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Origines et Destinée des radicaux libres
La molécule de dioxygène est en réalité bi-radicalaire. Elle possède, en effet, deux électrons célibataires sur des orbitales différentes. Le dioxygène est susceptible de récupérer quatre électrons, mais ses capacités oxydantes sont limitées par une barrière cinétique importante. En présence des rayonnements, de métaux ou d’enzymes, il est capable de capter un électron pour donner le radical superoxyde O2•- qui est un radical modérément réactif. Ce radical superoxyde est le substrat d’enzymes essentielles telles que les superoxydes dismutases (SOD), qui le transforment en eau oxygénée H2O2. L’eau oxygénée peut avoir plusieurs destinées. En présence de métaux, en particulier de fer Fe2+, elle est transformée en radical hydroxyle OH• par la réaction de Fenton. Ce dernier est extrêmement réactif et va oxyder très rapidement les molécules voisines, formant parfois d’autres radicaux libres comme le montre la Figure 2 (55).
L’eau oxygénée peut aussi subir des réactions de détoxication catalysées par la catalase, la glutathion peroxydase ou les peroxyrédoxines. De même, plusieurs composés, notamment les vitamines E et C, peuvent interagir avec les radicaux et éviter leur accumulation (63).
Les ERO peuvent être produites par des agents physiques comme les rayonnements, des réactions chimiques et surtout enzymatiques. En effet, toute réaction impliquant de l’oxygène et un système réducteur de transfert d’électrons est susceptible de libérer des ERO.
C’est ainsi que la chaîne respiratoire provoque une libération importante d’ERO, mais dont l’intensité demeure controversée. D’autres activités enzymatiques fournissent aussi des ERO, notamment les NADPH oxydases au cours de l’inflammation et les cytochromes P450 au cours de la détoxication des xénobiotiques. Ainsi, la mitochondrie, la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique sont les sièges principaux de libération d’ERO (4).
Il existe dans la cellule d’autres oxydants très puissants, qu’ils soient des radicaux libres ou non (6). Par exemple, des oxydants chlorés (HOCI) sont libérés par les macrophages et ont une activité bactéricide importante. Par ailleurs, le monoxyde d’azote(NO) est un radical libre qui est surtout réputé pour ses propriétés physiologiques. Or, le NO interagit avec l’anion superoxyde pour donner le peroxynitrite interagissent avec des protéines et peuvent altérer leurs propriétés.
D’autres molécules comme les hydroquinones se retrouvent sous forme de leur réaction avec le radical hydroxyle OH•, et, de par leur structure, stabilisent leur électron célibataire (radical semi-quinonique). Elles sont ainsi susceptibles de diffuser dans la cellule et d’oxyder d’autres molécules à distance, propageant ainsi une chaîne de réactions radicalaires.
Les espèces réactives: structure et réactivité
En 1954, Gilbert et Gerschman désignent pour la première fois les radicaux libres comme responsables de processus de dégradation au sein des cellules biologiques (34). Peu après, Harman montre la participation des radicaux libres dans des évènements physiologiques majeurs, particulièrement au cours du processus du vieillissement (41).
Du fait de leur courte durée de vie, la plupart des radicaux libres réagissent quasi instantanément avec d’autres molécules voisines. Néanmoins, la toxicité d’une espèce n’est pas nécessairement corrélée à sa réactivité. De plus, certaines molécules non-radicalaires présentent également une activité oxydante accrue parmi lesquelles le peroxyde d’hydrogène (H2O2), le peroxynitrite (ONOO-) ou l’acide hypochloreux (HClO). Ainsi, les ROS et les espèces réactives de l’azote (RNS : Reactive Nitrogen Species) peuvent être classées en deux catégories : les radicaux libres et les non-radicaux (42) (Figure 3).
Espèces réactives de l’oxygène (ROS)
Les ROS comprennent le radical hydroxyle (OH•), l’anion superoxyde (O2•-) le peroxyde d’hydrogène (H2O2).
En raison de leur extrême réactivité, les radicaux hydroxyles (OH•) sont les ROS les plus toxiques. Les constantes de vitesse (pour des réactions du type : OH• + substrat) sont en effet comprises entre 108 et 1010 L.mol-1.s-1. La durée de vie des OH• est limitée (10-10 secondes de survie dans les systèmes biologiques) ; par conséquent, ils diffusent peu et réagissent très rapidement avec des molécules voisines très proches. Puissants agents oxydants, ils s’attaquent à la plupart des molécules organiques et inorganiques présentes dans les cellules, parmi lesquelles l’ADN, les protéines, les lipides, les acide-aminés, le sucres et les métaux. Ils agissent selon trois modes d’actions : en arrachant soit un électron soit un atome d’hydrogène ou encore en s’additionnant sur les doubles liaisons.
Paradoxalement, les radicaux superoxydes sont peu réactifs vis-à-vis des molécules biologiques (acides nucléiques, protéines, lipides…). Les constantes de vitesse de réactions de type : O°2 + substrat sont inférieures à 102 L.mol-1.s-1. La durée de vie de ces radicaux est par conséquent relativement longue (jusqu’à quelques dizaines de secondes). Ils peuvent donc diffuser jusqu’à atteindre leur cible. Néanmoins, les cibles privilégiées de l’O°2 sont peu nombreuses. On peut citer les superoxydases dismutases (SOD), les ions Fe3+ (k =2.109 L.mol-1.s-1) ou encore l’ascorbate (k = 2,7.108 L.mol-1.s-1).
Les radicaux O°2 semblent peu réactifs. Toutefois, ces derniers demeurent des espèces potentiellement toxiques via leurs réactions avec le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et monoxyde d’azote (NO•), générant respectivement des radicaux OH• et des peroxynitrite (ONOO-) (I-1) et (I-2). Ces deux espèces sont particulièrement réactives vis-à-vis des cibles biologiques.
O°2 + H2O2 O2+OH° +OH- (I-1)
NO• + O2° ONOO- (I-2)
Enfin, la dismutation spontanée des O2 conduit à la formation de peroxyde d’hydrogène (I-3), avec une constante de vitesse relativement élevée (k = 9,7.107 L.mol.-1.s-1)
2O2+2H+ H2O2 + O2 (I-3)
Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) cause d’importants dommages cellulaires à concentration relativement faible. Du fait de sa forte solubilité dans l’eau, il pénètre facilement les membranes biologiques, entraînant la dégradation des protéines, la libération de fer, l’inactivation d’enzymes et l’oxydation de l’ADN, de lipides ou encore de thiols.
L’oxygène singulet (1O2) résulte de l’action des rayons ultraviolets sur le dioxygène (37). 11 (n+1) + + H2O2
Espèces réactives de l’azote (RNS)
Le monoxyde d’azote (NO•) est issu de l’oxydation de l’un des azotes terminaux de l’acide aminé L-Arginine.NO• peut réagir avec une grande variété de substances et de radicaux libres et conduire, par exemple après réaction avec H2O2, à la formation de nitrite (NO2-) ou de nitrate (NO3-). Le peroxynitrite (ONOO-) est formé suite à la réaction entre O2 et NO• avec une constante de vitesse de 6,7 109 L.mol-1.s -1 (47). La forme protonnée du radical peroxynitrite (ONOOH) est un puissant agent oxydant causant des dommages importants similaires à ceux observés avec OH• (50).
Rôles des métaux de transition
Les métaux de transition participent également au stress oxydant. Leur action conduit à la conversion d’oxydants relativement stables en des radicaux puissants à haute réactivité, suivant la réaction de Fenton (27). Mn+ M (n+1)+ + OH °+ OH – où M représente un cation métallique au degré d’oxydation n ou n+1. Pour le système Fe(II)/Fe(III), la constante de vitesse de 2ème ordre est égale à 76 L.mol-1.s-1; pour le cuivre (Cu(I)/Cu(II)), elle atteint 4,3.103 L.mol-1.s-1.
Au pH physiologique, les métaux sont présents sous la forme M (n+1) + et ne participent donc pas à la réaction de Fenton. Cependant, les espèces M présentes à la surface de protéines, de l’ADN et autres macromolécules ou chélates, se trouvent exposées aux radicaux libres environnants. Sous l’action du radical superoxyde, elles subissent alors une réaction de réduction contribuant à l’augmentation du stress oxydant. Dans le cas de Fe(III) (FeSO4+), la constante de vitesse de la réaction est d’environ 1,5.108 L.mol-1.s-1 (64).
Rôle dans le dysfonctionnement endothélial
Les cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins régulent le tonus vasculaire (23) notamment en libérant du monoxyde d’azote (NO), qui induit la relaxation des cellules musculaires lisses du média. Le NO s’oppose aussi aux effets vasoconstricteurs d’agents potentiellement libérés par les cellules endothéliales sous l’action de divers stimuli (cytokines, radicaux libres, lipides oxydés). En situation physiologique, on observe une production basale de NO.
De nombreux facteurs peuvent être à l’origine d’un dysfonctionnement endothélial:âge,tabac,hypertension,hypercholestérolémie,hyperho-mocystéinémie, mais aussi hyperglycémie du diabète de type II. Dans ce cas, l’endothélium altéré libère des EOA et du NO et ceci en quantité anormalement élevée. Le NO perd alors ses propriétés physiologiques et devient au contraire très toxique par sa réaction instantanée avec les EOA et la formation de peroxynitrites. L’apparition d’une vasoconstriction est ainsi favorisée.
Un dysfonctionnement endothélial est aussi la première étape du processus d’athérosclérose (62). Dans ce cas, les lipoprotéines de faible densité («low density lipoproteins» ou LDL) et les monocytes sanguins qui se différencient ensuite en macrophages s’accumulent dans la paroi. Les EOA produits par l’endothélium lésé conduisent à l’oxydation des LDL (tant dans leur partie protéique que dans leur partie lipidique). Les LDL oxydées sont alors reconnues par des récepteurs non-régulés situés à la surface des macrophages qui se transforment en cellules spumeuses observables dans la plaque d’athérome. En outre, Le dysfonctionnement endothélial entretient un environnement inflammatoire, responsable d’une production accrue d’EOA. Toutes ces observations montrent l’implication d’un stress oxydant au cours des processus qui associent le syndrome métabolique, le diabète de type II et les atteintes cardiovasculaires (1 ,77). Des techniques d’évaluation in vivo de la fonction endothéliale sont actuellement possibles comme par exemple la mesure de la vasodilatation dépendante du flux sanguin (Flow Mediated Dilation ou FMD) au niveau de l’artère brachiale, le laser Doppler au niveau de la peau et le PET scan au niveau du cœur. Plusieurs travaux ont également montré chez plus de 2000 patients atteints d’athérosclérose que le dysfonctionnement endothélial identifie plus précisément les sujets dont le risque cardiovasculaire est augmenté à court ou à long terme (83 ,80).
Rôle dans le vieillissement de la peau
La peau est exposée au stress oxydant par des facteurs exogènes comme les gaz atmosphériques, la pollution, les produits chimiques ou encore les irradiations. Elle subit également les effets de facteurs endogènes comme l’action biologique de certaines enzymes ou cellules telles que les neutrophiles ou lors de processus pathologiques et de maladies telles que les cancers, psoriasis ou autres inflammations cutanées.
Il existe dans les couches épidermiques de nombreuses cibles potentielles (lipides, protéines, ADN) dont la dégradation due au stress oxydant cause des pathologies diverses : altération de l’élasticité des tissus, vieillissement précoce, inflammation ou encore cancers cutanés. Les réactions chimiques ayant lieu entre les ROS et les cellules cibles sont nombreuses. Elles peuvent conduire à des processus de peroxydation sur les lipides ou les protéines. Les ROS provoquent l’inactivation directe de certaines enzymes, induisant la dégradation des protéines associées. Sous l’influence du stress oxydant, des dégâts sur l’ADN tels que la perte de base ou des mutations aux conséquences dramatiques (cancers) sont observés (48).
Effets néfastes du soleil :
Si le soleil est indispensable au corps humain (synthèse de la vitamine D), une exposition prolongée et intense à ses rayons, sans précaution, peut entraîner des coups de soleil (érythèmes) ou des lésions plus profondes, conduisant au photovieillissement des tissus et/ou au développement de cancers cutanés. Les rayons ultraviolets (UV), particulièrement énergétiques, sont capables d’induire la formation de radicaux libres via les chromophores tels que les flavoprotéines et les quinones. Ils sont donc indirectement responsables de l’oxydation des molécules constitutives de la cellule (acides nucléiques, lipides, protéines, glucides). Les ultra-violets B, absorbés par l’ADN, créent des lésions directes du matériel génétique tel que des mutations, des formations de dimères de thymines, des ruptures de liaisons. Ils provoquent également une altération du processus de transcription. Lorsque les lésions causées sont trop importantes et que le système de réparation se trouve dans l’incapacité de régénérer l’ensemble des cellules endommagées, celles-ci peuvent alors évoluer vers un état cancérogène (66).
Rôle dans la cancérogenèse
La cancérogenèse est un processus complexe multi-séquentiel menant une cellule de l’état sain à un état précancéreux et, finalement à un stade précoce de cancer. Le développement du cancer se divise en trois grandes étapes: l’initiation, la promotion et la progression. Cette dernière phase correspond à un emballement du processus tumoral dû à l’incapacité de l’organisme de reconnaître comme anormales les cellules cancéreuses, à la persistance du facteur causal ou à des perturbations dans les mécanismes de réparation de l’ADN oxydé. La présence d’un stress oxydant contribuera à cet emballement. Ainsi, par exemple, l’activité du facteur AP-1 qui régule l’expression des médiateurs de croissance cellulaire, est contrôlée par des concentrations physiologiques en EOA. Par contre, si trop d’EOA sont produites, le facteur AP-1 sera surexprimé et conduira à une prolifération anormale de cellules. L’agent pro-oncogène p21Ras (C-ras) est impliqué dans différents processus comprenant les proliférations et différentiation cellulaires et l’organisation du cytosquelette. Dans différentes tumeurs, une surexpression de Ras a été mise en évidence. Des travaux in vitro ont montré l’implication des EOA comme médiateurs d’un cycle de progression cellulaire induit par Ras (49).
Dans des conditions normales, le cycle cellulaire est constamment en activité. Si des cellules impliquées dans la division sont endommagées pour diverses raisons, elles ont la capacité d’interrompre temporairement leur cycle de progression dans les phases G1, S ou G2 (“checkpoints”), de réparer les dégâts puis de redémarrer le cycle (71). Toutefois, si les dégâts sont trop importants, il existe un processus important d’élimination sélectif des cellules altérées qui est appelé apoptose. Au cours de l’apoptose, qui fait partie de la physiologie normale d’un individu, les cellules mettent en place un mécanisme de suicide programmé qui se traduit par de nombreux changements morphologiques. Lors de la prolifération cellulaire, la protéine p53 joue un rôle primordial en vérifiant l’intégrité de l’ADN. Elle mettra ainsi en place des mécanismes permettant d’éliminer, par exemple, les bases oxydées de l’ADN responsables de mutations. En cas de dégâts cellulaires trop importants, la protéine p53 déclenchera alors la mise à mort de la cellule par apoptose (figure 5).
Une activité non contrôlée de l’apoptose peut s’avérer néfaste pour l’organisme car elle conduirait alors à la destruction de cellules saines.
Il existe un système de régulation composé de substances pro-apoptotiques (Par exemple la protéine p53) et anti-apoptotiques. Parmi ces dernières figures le facteur de transcription NFκB dont l’activation est-elle même régulée par les EOA (Figure 6) (16). Dans sa forme inactive, ce facteur existe sous la forme d’un trimère composé des sous-unités p65, p50 et IκBα En réponse à un stress oxydant, l’unité IκBα se dissocie et la forme activée de NFκB (dimère p65/p50) peut alors migrer dans le noyau et activer des gènes codant pour l’expression de molécules anti-apoptotiques (70). Le problème n’est toutefois pas aussi simple car des réponses différentes in vitro (activation ou inhibition du facteur) ont été observées en fonction du type de cellules et de la concentration en EOA utilisées.
Rôle dans les maladies neurodégénératives
Le cerveau est particulièrement vulnérable aux dommages oxydatifs en raison de ses niveaux élevés en acides gras polyinsaturés (qui sont facilement attaqués par les radicaux libres), de ses niveaux relativement élevés d’ions de métaux de transition, et de sa forte utilisation d’oxygène (56).
Les dommages cellulaires, dus aux radicaux libres et au stress oxydatif, semblent jouer un rôle majeur dans la pathogenèse de nombreuses maladies neurodégénératives. Au cours du vieillissement, les neurones diminuent leurs capacités de compenser le déséquilibre biologique provoqué par les radicaux libres. Cette surcharge de radicaux libres contribue à la mort neuronale qui est caractéristique de plusieurs maladies neurodégénératives.
Les EOA sont capables d’oxyder les composants cellulaires (tels que les lipides membranaires, les protéines et l’ADN), ce qui pourra provoquer l’apoptose qui provoque selon la localisation des neurones des maladies tels que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique (Les maladies neurodégénératives les plus communes) (25).
Rôle dans l’anémie drépanocytaire
La polymérisation intracellulaire de HbS pendant la désoxygénation est l’événement pathologique primaire au cours de la drépanocytose. La polymérisation est capable de transformer un globule rouge normal en une cellule dense, inflexible. La phase de réoxygénation est une source importante de radicaux libres. Pendant cette période les globules rouges normaux peuvent générer une quantité importante de superoxyde en raison d’un électron transféré entre le fer hémique et l’oxygène. En présence d’oxygène, l’hème s’auto-oxyde induisant la formation de méthémoglobine et de superoxyde (2, 219). Certaines études ont montrés que l’HbS s’auto-oxyde 1,7 fois plus rapide que l’HbA (84) tandis que d’autres présentent un taux comparable. Contrairement à l’HbA qui peut contrer cette réaction pour former des sous-produits inoffensifs, l’HbS peut être dépassée par la production continue de superoxyde et par l’intermédiaire de sa dismutation. La formation de H2O2 exposée à la méthémoglobine, se décompose et libère le fer de l’hémoglobine. Ce fer peut alors réagir avec le reste de H2O2 pour produire d’avantage de l’OH-, le plus réactif et préjudiciable des espèces réactives. Les cellules falciformes génèrent environs une quantité deux fois plus grande de superoxyde, H2O2, OH- que l’HbA.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : Rappels sur les radicaux libres
I.1- Définition, Origines et Destinée des radicaux libres
I.1.1- Définition
II-Les espèces réactives: structure et réactivité
II-1. Espèces réactives de l’oxygène
II-2. Espèces réactives de l’azote
II-3. Rôles des métaux de transition
II-4. Sources métaboliques de ROS et de RNS
I.2-Stress oxydant
Chapitre II : Rôle des radicaux libres dans la Pathogenèse
I- Rôle dans l’apparition du diabète sucré
II- Rôle dans le dysfonctionnement endothélial
III- Rôle dans le vieillissement de la peau
IV- Rôle dans la cancérogenèse
V- Rôle dans les maladies neurodégénératives
VI-Rôle dans l’anémie drépanocytaire
Chapitre-III : Rôle des antioxydants dans la détoxification de l’organisme
I- Les systèmes de défense enzymatiques
I-1 Les superoxydes dismutases
I-2 Les glutathions peroxydases
I-3 La catalase
II-Les systèmes non enzymatiques
II-1-Le glutathion et les protéines-thiols
II-2 L’acide ascorbique
II-3-La vitamine E
II-5 La bilirubine
II-6 Le Coenzyme Q10
II-7 Les oligoéléments
Chapitre-IV : Les composés phénoliques et la prévention du stress oxydatif
I. Généralités
II-structure et classification
II-1- Les coumarines
II-2-Les flavonoïdes
II-2-1 Flavonoïdes hétérosides
II-2-2 Les flavonoïdes aglycones
II-3 Les tanins
II-3-1 Les tanins hydrolysables
II-3-2 Les tanins non hydrolysables
III-Propriétés chimiques des polyphénols
III -1 Nucléophilie
III-2 Propriétés réductrices
III-3 Polarisabilité
III-4 Liaison hydrogène
III-5 Stabilité des polyphénols
III-6 Rôle des polyphénols dans les plantes
III-7 Importance nutritionnelle des polyphénols
Chapitre-V : Méthodes d’évaluation de l’activité antioxydante
I-Test DPHH
II- Reduction de fer: FRAP
Chapitre-VI : Revue bibliographique sur Psidium guajava
I- Nomenclature
II- Description botanique
IV – Techniques de plantation
V – Etudes réalisées sur la chimie
III.6 – Activités pharmacologiques
III.7 – Usages ethnopharmacologiques
III.8 – Etude sur la toxicité
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre-I : Matériels et méthodes
I-1 Cadre d’étude
I-2 Objectif de l’étude
I-3 Matériels et réactifs
I-3-1. Matériel végétal
I-3-2. Matériel de laboratoire
I-3-3. Réactifs
I-4. Méthodes d’étude
I-4-1. Extraction
I-4-2. Mode opératoire
I-5. Etude de l’activité antioxydante
I-5-1 Protocole expérimentale du test au DPPH
I-5-2 Expressions des résultats et analyse statistique
Chapitre-II : Résultats
Chapitre-III : Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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