Rôle de Notch3 dans le remodelage cardiaque

Les cellules musculaires lisses vasculaires

  Les CMLV sont des cellules allongées de 2-5µm de diamètre et de longueur variable pouvant atteindre jusqu’à 500µm, et elles sont uninuclées. Tout comme les cellules musculaires cardiaques, elles possèdent de l’actine et de la myosine, cependant ces filaments ne sont pas organisés et ne forment pas de myofibrilles individualisées. De plus, leur contraction est également la résultanted’un cycle calcique intracellulaire permettant le mécanisme général de contraction-relaxation. La différence majeure étant l’absence de troponine C dans les CMLV. La régulation de la contraction-relaxation des CMLV se fait de 2 manières : par le système nerveux (SN) autonome ou par contrôle hormonal. Concernant le SN autonome, le SN sympathique semble avoir une action principalement vasoconstrictrice, via la noradrénaline. Cependant, il semble que la réponse du SN sympathique à la noradrénaline dépende du type de récepteur mis en jeu : les récepteurs α-adrénergiques ont une action vasoconstrictive alors que les récepteurs β-adrénergiques ont une action vasodilatatrice. S’ajoute à cela, le SN parasympathique qui lui est décrit comme ayant une action vasodilatatrice, bien que son rôle soit moins marqué. Du point de vu hormonal, les CMLV sont régulées par nombre d’hormones mais les cellules endothéliales ont une importance majeure dans ce contrôle. En effet, bien que les agents vasoconstricteurs exercent une action directe sur les CMLV, les vasodilatateurs agissent le plus souvent de façon indirecte via les cellules endothéliales. L’activation des cellules endothéliales par des agents relaxants ou des contraintes de cisaillement va leur faire sécréter du NO, qui va diffuser vers les CMLV adjacentes, et va alors activer la GC (gyanylatecyclase), entrainant la production de GMPc(Guanosine monophosphate cyclique). Cette augmentation de GMPc intracellulaire dans les CMLV active la PKG (Protéine Kinase G) qui phosphoryle en retour le phospholambane, qui stimule le recaptage du Ca2+ (calcium)par SERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase). Tout ceci entrainela relaxation des CMLV donc la vasodilatation. Les vasoconstricteurs, dans la plupart des cas, vontdirectement se lier aux récepteurs présents sur les CMLV et ainsi activer la PLCβ(Phospholipase β) qui va libérer IP3 (inositol-1,4,5 triphosphate) et DAG (diacylglycérols)et in fine aboutir à une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+. Outre leur rôle dans le tonus vasculaire grâce à leur activité contractile, les CMLV modifient leur phénotype en réponse aux changements environnementaux. Ainsi elles peuvent passer d’un phénotype différencié « contractile » à un phénotype dédifférencié dit « sécrétoire ». Ce dernier phénotype a été mis en évidence dans certaines pathologies artérielles telles que l’athérosclérose oul’hypertension artérielle. Le phénotype sécrétoire des CMLV se caractérise par lacapacité de prolifération et de migration ainsi qu’une synthèse accrue de MEC (Matrice ExtraCellulaire).Concernant les voies de signalisations mises en jeu dans la dédifférenciation des CMLV, plusieurs acteurs ont été mis en évidence. Ainsi, en réponse à un stress mécanique, sont induites des molécules régulatrices tels que des facteurs de transcription (c-Fos, Sp1, Egr1), des molécules de signalisation (JNK, P38, ERK), des facteurs de croissance (FGF-2, PDGF)1–4, leur expression étant rapide et transitoire. Il a aussi été montré que PDGF BB (Platelet-Derived Growth Factor-BB) et TGFβ (Transforming Growth Factor β) modulent cette dédifférenciation : PDGF-BB inhibe l’expression des gènes codant les protéines contractiles des CMLV, a contrario du TGFβ. De plus, la voie Notch3 interagit avec les voies du PDGF-BB6 et du TGFβ7,pour moduler la migration et la différenciation des CMLV via l’activation de kinases telles que : ERK (Extracellular signal- Regulated Kinase), JNK (c-Jun-N-terminal Kinase), p38 MAPK, AKT (RAC-alpha Serine/Threonin-protein), Rho/Rho-kinase, et calcineurine/calmoduline kinase.

L’angiogenèse

   L’angiogenèse est le processus de croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux pré-existants. C’est un processus physiologique se retrouvant notamment lors de la croissance, de l’exercice physique ou de la grossesse, permettant d’assurer un meilleur apport en oxygène aux organes quand leur demande s’accroit. Cependant, il est également retrouvé lors de processus pathologiques (hypoxie, cancer). Il est notamment établit qu’un déficit d’angiogenèse participerait au développement de l’insuffisance cardiaque. La formation de nouveaux vaisseaux se fait grâce à la prolifération de cellules endothéliales. Il existe plusieurs voies de signalisation contrôlant le processus d’angiogenèse, et la principale est la voie du VEGF (VascularEndothelial Growth Factor). Cette famille est constituée de 5 ligands, qui sont des protéines sécrétées : VEGF-A (le premier découvert et le plus étudié),B,C,D et le PlGF (placentalGrowth Factor); et de 3 récepteurs transmembranaires à activité tyrosine-kinase: VEGFR1 à 3, ainsi que la forme soluble de VEGFR1 (sVEGFR1).Contrairement à VEGFR1 et 2 dont la localisation est endothéliale, VEGFR3 est présent dans les vaisseaux lymphatiques.VEGF-Ase lie préférentiellement à VEGFR1 (aussi appelé Flt1), mais il se lie également à VEGFR2 (aussi appelé Flk1). Bien que l’affinité pour VEGFR2 soit moindre (10 fois supérieur pour le VEGFR1),il estle plus fort médiateur de l’activitédu VEGF-A, la transduction du signal par VEGFR1 étant très réduite11. Il semble que VEGFR1 sert à piéger VEGF-A afin de réduire l’activité de VEGFR2.sVEGFR1 (ou sFlt1) semble également jouer ce rôle de piège en se liant à VEGF-A et PlGF, empêchant leurs activités angiogéniques. Cependant, VEGFR1 ne se cantonne pas à ce rôle car il a été mis en évidence que sa liaison avec PlGF active l’angiogenèse. Concernant le VEGFR2, la délétion du gène VEGFR2 chez la souris est létale par des défauts de vascularisation, et son implication a été décrite dans la croissance, la survie et la migration des cellules endothéliales durant la vie embryonnaire et la vie adulte. Tout cela confirme son rôle proangiogenique. La disponibilité de l’oxygène est un modulateur majeur de l’expression de VEGF-A. En effet, le gène codant pour VEGF-A possède des domaines HRE (Hypoxia Responsive Enhancer) permettant la liaison du facteur de transcription HIF1 (Hypoxia Inducible Factor 1) en condition hypoxique.

Le cœur

   Le cœur est une pompe musculaire striée active en permanence afin d’assurer une irrigation continue des organes par le sang. Le cœur possède 4 cavités: 2 ventricules et 2 oreillettes. Le côté droit reçoit le sang pauvre en O2 (oxygène) via l’oreillette droite, alors que le côté gauche reçoit un sang riche en O2 après le passage par les poumons. La séquence rythmique et synchrone des contractions cardiaques est due à la propagation du flux électrique propagé de cellules en cellules, via les jonctions gap, composées de connexines. Le coeur est composé de 3 couches : l’endocarde qui est une couche monocellulaire endothéliale tapissant les cavités internes, le myocarde, et au niveau externe l’épicarde qui fait partie du péricarde. Les composants majeurs du myocarde sont les cellules musculaires striées : les cardiomyocytes. La contraction musculaire se fait grâce à dépolarisation des cardiomyocytes. Le couplage excitation-contraction se traduit par une accumulation de Ca2+ intracellulaire lors de la systole, le Ca2+se lie à la troponine C permettant la liaison actine-myosine, et donc la contraction du sarcomère. A la fin de chaque contraction le Ca2+est réabsorbé par le réticulum sarcoplasmique via des pompes membranaires en particulier les SERCA. Le cœur s’adapte aux changements hémodynamiques, afin de pouvoir garder un fonctionnement le plus optimal possible et garantir une survie de son porteur la plus longue possible. Cette adaptation structurelle et fonctionnelle, est appelée remodelage cardiaque. On en distingue deux modes, le remodelage cardiaque physiologique, présent par exemple chez la femme enceinte ou le sportif ; et le remodelage cardiaque pathologique, en réponse à l’hypertension artérielle et l’infarctus du myocarde, par exemple. Le paramètre commun à ces deux remodelages sera l’hypertrophie cardiaque, mais l’évolution sera différente.

Les voies de signalisation

   L’un des déterminantscellulaire associé à l’hypertrophie cardiaque concerne la concentration en Ca2+intramyocytaire. Il existe un équilibre de la concentration de Ca2+ cytosolique : une augmentation du Ca2+ dans le cytosole, via sa libération par le réticulum sarcoplasmique par RyR2 (Ryanodin Receptor 2)ou venant du milieu extracellulaire via les LTCC (L-type Ca2+channel), induit la contraction cardiaque ; la relaxation a lieu lorsque ce Ca2+ est recapté par le réticulum sarcoplasmique par SERCA ou sorti de la cellule par NCX (Na+ /Ca2+exchanger). Il est bien établi que tout défaut de cet équilibre entraine des dysfonctions contractiles. Ainsi une régulation négative de SERCAa a été clairement démontrée dans les modèles expérimentaux  et chez les patients atteints d’insuffisance cardiaque. Mais aussi altération de RyR2 peut entrainer une augmentation de Ca2+intracytosolique induisant une dysfonction cardiaque. L’augmentation du Ca2+ cytosolique va également réguler deux voies de signalisation majeures de l’hypertrophie cardiaque. La première, qui est la voie calcineurine/NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) est notamment activée par la liaison de l’AngII à son récepteur ATR1 (Angiotensin II receptor type 1) couplé aux protéines G. Lorsqu’elle est activée la calcineurine va déphosphoryler NFAT ce qui permet sa translocation au noyau et l’activation de la transcription de gènes impliqués dans l’hypertrophie cardiaque pathologique, qui sont pour la plupart des gènes du programme fœtal. Cette voie a été montrée nécessaire et suffisante pour induire une hypertrophie cardiaque pathologique. La deuxième voie de signalisation ayant montré un rôle indéniable dans l’hypertrophie cardiaque pathologique est celle de la CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein Kinase II). Il est montré que l’activation de cette serine/threonine protéine kinase induit l’hypertrophie cardiaque en particulier via la phosphorylation de HDAC4 (Class II Histone Deacetylase 4) qui se dissociant du facteur de transcription MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), va lui permettre d’être transloqué au noyau et d’activer ses gènes cibles. Là encore il a été montré que l’activation de MEF2était suffisante à l’induction de l’hypertrophie cardiaque pathologique. Une autre voie de signalisation semble participer à l’hypertrophie cardiaque pathologique, celle des MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase).Les MAPK se répartissent en 3 sous familles : la famille ERK, la famille JNK, et la famille p38-MAPK. Leur activation a lieu via des récepteurs couplés aux protéines G tel qu’ATR1, ou par le stress mécanique (par exemple lors d’une hypertension artérielle). Bien que nombres d’études montrent leur implication dans l’hypertrophie pathologique, cette implication n’en reste pas moins débattue par d’autres.

Table des matières

Introduction
Partie 1 : Rôle de Notch3 dans le remodelage cardiaque
1. Le réseau vasculaire
a. Les artères
L’endothélium
Les cellules musculaires lisses vasculaires
b. L’angiogenèse
c. Le remodelage vasculaire
2. Remodelage cardiaque
a. Le cœur
b.Hypertrophie cardiaque physiologique
Les voies de signalisation
L’angiogenèse
c. Hypertrophie cardiaque pathologique
Les voies de signalisation
La fibrose
Le stress oxydant
3. Notch3
a. Généralités
Le récepteur Notch
Les ligands
La voie de signalisation
Les gènes cibles
b. Rôles physiopathologiques
Rôles de Notch3 dans les CMLV
Notch3 et CADASIL
Notch3 et l’HTAP
Notch3 etles pathologies cardiovasculaires et rénales
Chapitre 2 : Rôle de la Connexine dans le remodelage rénal
1. Le rein
a. Fonction
b. Structure
Le rein
Le néphron
2. La maladie rénale aigüe
a. Définition
b. L’ischémie-reperfusion rénale
Mort cellulaire
L’apoptose
La nécrose
Inflammation
Les neutrophiles
Les macrophages
Les autres acteurs de l’immunité
3. Les jonctions gap
a. Généralités
b. La Connexine 43
c. Connexine 43 et physiopathologies
Cx43 et l’inflammation
Cx43 dans le cœur, le système nerveux central et les poumons
Cx43 et le rein
Les vaisseaux
Les cellules tubulaires
Les podocytes
Les cellules mésangiales
Objectifs
Matériels et méthodes
I- Modèles animaux
1. Lignées Notch3
a. Souris surexprimant N3ICD dans les CMLV
b. Souris Notch3 KO
2. Lignées Cx43
a. Souris hétérozygote pour la Cx43
b. Souris invalidée pour la Cx43 dans les tubules rénaux
c. Souris invalidée pour la Cx43 dans les cellules endothéliales
II- Modèles expérimentaux
1. Modèles d’hypertrophies cardiaques
a. Hypertension artérielle par infusion d’Angiotensine II
b. Surcharge de débit induite par un entrainement physique
2. Modèle d’agression rénale aigüe par ischémie-reperfusion
III- Evaluations fonctionnelles
1. Projet Notch3
a. Mesure de la pression artérielle par tailcuff
b. Mesure de la fonction cardiaque par échocardiographie
c. Mesures de la vasoréactivité rénale
2. Projet Cx43
Mesurede la fonction rénale
IV- Mise à mort des souris et prélèvement des organes
1. Projet Notch3
2. Projet Cx43
V- Analyse de l’expression des ARNm
1. Projet Notch3
a. Extraction des ARN totaux et réverse transcription
b. RT-PCR quantitative
2. Projet Cx43
a. Extraction des ARN totaux et réverse transcription
b. RT-PCR quantitative
VI- Analyse de l’expression protéique
a. Extraction protéique
b. Western Blot
VII- Histologie
1. Projet Notch3
a. Marquages par immunofluorescence
b. Etude de la fibrose par coloration au Rouge Sirius
c. Etude du stress oxydtif par marquage au DHE
2. Projet Cx43
a. Evaluation des dommages morphologiques par coloration PAS
b. Marquages par immunohistochimie
VIII-Numération Formule Sanguine par cytométrie en flux
IX- Analyses statistiques
Résultats
Chapitre 1 : La suractivation de la voie de signalisation Notch3 dans les CMLV prévient le développement de la fibrose cardiaque en réponse à l’HTA
Chapitre 2 : Effets de l’invalidation de Notch3 sur le remodelage cardiovasculaire induit par une surcharge de débit
Chapitre 3 : La diminution de la Connexine 43 protège contre la progression de l’insuffisance rénale aiguë chez la souris
Discussion et perspectives
Rôle de Notch3 dans le remodelage cardiaque
Rôle de la Connexine 43 dans le remodelage rénal
Bibliographie

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