ROLE DES HSPG DANS L’INFECTION PAR LE VIH

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Origines et diversité du VIH

Il existe deux types de VIH : le VIH-1, à l’origine du SIDA et le VIH-2, responsable d’un syndrome d’immunodéficience se développant lentement9,10. Ils se différencient par leur origine géographique, l’organisation de leur génome et la relation phylogénétique qu’ils ont avec les autres lentivirus de primates dont ils sont tous les deux issus. Le VIH-1 se caractérise par une grande variabilité génétique. Les souches de virus peuvent être classées selon trois groupes :
le groupe M (Main), majoritaire, regroupe onze sous-types de VIH (A à K) classés en fonction de leurs séquences virales11, le B étant le plus répandu en France et le C prédominant au niveau mondial ;
le groupe O (Outlier), très rare, retrouvé au Gabon et au Cameroun ;
le groupe N (Non-M et Non-O), également rare, identifié au Cameroun. Antigéniquement distinct du VIH-1, mais également moins pathogène, le VIH-2 a une diffusion actuellement restreinte à l’Afrique de l’Ouest.
L’apparition des souches de VIH découle probablement d’une transmission inter-espèce entre des hommes et des primates infectés par le Virus de l’Immunodéficience Simienne (VIS). Plusieurs modes de transmission ont été proposés, dont une exposition directe des hommes à du sang animal contaminé lors de chasses de primates ou de consommation de viande contaminée crue. L’hypothèse d’une transmission à l’Homme au cours d’une campagne massive de vaccination contre la poliomyélite, dans les années 1950, au Congo Belge, au Rwanda et au Burundi a également été avancée12. Certaines équipes de recherche ont, depuis, estimé l’apparition des premières souches du VIH (groupe M) au début des années 1930, réfutant ainsi la thèse de la transmission par les vaccins13.

Le virus de l’immunodéficience humaine

La famille des rétrovirus

Le VIH appartient à la famille des rétrovirus. Sur la base de critères de pathogénicité, on distingue trois sous-familles.

Les Oncovirus

Les Oncovirinae représentent la sous-famille majoritaire. Ce type de virus a été observé chez les insectes, les sangsues, les reptiles, les oiseaux et les mammifères. Les Oncovirus peuvent induire les tumeurs les plus variées : ils sont associés au développement de sarcomes (tumeurs du tissu conjonctif), de carcinomes (tumeurs des tissus épithéliaux), de lymphomes et de leucémies. Ce dernier type de tumeur est le plus fréquent dans la pathologie rétrovirale. Le virus HTLV-1, entre autres, appartient à cette sous-famille.

Les Spumavirus

Ce sont des virus « non pathogènes ». Ces virus ont été découverts par hasard au début des années 1950 chez plusieurs espèces animales (singes, bovins, chats, hamsters) où ils provoquent des infections inapparentes. Ils ont également été isolés chez l’Homme (en 1970). Les cellules infectées in vitro présentent des lésions qui ressemblent à de l’écume (« spuma » signifie mousse).

Les Lentivirus

Ce sont des virus cytopathogènes. Ces virus ont d’abord été isolés chez l’animal et sont responsables de maladies à évolution lente (lentus = lent). C’est à cette sous-famille qu’appartiennent les VIH-1 et VIH-2.
Les lentivirus infectent principalement les cellules du système immunitaire (macrophages et lymphocytes T CD4+). Par conséquent, les infections lentivirales résistent au système immunitaire et induisent généralement des immunodéficiences sur des périodes relativement longues. Un autre caractère distinctif de cette sous-famille, particulièrement pour le VIH, consiste en leur capacité à infecter des cellules quiescentes et/ou en différenciation terminale. Leurs génomes contiennent l’information pour tous les gènes essentiels et accessoires nécessaires à l’expression des protéines virales dans les cellules infectées. Les lentivirus ont aussi la capacité de réduire l’expression de leurs protéines chez les cellules infectées et d’établir un état de latence. Ce dernier peut persister sur une longue période jusqu’à la réactivation du virus lors d’une réponse cellulaire. L’existence de cellules réservoirs (infectées de façon latente) est un des principaux obstacles à l’éradication du VIH chez les patients sous thérapie antirétrovirale (cf I-3.1.4.).

Caractéristiques du virus

Organisation de la particule virale

En insert en bas à gauche : la structure du virus vue par microscopie électronique.
Le VIH (figure 2) possède une enveloppe constituée d’une bicouche lipidique, dérivée de la membrane plasmique de la cellule hôte infectée. La surface de cette enveloppe est recouverte de complexes protéiques, responsables de l’attachement du virus sur les cellules hôtes. Il s’agit de spicules formés par l’association non covalente de deux glycoprotéines, gp120 et gp41, présentes sous forme de trimères14. La protéine gp120 se fixe aux récepteurs cellulaires tandis que gp41 est responsable de la fusion des membranes virale et cellulaire. Ces deux protéines sont codées par le gène env, sous la forme de gp160, une protéine précurseur qui sera glycosylée puis clivée en gp41 et gp120. La face interne de l’enveloppe est tapissée d’une couche de 7 nm de p17, une protéine codée par le gène gag et constituant la matrice.
Le cœur du virion renferme deux copies d’ARN viral, protégées par une capside formée par l’assemblage des protéines p24, autre produit du gène gag. Associées aux molécules d’ARN, on trouve de nombreuses protéines virales impliquées dans le processus d’encapsidation du matériel génétique au cours du cycle viral (p7, par exemple) ou nécessaires à l’infection virale d’une cellule hôte (par exemple la transcriptase inverse, l’intégrase, la protéine virale R). Une cinquantaine de molécules de chaque enzyme sont réunies dans un virion.

Les cellules cibles du VIH

Passage du virus à travers les muqueuses

Dans le cas d’une contamination par voie sexuelle, le VIH, libre ou présent dans des cellules mononucléées (lymphocytes, macrophages), doit traverser les muqueuses épithéliales pour atteindre des sites de réplication dans les tissus lymphoïdes. Au niveau de ces muqueuses, les cellules dendritiques sont les principales cibles du VIH. Ces cellules sont classées en fonction des lectines calcium-dépendantes qu’elles expriment : DC-SIGN (DC-Specific ICAM-3-Grabbing Nonintegrin appelé aussi CD209) pour les DC et la langérine pour les cellules de Langerhans (LC). Les LC sont situées dans l’épiderme de la peau et de la plupart des muqueuses épithéliales alors que les DC sont localisées dans le sub-épithélium51.
DC-SIGN est capable de fixer le VIH (souches X4 ou R5), au niveau de gp120 avec une affinité supérieure à celle de l’interaction gp120/CD452, et de l’endocytoser dans un compartiment endosomal53. Le virus résiste à l’environnement acide de l’endosome et est alors protégé ; il peut rester infectieux pendant 25 jours in vitro54. Par ailleurs, les DC expriment également les récepteurs nécessaires à l’infection classique par le VIH (CD4 et CCR5), ces cellules peuvent donc être infectées. L’événement biologique, endocytose du virus ou réelle infection, qui prédomine lors d’une exposition au VIH n’est pas connu. L’hypothèse est qu’il existe deux phases d’infection. Lors de la première phase qui survient rapidement après une exposition au VIH, les DC transfèrent le virus aux Lymphocytes T sans être infectées de façon productive. Dans la seconde phase, une fois que les DC sont réellement infectées, ce sont des virus nouvellement synthétisés qui sont transférés aux lymphocytes T55. La première étape fait intervenir DC-SIGN qui transfère aussi bien les virus X4 que R5. En revanche, la deuxième phase implique les récepteurs CD4 et CCR5 et, de ce fait, pourrait permettre de sélectionner uniquement les souches R5, expliquant ainsi leur prédominance dans les étapes précoces de l’infection.

Infection du système nerveux

Parallèlement à l’infection du système immunitaire, le VIH pénètre souvent le système nerveux central (SNC) rapidement après l’infection des organes périphériques (60% des personnes infectées). Ces patients présentent généralement des prédispositions génétiques favorisant l’infection et le développement des pathologies associées85. Une fois dans le SNC, le virus induit des problèmes neurologiques plus ou moins conséquents : perte de mémoire, faiblesse des membres, dépression, comportements anormaux, dysfonctionnements moteurs, voire démence dans 10% des cas. La barrière hématoencéphalique est une couche de cellules endothéliales microvasculaires sélectivement perméables, qui régule la circulation de cellules et de substances entre le SNC et le sang. Ces cellules n’expriment pas CD4. Elles expriment CCR5, CXCR4 et DC-SIGN mais le blocage de ces molécules n’inhibe pas la fixation du virus86, suggérant ainsi que le mécanisme d’infection est dirigé par d’autres récepteurs.
Les macrophages et, à moindre échelle, les lymphocytes T infectés et les virus libres peuvent migrer à travers l’épithélium vasculaire par différents mécanismes (figure 5) incluant le passage direct entre deux cellules épithéliales ou la transcytose au niveau d’une cellule épithéliale. L’implication des HS dans la fixation du virus sur la barrière hématoencéphalique et dans les phénomènes de transcytose a parfois été observée87,88. De même, l’implication des radeaux lipidiques, des microdomaines membranaires enrichis en lipides (cf II-3.), lors de la transcytose a été proposée89 puis contredite par des études publiées ultérieurement87.
Les macrophages périvasculaires et les cellules microgliales sont les principales cibles du VIH dans le SNC90. Ces cellules possèdent CD4 et CCR5 et sont donc sensibles à l’infection par les souches R5.

Biosynthèse et clivage endoprotéolytique du précurseur gp160

Le précurseur gp160 est synthétisé dans le réticulum endoplasmique sous la forme d’une protéine de 90 kDa, puis glycosylé dans l’appareil de Golgi, par addition de 31 chaînes oligosaccharidiques riches en mannose sur certains résidus Asn des sites de glycosylation Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr191. Les glycosylations de gp160 représentent environ 50% de la masse totale de la protéine. Elles sont essentielles à la maturation de gp160 puisque le précurseur non glycosylé est incapable de quitter le réticulum endoplasmique et ne subit donc pas de clivage192,193. Des études biochimiques ont permis de montrer que le passage de gp160 du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi est lié à l’oligomérisation de gp160 sous forme de trimère194.
Ces étapes sont réalisées conjointement au processus de clivage de gp160 en une protéine transmembranaire (gp41) et une protéine de surface (gp120). Plusieurs enzymes, certaines appartenant à la famille des convertases, participent au clivage de gp160. En particulier, la furine et PC7 semblent impliquées dans la maturation de gp160 dans les lymphocytes T195. Il s’agit de protéinases à sérine, de la famille de la subtilisine. Le site de clivage (site 2) a été identifié196,197 : il s’agit du site en aval de la séquence Arg508-Gln-Lys-Arg511, située dans la partie C-terminale de gp120. Cette séquence est fortement conservée parmi les différentes souches de VIH198 et inclut un des domaines de gp120 les plus conservés (la région C5). L’importance de cette séquence dans l’infection a été démontrée par mutagénèse dirigée. La mutation de Arg511 induit la formation de particules virales non-infectieuses possédant des protéines gp160 non matures196. Il existe un second site de clivage (site 1), situé 8 acides aminés en amont du site de clivage physiologique. Néanmoins, le clivage au niveau de ce site conduit à la formation de protéines gp41 non fusogènes. La signification physiologique de ce second site de clivage est, à l’heure actuelle, encore mal connue ; il s’agit cependant d’un processus non négligeable puisque 15% des protéines gp41 possèdent cette séquence199. Il semblerait que gp160 soit clivée, de façon intracellulaire, au niveau du site 2 puis que la partie C-terminale de gp120 interagisse avec la partie N-terminale de gp41 afin de masquer le peptide fusogène200. Une fois à la surface du virus, gp120 interagirait avec CD4, puis avec une protéine (encore inconnue) située à la surface de la cellule hôte, pour être clivée au niveau du site 1. Cette étape permettrait l’induction de l’activité fusogène de gp41.

La protéine gp120

Structure

Structure primaire
La protéine gp120 est composée d’environ 480 résidus. L’analyse des séquences de différents isolats suggère l’existence de cinq régions conservées (C1 à C5) et de cinq régions (V1 à V5) avec une haute variabilité de séquence (jusqu’à 60 à 80%). Les quatre premières régions variables forment des boucles exposées, reliées, à leur base, par des ponts disulfures201. Les régions conservées de gp120 forment des structures discontinues importantes dans les interactions avec l’ectodomaine de gp41 et les récepteurs viraux, à la surface cellulaire.
Structures secondaire et tertiaire
Différents travaux ont permis d’élucider la structure de gp120, en étudiant notamment des fragments de gp120 ou en élaborant des analogies avec la protéine gp120 du VIS.
En 1998, la structure de gp120 (souche IIIB – X4), complexée aux domaines D1/D2 de CD4 et à un fragment Fab de l’anticorps 17b (dirigé contre le site de fixation aux corécepteurs) a été décrite par Kwong et al.202. Cette protéine ainsi cristallisée est tronquée en N et C-terminal ; les boucles V1, V2 et V3 ainsi que la majorité des sites de glycosylation ont également été délétés : c’est le « core protéique ». En 2000, la structure du core protéique d’un autre isolat (YU2 – R5) a également été résolue203. En 2005, la structure du core protéique de gp120 possédant la boucle V3, en complexe avec CD4 et l’anticorps neutralisant X5, a permis de déterminer la structure de V3 et de suggérer son rôle204. En 2005 également, les travaux de Chen et al.205 ont permis d’élucider la structure du core de la protéine gp120 du VIS complètement glycosylée et dans sa conformation non liée à CD4. Les protéines gp120 du VIH et du VIS présentent 35% d’identité de séquence et plus de 70% d’homologie de séquence.
En comparant les quatre structures cristallographiques décrites par ces différents travaux ainsi que les données thermodynamiques206,207 établies à partir du core protéique de gp120 décrit par Kwong, les changements structuraux intervenant lors de la fixation à CD4 puis aux corécepteurs ont pu être déterminés.
La protéine gp120, non liée à CD4, est très flexible. Elle est organisée en un domaine interne peu homogène, plutôt articulé en un ensemble de structures distinctes, et un domaine externe. Les sites de fixation à CD4 et aux corécepteurs ne sont pas formés et les boucles V1/V2 et V3 sont orientées dans des directions opposées (figure 8A et C). Une ébauche de boucle de fixation à CD4 émerge du domaine externe : associée à une partie du domaine interne, elle forme une longue et étroite cavité bordée de résidus hydrophobes. CD4 interagit avec la région du domaine externe située au creux de cette cavité. Des données thermodynamiques indiquent que, lors de l’interaction avec CD4, gp120 subit un réarrangement global : 126 résidus en moyenne sont réorganisés, la moitié (54) associée à la formation d’un feuillet intermédiaire (ou bridging sheet) permettant de séparer les deux domaines206. Les parties N- et C-terminales de gp120 sont réorientées vers la membrane virale alors que le site de fixation aux corécepteurs, CD4i (CD4-induced), bordé par les boucles V1/V2 et V3, est créé et orienté vers la membrane cellulaire afin de faciliter l’interaction avec CXCR4 ou CCR5208. Des études montrent que cette conformation CD4-liée est beaucoup plus stable et rigide que la forme libre de gp120206,207. La protéine gp120 complexée à CD4 et 17b est ainsi organisée en deux domaines, interne et externe, mieux structurés, reliés entre eux par le feuillet intermédiaire, consitué de quatre feuillets antiparallèles (figure 8B). Le domaine interne est constitué de deux hélices et d’un feuillet à cinq segments. Le domaine externe, qui ne subit pas de réarrangements majeurs lors de la fixation à CD4, s’organise en un feuillet
multidirectionnel à six segments qui encadrent une hélice et en un feuillet antiparallèle à sept segments. Les boucles V1/V2 sont situées au niveau du domaine interne alors que les boucles V4 et V5 se trouvent sur le domaine externe. La structure de gp120 avec la boucle V3209 suggère que V3 est structurée et dépasse du core en direction de la membrane de la cellule cible. Le domaine interne est mieux conservé d’une souche à l’autre que le domaine externe. Les 7 ponts disulfures sont totalement conservés et enfouis. Les sites de glycosylation sont toujours exposés en surface et assez bien conservés ; ils sont absents du domaine interne et des sites de fixation aux récepteurs. La protéine gp120 entière se comporte globalement de la même façon que la forme tronquée décrite par Kwong210.

Table des matières

GLOSSAIRE
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I- LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE
I-1. Historique et bilan de l’infection à VIH
I-1.1. Découverte des rétrovirus
I-1.2. Découverte du VIH
I-1.3. Origines et diversité du VIH
I-1.4. Epidémiologie
I-2. Le virus de l’immunodéficience humaine
I-2.1. La famille des rétrovirus
I-2.1.1. Les Oncovirus
I-2.1.2. Les Spumavirus
I-2.1.3. Les Lentivirus
I-2.2. Caractéristiques du virus
I-2.2.1. Organisation de la particule virale
I-2.2.2. Organisation du génome
I-2.2.3. Le cycle viral
I-2.3. Variabilité du virus
I-2.3.1. Mécanismes engendrant la variabilité
I-2.3.2. Conséquences de la variabilité : le tropisme viral
I-3. Pathologie du VIH
I-3.1. Les cellules cibles du VIH
I-3.1.1. Passage du virus à travers les muqueuses
I-3.1.2. Infection des cellules des organes lymphoïdes
I-3.1.3. Infection du système nerveux
I-3.1.4. Protection du virus et réservoirs viraux
I-3.2. Les différentes phases de la maladie
I-3.3. Le diagnostic
I-3.4. SIDA et maladies opportunistes
I-4. Les stratégies thérapeutiques
I-4.1. Les inhibiteurs de la réplication virale
I-4.2. Les inhibiteurs de l’entrée virale
I-4.3. Les autres cibles
I-4.4. Les vaccins
II- MECANISME DE L’ENTREE VIRALE
II-1. Le complexe Env
II-1.1. Biosynthèse et clivage endoprotéolytique du précurseur gp160
II-1.2. La protéine gp120
II-1.2.1. Structure
II-1.2.2. La boucle V3
II-1.2.3. Le rôle des glycosylations
II-1.3. La protéine gp41
II-1.3.1. Structure
II-1.3.2. Mécanisme de fusion
II-2. Les récepteurs cellulaires du VIH
II-2.1. Le récepteur CD4
II-2.1.1. Description de CD4
II-2.1.2. Interaction entre gp120 et CD4
II-2.1.3. Interaction entre CD4 et d’autres protéines virales
II-2.2. Les récepteurs à chimiokines
II-2.2.1. Découverte des corécepteurs CXCR4 et CCR5
II-2.2.2. Cas particulier de CCR5 : la mutation CCR5?32
II-2.2.3. Structure des récepteurs à chiomokines
II-2.2.4. Interaction entre gp120 et les corécepteurs
II-2.2.5. Les autres corécepteurs utilisés par le VIH
II-2.3. Les récepteurs alternatifs
II-3. D’autres modes d’entrée dans les cellules
III- ROLE DES HSPG DANS L’INFECTION PAR LE VIH
III-1. Structure et fonction des HSPG
III-1.1. Généralités sur les protéoglycanes et les glycosaminoglycanes
III-1.2. Le core protéique des HSPG
III-1.2.1. Les HSPG membranaires
III-1.2.2. Les HSPG matriciels
III-1.2.3. Le cas de la serglycine : un protéoglycane intracellulaire
III-1.3. Propriétés structurales des chaînes d’HS
III-1.3.1. Biosynthèse des chaines d’HS
III-1.3.2. Organisation moléculaire des HS
III-1.4. Propriétés fonctionnelles des HSPG
III-1.4.1. Fonctions des chaînes d’HS
III-1.4.2. Fonctions du core protéique
III-1.4.3. Rôle des enzymes de remodelage
III-1.4.4. Les motifs de reconnaissance des HS sur les protéines
III-1.5. Potentiel thérapeutique des molécules dérivées des HS
III-1.5.1. L’héparine et ses dérivés comme agents anticoagulants
III-1.5.2. Les composés antitumoraux dérivés des HS
III-1.5.3. Autres composés mimétiques des HS à potentiel thérapeutique
III-2. Rôle des HS dans l’infection par des pathogènes
III-2.1. Interaction HS – bactéries/parasites
III-2.2. Interaction HS – virus
III-3. Rôle des HS dans l’infection par le VIH
III-3.1. Interaction des HS avec la protéine gp120 du VIH
III-3.1.1. Rôle des HS dans l’entrée virale
III-3.1.2. Caractérisation des sites d’interaction gp120/HS
III-3.2. Interaction des HS avec la protéine Tat du VIH
III-3.3. Intérêt thérapeutique de molécules dérivées des HS dans l’infection VIH
III-3.3.1. Données physiologiques
III-3.3.2. Propriétés antivirales des mimétiques d’HS
OBJECTIFS DU PROJET
MATERIEL ET METHODES
I- SYSTEME DE PRODUCTION DE PROTEINES DANS DES CELLULES S2 DE DROSOPHILES
I-1. Principe
I-2. Clonage
I-2.1. Amplification de l’insert par PCR
I-2.2. Clonage indirect dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO
I-2.2.1. Transformation de bactéries compétentes avec la ligation
I-2.2.2. Isolement de l’ADN plasmidique produit par les bactéries
I-2.2.3. Confirmation de la présence de l’insert dans le vecteur TOPO
I-2.3. Clonage dans le vecteur pMT/BiP/V5/HisA
I-3. Culture cellulaire
I-3.1. Culture des cellules S2
I-3.2. Transfection – Sélection
I-3.3. Optimisation des conditions d’expression de la protéine
II- SYSTEME DE PRODUCTION DE PROTEINES AVEC LA TECHNOLOGIE « BACULOVIRUS »
II-1. Principe
II-2. Clonage
II-2.1. Construction de pFastBac-gp120
II-2.2. Construction de pNT-Bac-gp120
II-3. Génération du bacmide recombinant
II-4. Culture cellulaire
II-4.1. Culture des cellules
II-4.2. Transfection
II-4.3. Amplification du stock viral
II-4.4. Titrage du virus recombinant
II-4.5. Production de la protéine
II-4.5.1. Protocole de production pour des cellules en monocouche
II-4.5.2. Protocole de production pour des cellules en suspension
III- ELECTROPHORESE ET IMMUNODETECTION DES PROTEINES
III-1. Analyse des protéines par électrophorèse
III-2. Révélation des protéines par Western Blot
IV- MUTAGENESE DIRIGEE
V- PURIFICATION DES PROTEINES
V-1. Séparation sur colonne échangeuse de cations : SP sépharose
V-2. Séparation sur colonne d’affinité : lentil-lectine
V-3. Séparation par chromatographie d’exclusion : Superdex 200
V-4. Déssalage, concentration et dosage des protéines
VI- PREPARATION DE BANQUES D’OLIGOSACCHARIDES
VI-1. Digestion enzymatique de l’héparine
VI-2. Purification des oligosaccharides
VII- ETUDE DE L’INTERACTION GP120/HEPARINE PAR CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE
VIII- BIACORE
VIII-1. Fonctionnalisation des surfaces
VIII-2. Tests d’interaction
IX- ETUDE DE L’INTERACTION GP120/CXCR4
IX-1. Analyses par cytométrie en flux
IX-2. Etude de la mobilisation du calcium intracellulaire dans un système cellulaire CXCR4+
IX-3. Chimiotaxie des cellules A3.01
X- ETUDE DES DOMAINES PROTEIQUES DE FIXATION A L’HEPARINE PAR LA TECHNIQUE DES BIL
X-1. Méthode
X-2. Alternative: interaction protéine/héparine en solution
RESULTATS ET DISCUSSION
I- PRODUCTION ET PURIFICATION DE GP120 ET DE SES FORMES MUTANTES EN CELLU D’INSECTES
I-1. Production de gp120 en cellules S2 de drosophiles
I-1.1. Conception du plasmide pMT/BiP/V5/HisA-gp120
I-1.2. Production
I-2. Production avec le système Bac-to-Bac
I-2.1. Conception des plasmides puis des bacmides recombinants
I-2.1.1. pFastBac-gp120
I-2.1.2. pNT-Bac-gp120
I-2.2. Réalisation des plasmides et bacmides mutants
I-2.3. Choix du type cellulaire et du plasmide le mieux adapté
I-2.3.1. Choix du bacmide
I-2.3.2. Choix du type cellulaire
I-2.4. Titrage des stocks viraux
I-2.5. Production
I-2.6. Purification
I-2.6.1. Purification sur résine échangeuse de cations
I-2.6.2. Purification sur résine d’affinité
I-2.6.3. Purification par chromatographie d’exclusion
I-2.6.4. Récapitulatif des différentes étapes de purification
I-2.6.5. Purification des autres formes recombinantes de gp120
II- CARACTERISATION FONCTIONNELLE DE GP120
II-1. Etudes SPR
II-1.1. Principe
II-1.2. Etude de la forme recombinante sauvage de gp120
II-2. Analyse de l’interaction de gp120 avec le récepteur CXCR4
II-2.1. Etude de l’interaction gp120/CXCR4 par cytométrie en flux
II-2.2. Mobilisation de la voie du calcium
II-2.2.1. Principe
II-2.2.2. SDF-1? induit la voie de signalisation du calcium
II-2.2.3. La protéine gp120 HXBc2 n’induit pas la voie de signalisation du calcium
II-2.3. Chimiotaxie
III- ETUDE DU SITE CD4I
III-1. Etude fonctionnelle des protéines mutées
III-2. Identification des résidus de CD4i interagissant avec l’héparine
III-2.1. Etude de CD4i par chromatographie d’affinité
III-2.2. Etudes des interactions gp120/héparine au niveau du site CD4i
III-2.2.1. Analyse directe
III-2.2.2. Analyse indirecte
III-2.2.3. Taille optimale des polysaccharides pour inhiber l’interaction CD4i/17b
III-3. Etude du site CD4i par la « méthode des billes »
III-3.1. Principe
III-3.2. Mise au point de la technique avec différentes protéines
III-3.2.1. gC
III-3.2.2. RANTES (9-68)
III-3.2.3. Le fragment ?3LG4/5 de la laminine-5
III-3.3. Alternative : élimination des billes, utilisation d’oligosaccharides définis
III-3.4. Application à gp120
DISCUSSION GENERALE
I- PRODUCTION ET PURIFICATION DE GP120
I-1. Choix du système d’expression
I-2. Choix de la séquence signal d’excrétion
I-3. Choix du type cellulaire
I-4. Optimisation des conditions de purification
II- ANALYSE FONCTIONNELLE DE GP120 SAUVAGE
III- ETUDE DU SITE CD4I
IV- CARACTERISATION DES DOMAINES D’INTERACTION AVEC L’HEPARINE
IV-1. Méthode des billes
IV-1.1. Méthodologie
IV-1.2. Limites et optimisation de la technique
IV-1.3. Etude des HBD de RANTES, gC et du fragment ?3LG4/5 de la laminine-5
IV-2. Etude des HBD en solution
IV-2.1. Méthodologie
IV-2.2. Etude des HBD de RANTES et gp120
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES

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