiologiques. La protéolyse intracellulaire est au cœur de la fonction des cellules et est vitale pour la capacité des cellules à s’adapter aux changements environnementaux. Bien que la plupart des protéines cellulaires soient habituellement stables, il y a certaines protéines spécifiques qui ont un taux de dégradation élevé, y compris celles impliquées dans des régulations métaboliques, dans la transcription, la division cellulaire, la différentiation et la réparation de l’ADN (Maupin-Furlow 2000). Lorsque ces taux de dégradation sont couplés avec un contrôle de la transcription, les cellules sont capables de répondre efficacement aux changements en modifiant rapidement la concentration d’enzymes à des moments et à des endroits précis dans la cellule. Non seulement les protéines ‘normales’ sont spécifiquement ciblées pour l’hydrolyse, mais aussi les protéines anormales mal repliées par les chaperonnes sont également éliminées (Goldberg, 1972). Les protéines anormales comprennent celles récemment synthétisées et qui ne se replient pas correctement ainsi que les protéines qui s’accumulent dans la cellule après exposition à un choc thermique ou des dommages oxydatifs. Elles comprennent aussi les protéines produites avec des erreurs pendant la transcription ou la traduction, par des mutations génétiques ou des dommages de l’ARN (Goldberg, 2003). Les sous-unités des complexes protéiques sont eux aussi souvent des cibles de dégradation dans le cas des perturbations dans leur stœchiométrie . Les systèmes protéolytiques jouent également un rôle important dans l’augmentation globale de l’hydrolyse de la plupart des protéines pendant le besoin des cellules à reconstituer leur stock en acides aminés. Au cours de la vie d’une cellule, quasiment toutes ses protéines sont plusieurs fois renouvelées par dégradation et resynthèse, le processus de dégradation est hautement sélectif et étroitement régulé (Glickman & Ciechanover, 2002), et les protéines sont détruites à des vitesses de « turnover » très différents d’une à l’autre, avec des demi-vies allant de quelques minutes jusqu’à plusieurs jours (Goldberg, 2003). Dans le foie de rat, par exemple, certaines protéines ont une demi-vie de l’ordre de dix minutes et d’autres ont une demi-vie d’un mois (Schimke, 1968).
Des modifications structurales des protéines conduisent à une dégradation plus rapide. La capacité des cellules à dégrader sélectivement les protéines mal-repliées a été démontrée pour la première fois il y a plus de 40 ans (Goldberg, 1972) avec la découverte que les divers traitements qui perturbent le repliement correct des protéines causent leur hydrolyse rapide. Ces résultats ont conduit au constat que la structure des protéines ne détermine pas seulement leurs propriétés catalytiques mais aussi leurs stabilité intracellulaire (Goldberg, 1974).
Une des caractéristiques des protéines dénaturées est qu’elles s’agrègent et quittent la solution (en raison de la tendance des domaines hydrophobes à s’associer entre eux). De même, lorsque la production des protéines mal repliées dépasse la capacité de dégradation de la cellule, ces polypeptides forment souvent des agrégats intracellulaires avant leur dégradation rapide (Sherman & Goldberg, 2001) (Klemes et al, 1981) (Prouty, 1972). La formation de ces corps d’inclusions se produit lorsque les systèmes protéolytiques de la cellule ainsi que les chaperonnes moléculaires, qui normalement empêchent l’agrégation (par exemple Hsp 70/40) (Frydman, 2001) (Hartl & Hayer-Hartl, 2002) ou resolubilisent (Hsp 104) (Glover & Lindquist, 1998) les microagrégats, ne peuvent pas faire face au taux de production des molécules dépliées. Des corps d’inclusions similaires se retrouvent dans divers maladies neurodégénératives, dans lesquelles ces inclusions sont ubiquitinés et physiquement associés aux protéasomes (Sherman & Goldberg, 2001), suggérant fortement un échec dans la machinerie dégradative de la cellule (Sherman & Goldberg, 2001). Lorsque les cellules mammifères sont traitées avec des inhibiteurs du protéasome, ces inclusions apparaissent rapidement, ce qui indique que plusieurs substrats du protéasome dans les cellules normales sont des protéines mal repliées (Sherman & Goldberg, 2001). Si la production de telles protéines anormales s’arrête et la dégradation est normalement procédée, toutes les cellules, des bactéries (Prouty, 1972) jusqu’aux neurones (Yamamoto et al, 2000) peuvent éliminer les inclusions protéiques. Les mécanismes des cellules mammifères pour la solubilisation et la digestion de ces protéines ne sont pas connus, et une meilleure compréhension de ce processus pourrait avoir des applications thérapeutiques pour diverses maladies liées aux protéines mal repliées.
La dégradation spécifique des protéines intracellulaires est assurée par des machines protéolytiques qui séquestrent des sites actifs pour le clivage des liaisons peptidiques dans une chambre protégée. Ces enzymes sont connues en tant que protéases AAA+, en raison de la présence d’un complexe AAA+ unfoldase qui reconnait les substrats spécifiques et utilise l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP pour déplier mécaniquement la protéine cible et assure sa translocation dans la chambre de dégradation (Olivares et al, 2016). Les protéases AAA+ existent chez les bactéries (ClpXP, ClpAP, HslUV), chez les archées (PAN, Cdc48) ainsi que chez les eucaryotes (les Rpt 1-6 du protéasome 26S). Chez les eucaryotes, l’un des acteurs majeurs de la protéolyse intracellulaire est un système multi-enzymatique sophistiqué, le système Ubiquitine/Protéasome (Finley et al, 2012), qui fonctionne en deux grandes étapes . Le substrat est d’abord « marqué » par conjugaison covalente de chaînes d’ubiquitine (Ub), une petite protéine ubiquitaire très conservée de 76 acides aminés, grâce à une cascade enzymatique spécialisée. Ces chaînes permettent ensuite la reconnaissance et la dégradation des molécules polyubiquitinylées par un complexe protéolytique de 2 000 kDa, le protéasome 26S. La spécificité et l’efficacité du système Ub/Protéasome découlent de ce fonctionnement en deux temps. En effet, la multiplicité des enzymes d’ubiquitination permet une grande précision dans la reconnaissance des substrats. A l’inverse, le dénominateur commun représenté par la chaîne de poly-Ub simplifie le problème de la reconnaissance de la multitude des protéines dégradées par le protéasome 26S.
Intérêt des archées hyperthermophiles pour l’étude du système protéolytique
Liens des archées avec les eucaryotes
Il existe de nombreuses fonctionnalités qui sont spécifiques pour les eucaryotes et peuvent être retracées jusqu’au dernier ancêtre eucaryote commun (LECA, « last eukaryotic common ancestor ») , comme le noyau, le système endomembranaire (Bapteste et al, 2005), la mitochondrie (Embley & Martin, 2006), les introns du spliceosome (William Roy & Gilbert, 2006), les chromosomes linéaires avec des télomères synthétisés par des télomérases (Nakamura & Cech), le sexe méiotique (Ramesh et al, 2005), la synthèse du stérol (Desmond & Gribaldo, 2009), structure de la cytokinèse (Eme et al, 2009), et la capacité de la phagocytose (Jékely, 2003). Cependant, le « timing », les mécanismes et l’ordre des événements qui ont conduits à ces caractéristiques cellulaires et génétiques clés ne sont pas clairs. Par conséquent, connaître l’origine de la lignée ancestrale menant au LECA est une question clé.
Depuis leur découverte il y a 30 ans, les archées ont été montrées pour avoir un lien dans l’évolution avec les eucaryotes (Gribaldo et al, 2010). En particulier, de nombreux composants d’archée des systèmes impliqués dans la transmission et l’expression de l’information génétique (traduction, réplication et transcription, également appelés « systèmes d’informations ») montrent une similarité de séquence élevée avec leurs homologues eucaryotes qu’avec leurs homologues bactériens, et dans plusieurs cas sont absents chez les bactéries. Par exemple, plus de 30 protéines ribosomiques sont spécifiquement partagées entre les archées et les eucaryotes mais ne sont pas présentes chez les bactéries (Lecompte et al, 2002), et de nombreux facteurs de traduction chez les archées montrent une similitude avec leurs homologues eucaryotes (Londei, 2005). Les ARN polymérases des archées sont très liées à leurs homologues eucaryotes, en termes de composition en sous-unités et de structures (Werner, 2008), et utilisent des promoteurs très similaires et des facteurs de transcription basals pour l’initiation (Bell et al, 2001). Enfin, les quatre activités principales impliquées dans la réplication de l’ADN- l’initiation à l’origine, l’amorçage des fragments d’Okazaki, la synthèse des nouveaux brins et la séparations des brins de l’ADN- sont effectuées par des ensembles d’enzymes qui sont partagées entre les archées et les eucaryotes mais ne sont pas homologues avec les systèmes bactériens (Leipe et al, 1999). Un certain nombre de découvertes chez les archées ont confirmé le lien dans l’évolution de leurs systèmes d’informations avec ceux des eucaryotes, telles que la présence de petits ARN nucléolaires qui modifient l’ARN ribosomal (Omer et al, 2000), un exosome (pour la maturation et la dégradation de l’ARN) avec une grande similitude avec son homologue eucaryote (Hartung & Hopfner, 2009) et des histones semblables aux eucaryotes (Čuboňová et al, 2005). Plusieurs ‘systèmes opérationnels’ (systèmes impliqués dans les fonctions de «housekeeping ») semblent également être partagés entre archées et eucaryotes, y compris les ATPases vacuolaires (Gogarten et al, 1989), le système protéolytique (UbiquitineProtéasome chez les eucaryotes et SAMP-PAN-Protéasome chez les archées), les voies de sécrétions (Gribaldo & Brochier-Armanet, 2006) ainsi qu’un système de division cellulaire chez les archées récemment identifié et qui présente une homologie au complexe de « sorting » endosomal chez les eucaryotes (Lindås et al, 2008).
En outre, les archées et les eucaryotes peuvent avoir un lien évolutif dans leurs systèmes métaboliques (Armengaud et al, 2003; Maupin-Furlow, 2011). Cependant, les archées ont également de nombreuses caractéristiques spécifiques. Notamment, les membranes sont constituées par des lipides liés avec des liaisons éther, la liaison glycérol-phosphate a une stéréochimie opposée (glycérol-1-phosphate) par rapport à celles qu’on trouve chez les bactéries et les eucaryotes (glycérol-3-phosphate) et est également synthétisée par une enzyme non liée (Peretó et al, 2004). Les archées ont également des métabolismes uniques tels que la méthanogénèse (Bapteste et al, 2005), des enzymes uniques telles que les topoisomérases spécifiques de l’ADN (Forterre et al, 2007) et les ADN polymérases (Ishino et al, 1998) ainsi que des structures uniques de la surface cellulaire (Ng et al, 2008).
|
Table des matières
1 INTRODUCTION
Avant-propos
Rôles de la dégradation des protéines et importance du système UbiquitineProtéasome
Intérêt des archées hyperthermophiles pour l’étude du système protéolytique
1.3.1 Liens des archées avec les eucaryotes
1.3.2 Intérêt des systèmes issus des archées hyperthermophiles pour l’étude des grands assemblages de la protéolyse
1.3.3 Présentation des archées d’origine des protéines étudiées dans la thèse
Présentation des systèmes protéasomes archéens et eucaryotes
1.4.1 Description générale (eucaryotes/archées)
1.4.2 Les complexes 20S (eucaryotes/archées)
1.4.3 Les systèmes d’adressage aux protéasomes (ubiquitination et sampylation)
1.4.4 Les complexes de régulation du protéasome
Structure et fonction des AAA+ protéolytiques régulatrices du protéasome
1.5.1 Diversité des AAA+
1.5.2 Les AAA+ ATPases protéolytiques
1.5.3 Structure des AAA+ ATPases protéolytiques
1.5.4 Mode d’action des unfoldases AAA+
Le complexe AAA+ PAN des archées : une version simplifiée du 19S des eucaryotes
Problématiques et objectifs de la thèse
1.7.1 Objectif 1: étude structurale et fonctionnelle du complexe PAN héxamérique
1.7.2 Objectif 2 : développement d’une approche de diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) en temps réel pour étudier le processus de dépliement des protéines par les complexes AAA+ ATPases
2 DIFFUSION DE NEUTRONS AUX PETITS ANGLES (SANS)
Théorie
2.1.1 Le neutron
2.1.2 Interaction neutron-noyau et section efficace
Diffusion de neutrons aux petits angles en mode statique et variation de contraste
Diffusion de neutrons aux petits angles en temps réel et combinaison avec la spectroscopie de fluorescence en ligne
2.3.1 Instrumentation
2.3.2 Démarche expérimentale
2.3.3 Réduction et interprétation des données
Intérêt de la technique SANS dans le cas de notre projet
3 MATERIELS ET METHODES BIOPHYSIQUES
Résonance Plasmon de Surface (SPR)
3.1.1 Théorie
3.1.2 Démarche expérimentale
3.1.3 Interprétation des données
Microscopie électronique
3.2.1 Coloration négative
3.2.2 Cryo-microscopie électronique
3.2.3 Analyse des données microscopie électronique
Diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS)
3.3.1 Démarche expérimentale
3.3.2 Interprétation des données
4 MATERIELS ET METHODES BIOCHIMIQUES
Expression et purification des protéines hydrogénées
4.1.1 Synthèse des gènes, clonage et transformation
4.1.2 Expression
4.1.3 Purification et hexamérisation
Expression et purification des protéines deutérées
4.2.1 Adaptation des bactéries et culture par fermentation
4.2.2 Purification et hexamérisation
Activité enzymatique
4.3.1 Dépliement de la GFPssrA par PhPAN et MjPAN
4.3.2 Optimisation des conditions de dépliement
5 RESULTATS
Etude structurale et fonctionnelle du complexe de régulation du protéasome de l’archée Pyrococcus horikoshii
5.1.1 Présentation du travail
5.1.2 Structure of the assembled PAN unfoldase reveals new insights into the molecular architecture and mode of action of proteasome regulatory ATPases
5.1.3 Discussion et perspectives
Etude des mécanismes de dépliement et de dégradation des protéines par le système PAN-Protéasome de l’archée Methanocaldococcus Jannaschii : mise au point d’une approche en temps réel par diffusion de neutrons aux petits angles
5.2.1 Présentation du travail
5.2.2 Small angle neutron scattering reveals protein substrate processing by a AAA+ unfoldase at real-time
5.2.3 Discussion et perspectives
6 CONCLUSIONS GENERALES
