Soutenance mémoire
Rôles biologiques et pathologiques des EVs
Les exosomes sont présents en grande quantité (environ 3.106 exosomes/mL de sérum [32]) dans les fluides biologiques, participent à la communication intercellulaire et entrent en jeu dans les processus physiologiques. Les exosomes peuvent alors avoir plusieurs rôles biologiques selon leur origine cellulaire. Ainsi, la sécrétion des exosomes peut être vue comme un mécanisme de nettoyage des cellules permettant de se débarrasser de cargaisons non utiles. Cette sécrétion peut permettre la propagation d’agents pathogènes tels que des prions ou des virus dans l’organisme. Il a été démontré que les exosomes, peuvent déclencher des signalisations et délivrer une cargaison de miARN dans ces cellules. Grâce à cette interaction particulière et ciblée, les exosomes permettent de jouer un rôle de messager entre les cellules distantes les unes des autres dans l’organisme. Dans le cas de pathologies, comme le cancer, les exosomes peuvent ainsi transmettre les oncogènes (secrétés par les cellules tumorales) à des cellules saines et ainsi engendrer le transfert de la maladie [36]. De par leur rôle de transporteur d’information et par leur capacité à transférer des messages à travers les membranes cellulaires d’une cellule à l’autre, il est possible d’imaginer le potentiel intéressant que peuvent avoir les exosomes d’un point de vie thérapeutique. En effet, les exosomes permettraient de cibler spécifiquement des cellules et pourraient servir de traitement local sur ces cellules cibles, bloquant ainsi la migration et la prolifération des cellules tumorales. En connaissant la composition des différents fluides biologiques (en protéines, acides nucléiques, lipides, etc …), les exosomes pourraient donc servir de biomarqueurs de nombreuses maladies et ainsi permettrait de surveiller de l’état de santé en fournissant des informations cliniques précoces d’un patient. Ils pourraient servir de diagnostic plus rapide et entrer en jeu dans des aspects thérapeutiques de nombreuses pathologies. Ainsi, un prélèvement de sang, de salive ou d’urine serait la meilleure alternative aux biopsies actuelles, invasives pour le patient [37].
Tout comme les exosomes, les microvésicules, après être libérées de leur cellule hôte et vont pouvoir se déplacer et transporter leur contenu à d’autres cellules distantes. Elles rentrent donc en jeu, tout comme les exosomes, dans la communication entre cellules. Des microvésicules isolées du sang ont permis de mettre en évidence le rôle des microvésicules dans diverses pathologie (cardiovasculaire, cancer, …) .
Une société internationale regroupant plus de 700 membres a été créé « Société Internationale des EVs (ISEV) » [38] dans le but de diffuser les connaissances, contribuer à la compréhension et à la recherche, générer un intérêt de la part du grand public pour les EVs.
Les techniques de purification et d’isolement des EVs
Les EVs sont contenues dans les fluides biologiques [39] et les liquides complexes contenant d’autres espèces moléculaires et cellulaires (cellules, débris membranaires, protéines, etc…). Il est donc délicat, dans ces milieux , de les distinguer de façon exacte.
Méthode de purification par la taille
Chromatographie d’exclusion par la taille (SEC)
La chromatographie d’exclusion par la taille ou Size Exclusion Chromatrography (SEC) est une technique utilisée dès 2014 [44] permettant l’isolement des EVs à partir de biofluides. Le principe de la chromatographie d’exclusion par la taille [45] [46] [47] est basé sur la séparation des particules en solution selon leur rayon hydrodynamique. En transportant l’échantillon à travers une colonne remplie d’un matériau poreux (souvent à base de polymère ou de silice) il est possible de séparer les particules selon leur profil d’élution. De ce fait, les petites molécules seront ralenties en entrant dans les pores du polymère tandis que les plus grosses, c’est-à-dire celles possédant une taille supérieure aux pores du polymère, circuleront plus rapidement dans la colonne et par conséquent, seront éluées plus rapidement. Ainsi, il existe plusieurs kits commerciaux utilisant cette approche (qEV chez Izon Science [48], Omnisec chez Malvern Panalytical [49], etc…). De plus, cette technique peut être utilisée en complément d’autres méthodes de purification (ultracentrifugation par exemple).
Les kits commerciaux de chromatographie d’exclusion par la taille ont pour avantages de préserver la structure et l’intégrité biologique de l’échantillon. Sa mise en œuvre est simple et rapide d’utilisation (quelques minutes) comparée à d’autres techniques de purification et ne nécessite qu’un faible volume initial d’échantillon (compris entre 150 µL et10 mL). Cependant, des étapes de prétraitement doivent être réalisées avant l’analyse afin d’éviter d’éventuels bouchages des pores durant le processus de purification.
Fractionnement par écoulement de champ (FFF)
Le fractionnement par écoulement de champ ou Flow Field-Flow Fractionation (FFFF) [50] [51] est une technique permettant d’isoler les vésicules et les exosomes selon leur taille. Pour ce faire, un échantillon, dans lequel les vésicules à séparer sont en suspension, est injecté dans une chambre contenant une membrane semi-perméable. Cet échantillon est soumis ensuite à un flux parabolique. Un champ externe (par exemple une force élastique, un gradient thermique, etc…), transversal à l’écoulement, est appliqué dans cette chambre, conduisant ainsi à l’isolement des vésicules selon leur taille . Les grosses particules, affectées par l’écoulement perpendiculaire, seront repoussées vers les parois de la chambre où la vitesse d’écoulement est la plus faible. Les vésicules les plus petites, resteront, elles, au centre du flux et seront éluées plus rapidement. L’écoulement asymétrique FFF (AF4) [52] [53] est souvent utilisé pour fractionner les exosomes à partir d’un milieu de culture ou dans les fluides biologiques.
Cette technique est cependant rarement mise en œuvre dans les laboratoires de biologie du fait des multiples d’instruments nécessaires (application de champs externes) et de leur optimisation complexe.
Filtration et ultrafiltration
Une autre technique, utilisant la taille des objets pour séparer les EVs à partir d’un milieu biologique, est la filtration et l’ultrafiltration [54] [55]. Cette technique se réalise à l’aide d’une membrane semi-perméable adaptée. Il s’agit d’une méthode de séparation rapide et facile d’utilisation et non limitée par le volume d’échantillon.
Cependant, la filtration, ne permet pas le fractionnement des différentes vésicules, peut engendrer un colmatage ou un piégeage et même provoquer une déformation des vésicules au travers des filtres. De ce fait, l’ultrafiltration est souvent couplée à d’autres techniques [57] de purification comme l’ultracentrifugation ou la SEC.
Ultracentrifugation
La technique de purification actuellement la plus utilisée pour isoler les EVs est l’ultracentrifugation. Avant 2015 [58], 90 % des études portant sur l’isolement des vésicules impliquait cette méthode de séparation. Cette technique, repose sur le principe de la densité des particules. En effet, les espèces les plus denses (comme les cellules, débris cellulaires, etc…) seront isolées en premier en appliquant des forces de centrifugation [59] adéquates. Ces forces sont dépendantes de (1) la vitesse de rotation, (2) du type de rotor [60] (godets oscillants ou à angle fixe) et (3) de la viscosité du milieu (elle-même dépendante de la température, par exemple à 20°C, le plasma est plus visqueux que le sérum et le milieu de culture [61]). Plusieurs étapes de centrifugation [62] (dans ce cas, il s’agit de centrifugation différentielle) sont nécessaires pour séparer les EVs à partir d’un milieu complexe. Aussi, trois premières ultracentrifugations permettent d’éliminer les grosses particules (cellules, débits cellulaires, etc…) se trouvant dans la partie inférieure (culots) en gardant les surnageants. Enfin, les deux dernières étapes permettent de purifier [63] l’échantillon en exosomes, en récupérant cette fois-ci le culot.
Même si l’ultracentrifugation reste aujourd’hui encore l’une des méthodes les plus utilisées et si elle ne nécessite que très peu de réactifs supplémentaires (peu ou pas de prétraitement avant d’effectuer une ultracentrifugation) et ne demande que peu d’expertise, celle-ci comporte néanmoins quelques inconvénients comme (1) un grand volume nécessaire (jusqu’à 1 mL), (2) un temps de séparation long et (3) un équipement coûteux. De plus, il a été observé que les vésicules isolées par ultracentrifugation posséderaient une gamme de taille pouvant être hétérogène, ceci pouvant être lié à l’agrégation ou à la déformation des vésicules (ou même à la lyse des exosomes) en raison des forces de cisaillement durant la centrifugation.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I : SEPARATION DES VESICULES EXTRACELLULAIRES : ETAT DE L’ART ET POSITIONNEMENT DU PROJET
Les vésicules extracellulaires
I.1. Découverte des vésicules extracellulaires
I.1.a. Les exosomes
I.1.b. Les microvésicules
I.2. Rôles biologiques et pathologiques des EVs
I.3. Récapitulatif des différentes classes d’EVs
Les techniques de purification et d’isolement des EVs
II.1. Méthode de purification par la taille
II.1.a. Chromatographie d’exclusion par la taille (SEC)
II.1.b. Fractionnement par écoulement de champ (FFF)
II.1.c. Filtration et ultrafiltration
II.2. Ultracentrifugation
II.3. Précipitation
II.4. Les méthodes d’immunocapture
II.5. Les dispositifs microfluidiques
II.5.a. L’acousto-fluidique
II.5.b. Déplacement latéral déterministe (DLD)
II.6. Récapitulatif des différentes techniques de purification des EVs
Motivations et objectifs de la thèse
CHAPITRE II : PRINCIPE DE LA FILTRATION HYDRODYNAMIQUE ET TECHNOLOGIES DE FABRICATION DES DISPOSITIFS
Principe du dispositif de tri
I.1. Principe de la filtration hydrodynamique
I.2. Calcul des dimensions des puces microfluidiques
I.2.a. Dispositif 2D – Premier dispositif à 1 canalisation secondaire
I.2.b. Dispositif 2D – Dispositif à 10 canalisations secondaires
I.2.c. Dispositif 3D – Dispositif à 100 canalisations secondaires
I.2.d. Dispositif 3D – Dispositif adapté au tri des exosomes
I.3. Récapitulatif des différents dispositifs microfluidiques réalisés
Technologie de fabrication des puces microfluidiques
II.1. Présentation de la technologie « films secs »
II.1.a. Préparation du substrat et des ouvertures fluidiques
II.1.b. Réalisation du réseau de canalisation
II.1.c. Scellement des dispositifs
II.1.d. Techniques de fabrication 3D des puces microfluidiques
II.2. Technologie PDMS
Conclusion
CHAPITRE III : SEPARATION DE PARTICULES SUBMICROMETRIQUES PAR FILTRATION HYDRODYNAMIQUE
Protocole et observation des dispositifs de tri
I.1. Présentation du banc expérimental
I.2. Préparation des échantillons synthétiques : billes fluorescentes
I.3. Tests microfluidiques de validation des dispositifs à 1 et 10 canalisations secondaires
I.4. Tests microfluidiques sur les dispositifs à 100 canalisations secondaires à l’aide de billes synthétiques
I.5. Étude de la filtration de solutions de billes monodisperses
I.5.a. Mesure « témoin »
I.5.b. Caractérisation de la filtration des NP 480-OVA
I.5.c. Caractérisation de la filtration des NP 920
I.5.d. Caractérisation de la filtration des NP 140-CAS
I.6. Filtration de mélanges de billes synthétiques
I.7. Caractérisation des mélanges de billes synthétiques
I.7.a. Mélange 1 : NP 480-OVA et NP 920
I.7.b. Mélange 2 : NP 140-CAS et NP 920
I.8. Interprétations des résultats
Tests de filtration d’échantillons biologiques
II.1. Préparation et tests de filtration d’échantillon de plasma
II.1.a. Préparation des échantillons
II.1.b. Tests de filtration d’échantillon de plasma
II.2. Caractérisation des échantillons de plasma
II.2.a. Analyse par cytométrie en flux et calibration des différents NPs
II.2.b. Analyse par cytométrie du mélange de NP 480-OVA avec des NP 920 94
II.2.c. Analyse par cytométrie du plasma dilué 10 fois avec des NP 480-OVA95
II.2.d. Analyse par cytométrie du plasma dilué 2 fois avec des NP 480-OVA ou NP 920
II.2.e. Conclusion
II.3. Préparation et test de filtration d’échantillon de sang
II.3.a. Filtration d’un mélange de sang complet et de billes
II.3.b. Caractérisation des tests de filtration par comptage de cellules
II.3.c. Analyse de la filtration d’un échantillon de sang dilué 100 fois
II.3.d. Analyse de la filtration d’un échantillon de sang dilué 10 fois
II.3.e. Conclusion
Conclusion et perspectives
CONCLUSION GENERALE
