Rôle de l’autophagie sur le contrôle de la fonction endothéliale : conséquences pour l’évolution de l’athérosclérose

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Traitement de la plaque d’athérome symptomatique

De nombreuses thérapies ont été développées pour diminuer le risque, le développement et la progression de l’athérosclérose. La majorité des thérapies actuelles cible les facteurs de risque de la maladie comme le diabète, l’hypercholestérolémie et l’hypertension. Parmi ces différents traitements, l’utilisation des statines basée sur la réduction du taux plasmatique de LDL cholestérol est la stratégie la plus utilisée. Au-delà de leurs effets hypolipémiants, les statines possèdent aussi des propriétés anti-inflammatoires. De plus, l’inflammation constitue une nouvelle cible potentielle dans la recherche de nouvelles thérapies visant à prévenir le développement de l’athérosclérose (Ridker et al., 2017). Néanmoins, le traitement actuel des plaques d’athérome avancées relève de la cardiologie interventionnelle et consiste à réaliser une angioplastie avec pose de stent (Figure 13).

Complications des traitements de l’athérosclérose : rôle central de l’endothélium

Le défaut de cicatrisation endothéliale est la principale cause des complications associées à l’utilisation des DES. Ce défaut associé à la non-spécificité des agents anti-prolifératifs utilisés entraîne une inhibition de la prolifération de toutes les cellules environnantes : CE, CML et cellules inflammatoires. De plus, ces stents actifs sont associés à un dysfonctionnement endothélial général qui se caractérise par une perte de biodisponibilité du NO et un déséquilibre de la balance vasoconstricteurs/vasodilatateurs (Curcio et al., 2011).

Les thromboses tardives

La thrombose tardive est l’une des complications principales qui a contrebalancé l’importance donnée aux stents actifs. Cette thrombose est liée d’une part au retard de la cicatrisation endothéliale de la paroi vasculaire et d’autre part à la réaction d’hypersensibilité au polymère du stent. Le problème que présente ce type de complication se manifeste par le fait que la thrombose formée ne se limite pas au stent mais peut également emboliser une région plus en aval et induire un infractus secondaire. Ainsi, au début des années 2000 l’utilisation de ces stents actifs n’a pas montré un bénéfice par rapport aux stent nus car ils n’ont ni réduit le taux de mortalité ni la proportion de thrombose de stent (Kastrati et al., 2007). De plus le suivi clinique à long terme (à partir de 2007) a montré une augmentation de la thrombose pouvant aller jusqu’à 4,5% chez les patients opérés par un DES (éluant de paclitaxel) (Lagerqvist et al., 2007; Räber et al., 2012). Néanmoins, aujourd’hui l’efficacité de la thérapie anti-agrégante (association d’aspirine et d’inhibiteurs de P2Y12) délivrée sur une longue durée a réduit l’incidence de ces thromboses qui ne concerne que 1% des patients (sur 5 ans) (Bønaa et al., 2016).

La néoathérosclérose

La néoathérosclérose appelée aussi athérosclérose intra-stent, se caractérise histologiquement par la présence de cellules spumeuses chargées en lipides dans la néointima. Ces dépôts lipidiques peuvent être associés ou non à des cœurs nécrotiques et des calcifications (Nakazawa et al., 2011; Yahagi et al., 2016). La néoathérosclérose se développe beaucoup plus rapidement qu’une plaque classique. Son développement prend entre 70 jours et quelques années, alors que le développement d’une plaque classique est de l’ordre d’une décennie. Une différence importante existe entre ces deux types de plaques. En effet, le phénomène de rupture est plus fréquent dans la néoathérosclérose car le cœur lipidique/ nécrotique est superficiel et rarement surmonté d’une chape fibreuse épaisse. L’incidence de la néoathérosclérose est deux fois plus forte après utilisation des DES de première génération (31%) que les BMS (16%).De plus, elle est beaucoup plus rapide lors de l’utilisation de DES (entre 70 et 120 jours dépendamment de la drogue utilisée) alors qu’ils apparaissent à 900 jours pour le BMS (Nakazawa et al., 2011). Il est important de noter ainsi que la néoathérosclérose est résponsable de près de 70% des thromboses tardives dans les BMS et plus de 40% dans les DES (Nakamura et al., 2016).

Le cil primaire : un centre de contrôle à la surface cellulaire

Le cil est une extension cellulaire cytoplasmique décrite pour la première fois chez les protozoaires en 1675 par Anton van Leeuwenhoek (Dobell, 1932) mais le terme « cil » n’a été attribué qu’en 1786 par Otto Muller (Beales and Jackson, 2012) et décrit chez les mammifères qu’en 1898 par un anatomiste suisse KW Zimmerman (KW Zimmerman, Arch Mikrosk Anat, 1898 en allemand). Le cil est retrouvé à la surface de la majorité des cellules de mammifères différenciées. Dépendamment de sa capacité motrice et de son ultrastructure axonémale, le cil a été classé en deux catégories : les cils motiles et les cils non motiles appelés encore cil primaire qui a fait plus particulièrement l’objet de ce travail de thèse. Selon le type cellulaire et la fonction spécifique qu’il doit remplir dans chaque organe ou tissu, le cil primaire présente une composition moléculaire différente et sa longueur varie entre 2 et 15 µm. Il a été qualifié d’antenne capable d’intégrer les stimuli extracellulaires biochimiques, biomécaniques, ou osmotiques pour les transmettre à l’intérieur de la cellule en initiant des cascades de signalisation. En effet, en fonction du type cellulaire considéré, il porte à sa surface membranaire différents types de récepteurs comme des canaux calciques, des intégrines ou des récepteurs aux facteurs de croissances. Le cil primaire contrôle ainsi de nombreuses fonctions cellulaires comme la transcription, la prolifération, la migration, la différenciation, la polarité et des fonctions tissulaires comme la morphogenèse, l’intégrité, la réparation. Considéré pendant plus de cent ans comme un organelle vestigial et une excroissance cellulaire insignifiante, son implication dans le développement et la physiopathologie rénale l’a récemment placé sous les projecteurs et a suscité un grand intérêt scientifique (Pazour et al., 2000). Un défaut de structure ou de fonction du cil conduit à des ciliopathies, classe de maladies génétiques chez l’Homme définies par un ensemble de défauts phénotypiques liés à des anomalies du développement embryonnaire ou des dérégulations de l’homéostasie tissulaire chez l’adulte. Initialement décrit et majoritairement impliqué dans le développement embryonnaire, la littérature atteste depuis seulement quelques années d’un rôle majeur de cet organelle dans divers contextes physiopathologiques. Mon projet de thèse s’est particulièrement attaché à identifier le rôle du cil primaire dans les cellules endothéliales dans le contexte des pathologies vasculaires où sa fonction demeure mal comprise. Dans ce chapitre, nous ferons tout d’abord une présentation générale du cil primaire en précisant les mécanismes moléculaires impliqués dans sa biogenèse et en détaillant sa structure avec une mise en avant de l’importance de la composition phospholipidique de sa membrane plasmique. Nous décrirons sa fonction d’antenne dans la perception des stimuli biochimiques et biomécaniques et nous nous attarderons sur son rôle tout particulier dans sa réponse aux forces de cisaillement, concept majeur au niveau de l’endothélium vasculaire. Enfin, son rôle au cours du développement de l’arbre vasculaire, sa fonction dans les cellules endothéliales et dans un contexte de pathologies vasculaire comme l’athérosclérose sera plus précisément détaillé.

Cil primaire : qui es-tu ?

Ultrastructure

Chez les mammifères, il existe : le cil motile et le cil primaire qui définissent deux types de cils en fonction de leur structure axonemale et de leur capacité de motilité.
Le cil motile est organisé en grappe (plus d’une centaine de cils par cellules) et animé de battements coordonnés générant un mouvement de fluide afin de permettre, par exemple, l’évacuation du mucus sur la surface epithéliale bronchique, la circulation du liquide céphalorachidien au niveau de l’épendyme des ventricules cérébraux ou le déplacement des ovocytes dans les trompes de Fallope.
Le cil primaire est quant à lui un organelle cellulaire unique et immobile, localisé à la surface de la majorité des cellules quiescentes différenciées telles que les cellules de la rétine, épithéliales rénales, endothéliales, musculaires, osseuses et neuronales (Christensen et al., 2007; Satir et al., 2010).
Quelque soit le type de cil, leur structure est très conservée. En effet, le cil est constitué de 3 parties distinctes (Figure 16):
– un corps basal formé par les deux centrioles et ancré à la membrane plasmique qui constitue le centre organisateur des microtubules (MTOC, Mircotubules Organisation Center)
– un axonème ou complexe cylindrique qui surmonte le corps basal, composé de microtubules formant une projection externe de la cellule recouvert d’une membrane en continuité avec la membrane plasmique mais dont la composition en terme de phosphoinositide est distincte de celle de la membrane cellulaire (cf. partie I.3 de ce chapitre)
– une zone de transition située entre le corps basal et l’axonème et constituée de fibres en Y organisée en collier ciliaire qui lie la membrane ciliaire. Cette zone constitue une barrière physique entre le cil et le cytoplasme capable de filtrer des protéines destinées au compartiment ciliaire. Elle constitue également une plateforme d’ancrage pour les particules IFT (Intraflagellar Transport) qui migrent vers l’axonème, mais aussi pour des vésicules ciliaires avec le corps basal (Reiter et al., 2012).
Le cil primaire est formé d’un corps basal formé par les deux centrioles, dont le centriole mère est ancré à la membrane plasmique à l’aide des appendices distaux. Ce corps basal est surmonté d’une zone de transition qui se poursuit par l’axonème du cil, formé de 9 doublets de microtubules et entouré par la membrane ciliare.
Par contre, l’axonème des cils présente une structure axonémale caractéristique du type de cil (Figure 17):
– le cil motile présente une structure axonémale dite en « 9 + 2 » constituée de neuf doublets périphériques de microtubules associés à une paire centrale reliés entre eux par des ponts radiaires. La présence de bras de dynéines entre les doublets de microtubules est nécessaire pour générer le mouvement de ces cils.
– le cil primaire non mobile présente une structure axonémale dite en « 9 + 0 » constituée de neuf doublets périphériques de microtubules.
Il existe des exceptions à cette classification sur la structure axonémale des cils. C’est le cas du le cas du monocil nodal « 9 + 0 » ou du nœud embryonnaire de Hensen qui est mobile et qui permet grâce à ses battements coordonnés la mise en place de la symétrie droite/gauche de l’embryon. De même, les cils de l’oreille interne au niveau de la cochlée sont immobiles et pourtant de structure « 9+2 ».
(A) Schéma décrivant les différents types de cils: les cils motiles de structure axonémale « 9+2 » et non motiles ou cil primaire de structure axonémale « 9+0 ». (B-C) Images de microscopie électronique à balayage de cils motiles de cellules multicilliées de trachée chez la souris (B) (extraite de (Ishikawa and Marshall, 2011)) et d’un cil primaire d’une culture de cellules endothéliales d’embryon de poulet (C) (extraite de Egorova et al., 2012).

La ciliogenèse

La ciliogenèse est un processus finement régulé qui permet la formation du cil primaire à partir du centriole mère quand la cellule quiescente entre en phase G0 du cycle cellulaire. Le matériel vésiculaire nécessaire à l’assemblage du cil primaire pourrait avoir pour origine l’appareil de Golgi et les endosomes de recyclage (Pedersen et al., 2008).
Suite à des analyses de microscopie électronique à transmission, des travaux très anciens de 1968 ont montré que la ciliogenèse pourrait être réalisée par deux voies distinctes (Sorokin, 1968) (Figure 18) :
– la voie intracellulaire ou « voie classique » se déroule dans les cellules non polarisées comme les fibroblastes où le cil primaire émerge d’une invagination de la membrane plasmique appelée la poche ciliaire. Plus précisément, une vésicule ciliaire interagit avec l’appendice distal du centriole mère situé près du noyau, l’axonème émerge et s’allonge de cette vésicule qui grossit et fusionne avec la membrane plasmique, dont l’invagination forme la poche ciliaire (Ghossoub et al., 2011). La poche ciliaire est caractérisée par la présence de vésicules à clathrine participant à un trafic vésiculaire actif caractérisant cette région.
– la voie extracellulaire ou « voie alternative » est observée dans les cellules polarisées comme les cellules épithéliales où le centriole mère s’ancre directement à la membrane plasmique pour former le corps basal du cil primaire. Cette voie ne nécessite pas de formation de poche ciliaire, le cil primaire croît directement dans le milieu extracellulaire. Lorsque le cil primaire n’est pas enchâssé dans la poche ciliaire, son rôle de senseur biomécanique serait favorisé (Mazo et al., 2016). En effet, libre de mouvement comme au niveau des cellules épithéliales rénales, il pourrait mieux capter les modifications de flux urinaire. Les cellules endothéliales, étant polarisées et sensibles aux variations du flux sanguin à travers cet organelle, ces cellules devraient également utiliser la voie extracellulaire pour assembler leur cil. Néanmoins, ce phénomène n’a pas été expérimentalement décrit dans la littérature pour ce type cellulaire.
Ainsi, en fonction du type cellulaire la position du centrosome et la présence éventuelle de la poche ciliaire pourrait permettre de prédire la voie d’assemblage du cil et sa future fonction.
Selon le type cellulaire, la ciliogenèse peut se dérouler de deux façons différentes: la voie intracellulaire (cellules non-polarisées) et la voie extracellulaire (cellules polarisées).
La voie intracellulaire comporte les étapes suivantes: 1/ le centriole mère s’associe avec une vésicule ciliaire par son appendice distal; 2/ allongement de l’axonème dans la vésicule ciliaire; 3/ fusion de la poche ciliaire avec la membrane plasmique et assemblage terminal de l’axonème. Les cellules polarisées adoptent la voie extracellulaire : 1’/ le corps basal s’ancre directement à la membrane plasmique; 2’/ nucléation des microtubules qui forment l’axonème dans l’environnement extracellulaire. D’après (Suizu et al., 2016).

Mécanismes moléculaires impliqués dans l’assemblage du cil

L’assemblage du cil est favorisé par un transport actif des constituants de l’axonème médiés par des mécanismes moléculaires complexes impliquant à la fois des protéines de transport comme les particules IFT associées à des protéines motrices les kinésines, les dynéines, mais également des protéines qui contrôlent le trafic extra- et intra-ciliaire comme les GTPases de la famille Rab.

Le transport intraflagellaire : rôle des protéines IFT et des protéines motrices  kinésines/dynéines

Bien qu’il présente une continuité de la cellule, la formation du cil primaire se fait au sein d’un compartiment indépendant du corps cellulaire. Le cil n’étant pas pourvu d’activité de traduction, toutes les protéines nécessaires à sa formation et à sa fonction sont synthétisées au niveau du cytoplasme, puis transportées au niveau de l’axonème par un transport actif appelé transport intraflagellaire assuré par les protéines IFT associées à 8 protéines BBS ou BBSome qui assurent le trafic des protéines de la membrane ciliaire (Nakayama and Katoh, 2018)(Figure 19). Ce transport est bidirectionnel et permet le déplacement des protéines le long de l’axonème entre les doublets de microtubules et la membrane ciliaire, depuis la base jusqu’à l’extrémité distale du cil primaire (Kozminski et al., 1993). Leur vitesse de déplacement dans le sens antérograde est d’environ 2 µm/sec contre 3,5 µm/sec dans le sens rétrograde. La localisation précise de ces protéines a été obtenue par microscopie électronique à transmission et montre qu’elles forment des trains localisés entre le doublet externe et la membrane du cil (Kozminski et al., 1993, 1995).
Les protéines IFT sont dépourvues d’activité enzymatique (excepté les GTPases IFT22 (ou Rabl5) et IFT27 (ou Rabl4)) et s’organisent en deux complexes (Figure 19):
– IFT- A qui assure le transport rétrograde de l’extrémité distale de l’axonème vers la base du cil. Il est formé de 6 sous-unités, 3 qui forment le cœur du complexe : IFT144, IFT140 et IFT122 et de 3 autres situées à la périphérie IFT139, IFT43 et IFT121 (Lechtreck, 2015; Nachury, 2014)
– IFT-B assure le transport antérograde des composants du cil de la base vers l’axonème. Il est composé de 14 sous-unités : 9 d’entre elles forment le cœur du complexe appelé IFT-B1 qui est formé par les sous-unités IFT88, IFT81, IFT74, IFT52, IFT46, IFT27, IFT70 et HSPB11/IFT25 et 5 autres situées à la périphérie forme le sous-groupe IFT-B2 composé des sous-unités IFT172, IFT80, IFT57, TRAF3IP1/IFT54, IFT38 et IFT20 (Taschner et al., 2016).
Ces deux complexes permettent l’assemblage et la résorption du cil en maintenant un état d’équilibre qui contrôle la longueur du cil et son intégrité. Ce transport est sélectif et très spécifique du fait que les particules IFT présentent plusieurs domaines et motifs impliqués dans les interactions protéines-protéines tels que les domaines WD (Tryptophan-aspartic acid repeat), TRP (tetratri- copeptide repeats) et coild-coiled (Cole, 2003). Ces motifs permettent l’interaction des IFT entre elles et des IFT avec les protéines cargo. A titre d’exemple, IFT46 permet le transport des bras externes des dynéines (Ahmed et al., 2008), IFT81/74 permet le transport de la tubuline (Bhogaraju et al., 2013) et IFT-A qui peut lier la protéine TULP3 (Tubby like protein 3) permettant ainsi la localisation de certains récepteurs couplés aux protéines G (Mukhopadhyay et al., 2010). Les IFT20/54 sont quant à elles impliquées dans le transport des vésicules provenant de l’appareil de Golgi (Follit et al., 2006; Omori et al., 2008).
Le trafic bidirectionnel des IFT le long des microtubules polarisés de l’axonème est facilité par l’action de deux familles de protéines motrices (Pedersen and Rosenbaum, 2008) (Figure 19):
– les kinésines II qui permettent le transport antérograde de la base du cil vers l’extrémité distale de l’axonème. Elles sont formées par un complexe hétérotrimérique composé de deux sous-unités motrices KIF3A (Kinesin Family member 3A) et KIF3B ainsi que d’une troisième non motrice appelé KAP3 (KIF-Associated Protein).
– les dynéines II qui assurent le transport rétrograde des IFT du coté distal de l’axonème vers la base du cil. Ce complexe conservé au cours de l’évolution, se compose d’une ou de plusieurs chaînes lourdes de familles AAA+ à activité motrice ATPasique, ainsi que plusieurs protéines accessoires nécessaires pour la régulation de l’activité motrice. A ce jour, quatre sous unités différentes du complexe dynéines II ont été identifiés : une chaîne lourdes DYNC2H1, une chaîne intermédiaire légère DYNC2LI1, une chaîne intermédiaire putative et une chaîne légère. (Pedersen et al., 2008; Pfister et al., 2005; Rompolas et al., 2007).
La littérature indique que ces deux moteurs du transport intraflagellaire sont indispensables pour l’assemblage et le fonctionnement du cil primaire. En effet, plusieurs études chez la souris ont montré que l’absence de KIF3A entraine une inhibition de l’assemblage du cil primaire (Marszalek et al., 1999; Nonaka et al., 1998; Takeda et al., 1999). De façon similaire, l’importance de la dynéine dans l’assemblage du cil a été mise en avant par des études utilisant des embryons de souris mutantes pour la chaîne lourde de la dynéine II. Ces souris étaient incapables de former des cils de longueur normale et ont présenté des phénotypes compatibles avec la dysfonction ciliaire (Rana et al., 2004).
Les BBsomes (en bleu) impliqués dans le transport des cargos et des précurseurs ciliaires tels que les RCPG (en rouge) ou la tubuline (en vert) sont transportés de l’extrémité proximale de l’axonème vers l’extrémité distale par un transport antérograde le long des microtubules ciliaires avec l’aide des moteurs Kinésines-2 (rouge et bleu) qui s’associent aux complexes de transport intraflagellaire B (orange). Le transport rétrograde de ces composants ciliaires vers l’extrémité proximale du cil primaire est assuré par les moteurs Dynéines-2 (Bleu et marron) qui s’associent au niveau de l’extrémité distale de l’axonème au complexe IFT-A (violet). A la base du cil ces complexes se désassemblent au niveau de la zone de transition et quittent le cil .D’après (Nakayama and Katoh, 2018).
Abréviations: IFT: Intraflagellar transport. RCPG: Récepteurs couplés à la protéine G.

Contrôle du trafic ciliaire : rôle des Rab-GTPases

Les GTPases de la famille Rab, classiquement impliquées dans l’organisation des endomembranes, le transport et l’identité du trafic des vésicules appartiennent à la famille conservée des petites Ras-like GTPases ; sont également des acteurs importants et indispensables pour le déroulement de la ciliogenèse. Comme les autres GTPases, les Rab oscillent d’un état actif lié au GTP versus un état inactif lié au GDP coordonné respectivement par l’action de GAP (Guanine Activating Factor) ou de GEF (Gauanine Exchange Factor). Une ancienne étude sur les cellules épithéliale rétiniennes RPE-1 (Retina Pigmented Epithelial Cell) a montré que Rab8 est une GTPase majeure et nécessaire à la formation du cil primaire (Yoshimura et al., 2007). En effet, Rab8, qui est classiquement un régulateur de l’exocytose, est la seule des trois GTPases à avoir été localisée au cil primaire et une des premières Rab associée à ce compartiment cellulaire. Son implication dans la ciliogenèse est facilitée par Rab11 activée, une GTPase qui participe classiquement au recyclage des endosomes précoces vers la membrane plasmique. En effet, Rab11 stimule le recrutement au centriole mère de la Rabin8, un facteur d’échange GTP/GDP de Rab8 et active la Rabin8 sous sa forme liée au GTP. Rabin8 activée joue alors le rôle de facteur d’échange pour Rab8 qui, liée au GTP, participe au recrutement d’acteurs protéiques nécessaires à la croissance du cil (Knödler et al., 2010). Récemment d’autres études ont mis en avant un rôle pour d’autres Rab comme Rab23 qui se localise dans le cil primaire des cellules MDCK pour assurer le renouvellement ciliaire du récepteur Smo (Smoothened cf. II.1.1. a dans ce chapitre) et d’autres récepteurs membranaires (Boehlke et al., 2010a). En effet, en interagissant avec Kif17 et l’IFT-B, Rab23 semble assurer la localisation de récepteurs spécifiques aux cils primaires tels que le récepteur D1R (Dopamine receptor D1-type) (Leaf and Von Zastrow, 2015).

La membrane du cil primaire : importance de sa composition lipidique en phosphoinositides

Même si la membrane du cil primaire présente une continuité avec la membrane plasmique, il est considéré comme un compartiment spécialisé qui présente une composition membranaire différente à la fois en protéine et en lipide. Les premières études décrivant la composition lipidique de la membrane ciliaire indiquaient la présence de sphingolipides et de stérols chez la paramécie, le trypanosome ou dans les cellules de mammifère (Kaneshiro, 1987; Janich and Corbeil, 2007; Tyler et al., 2009).
Plus récemment, différents travaux ont permis de mieux caractériser la composition en phosphoinositides de la membrane ciliaire (Chávez et al., 2015; Garcia-Gonzalo et al., 2015). En effet, la membrane ciliaire qui entoure l’axonème est majoritairement composée de PtdIns(4)P. De plus, la région proximale est enrichie en PtdIns(4,5)P2 plus précisément situé au niveau de la zone de transition du cil. Ce profil lipidique conservé est maintenu sur la membrane du cil primaire suite à l’activité de trois 5-phosphatases : OCRL (Occulocerebrorenal syndrome of Lowe), INPP5B (Inositol polyphosphate 5-phosphatase B) et INPP5E (Inositol polyphosphate 5-phosphatase E) localisées récemment au niveau du cil primaire (Jacoby et al., 2009; Coon et al., 2012; Luo et al., 2012). Bien que ces enzymes appartiennent à la même famille de lipides 5-phosphatases, elles présentent des affinités différentes par rapport aux 5-inositols ou 5-phosphoinositides in vitro: OCRL =PtdIns(4,5)P2>PtdIns(3,4,5)P3 ;INPP5B =I(1,4,5)P3>I(1,3,4,5)P4>PtdIns(4,5)P2>PtdIns(3,4, 5)P3 ; INPP5E = PtdIns(3,4,5)P3 >PtdIns(4,5)P2> PtdIns(3,5)P2. C’est à travers l’étude de ces 5-phosphatases dans le compartiment ciliaire que plusieurs travaux ont permis de définir l’importance de la composition de la membrane ciliaire en phosphoinositides sur l’assemblage et la stabilité, le trafic protéique et la signalisation de cet organelle (Figure 20).
OCRL est une 5-phosphatase dont 210 mutations associées au domaine d’activité phosphatase ou du domaine de liaison à RhoGAP ont été identifiées chez des patients atteints du Syndrome de Lowe caractérisé par un retard mental, des dysfonctions rénales et occulaires. Les caractéristiques cliniques de ce syndrome combiné à une localisation ciliaire d’OCRL au niveau de l’axonème et de la base du cil ont conduit à le classer comme pathologie associée aux ciliopathies (cf. partie II.3.a dans ce chapitre pour la définition des ciliopathies). En effet, il a été montré chez le poisson zèbre qu’une invalidation d’OCRL entraine un retard de formation des yeux, du cerveau et la présence de kystes au niveau du rein, signes cliniques des ciliopathies (Coon et al., 2012; Luo et al., 2012). D’un point de vue moléculaire, des travaux plus approfondis ont décrit que cette 5-phosphatase joue un rôle au niveau du trafic de certains récepteurs ciliaires et de la régulation de la signalisation ciliaire via respectivement soit sa capacité à lier des protéines du trafic cellulaire ou soit son activité phosphatase. En effet, OCRL via son domaine protéique ASH (ASPM-SPD2-Hydin, aa 563-678) qui présente un site de liaison aux Rab avec une très forte affinité pour Rab8 pourrait participer au trafic cellulaire du réseau Trans-Golgien vers la base du cil (Coon et al., 2012; Hagemann et al., 2012). Ce processus permettrait d’adresser des protéines au compartiment ciliaire comme la rhodopsine ou le récepteur TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid 4) (Coon et al., 2012; Luo et al., 2012). De même, des travaux récents de Prosseda et al. (Prosseda et al., 2017) démontrent que l’activité 5-phosphatase est nécessaire à la régulation des taux de PtdIns(4,5)P2 pour permettre la localisation ciliaire de Smo (Smoothened cf. II.1.1. a dans ce chapitre) suite à une stimulation par un agoniste spécifique de ce récepteur. Par ailleurs, des travaux indiquent que des fibroblastes de patients, des fibroblastes 3T3 ou des cellules RPE (Retinal Pigment Epithelium) déficients pour Ocrl1 présentent une réduction de la taille et du nombre de cils alors que des cellules MDCK (Mabin-Darby Canine Kidney) exprimant une forme catalytiquement inactive d’OCRL (OCRL KD) présentent des cils primaires plus longs (Coon et al., 2012; Luo et al., 2012; Rbaibi et al., 2012). Ces résultats contradictoires suggèrent que cette 5- phosphatase pourrait jouer des rôles différents sur l’assemblage du cil via son activité phosphatase ou sa capacité d’ancrage à des protéines.
INPP5B, paralogue d’OCRL chez les mammifères, présente la même spécificité qu’OCRL par rapport à ses substrats lipidiques mais ne partage que 45% d’identité avec elle. Bien que ces deux 5-phosphatases présentent des structures protéiques différentes, leur fonction au niveau de la formation du cil semble redondante (Luo et al., 2013; Montjean et al., 2015). Néanmoins, la particularité d’INPP5B est qu’elle doit posséder un domaine CAAX intact pour être localisée au cil et permettre son assemblage (Luo et al., 2013).
INPP5E, localisée au niveau de l’axonème du cil, s’est avérée être une 5-phosphatase clé dans la stabilité du cil primaire (Jacoby et al., 2009; Conduit et al., 2017). Ce rôle majeur dans le maintien du cil lui permet également de réguler la signalisation ciliaire (Chávez et al., 2015)Garcia-Gonzalo et al., 2015) et l’entrée dans le cycle cellulaire (Plotnikova et al., 2015; Phua et al., 2017). Les premiers travaux qui démontraient un rôle d’INPP5E dans la stabilité du cil semblaient indiquer un rôle de son activité PtdIns(3,4,5)P3 5-phosphatase (Bielas et al., 2009; Jacoby et al., 2009). En effet, Jacoby et al. (Jacoby et al., 2009) rapportent que le nombre de MEF (Mouse Embryonnic Fibroblast) ciliées invalidées pour INPP5E était significativement diminué par rapport à des MEF sauvages suite à une stimulation par du sérum ou des agonistes tels que le PDGFRαα. Ce phénotype étant aboli en présence d’un inhibiteur de la voie PI3K (LY294002), les auteurs formulent l’hypothèse que qu’INPP5E serait capable de réguler les taux de PtdIns(3,4,5)P3 intraciliaires permettant le maintien du cil. Cependant ni les niveaux, ni la localisation ciliaire du PtdIns(3,4,5)P3 n’ont été réalisés dans cette étude. Plus récemment, Conduit et al. (Conduit et al., 2017) ont identifié une localisation ciliaire du PtdIns(3,4,5)P3 à sa base, augmentée en absence d’INPP5E. Bien que les auteurs montrent seulement les images correspondant à l’utilisation d’anticorps anti-PtdIns(3,4,5)P3 qui restent critiquables et ne montrent pas leur résultats utilisant un biosenseur de ce 3-phosphoinositide (sonde GFP-PH-Btk), cette étude reste la seule actuellement qui identifie ce puissant second messager phospholipidique au niveau de cet organelle.
D’autres études ont récemment démontré un rôle d’INPP5E dans la régulation de la signalisation ciliaire via son activité PtdIns(4,5)P2 5-phosphatase (Chávez et al., 2015)Garcia-Gonzalo et al., 2015). En effet, l’absence d’INPP5E au niveau du cil entrainerait une accumulation de PtdIns(4,5)P2, site de recrutement pour la protéine Tubby Tulp3, qui associée à son partenaire l’IFT-A formerait un complexe capable d’adresser au niveau du cil GPR161 (G Protein Coupled 161) un régulateur négatif de la voie Shh (Sonic Hedgehog) (Chávez et al., 2015; Garcia-Gonzalo et al., 2015). Ainsi, ces auteurs montrent que les cils des souris invalidées pour INPP5E présentent un renflement au niveau de la partie distale du cil lié à l’accumulation de Tulp3 et de GPR161. De plus, le taux de l’ARNm Gli1 (facteur de transcription induit suite à l’activation de la voie Shh, cf. partie II.1.a) est diminué et associé à une accumulation ciliaire d’IFT139 et IFT140, deux membres du complexe IFT-A participant au transport rétrograde (cf. partie I.3.a).
Concernant son rôle au niveau de la régulation du cycle cellulaire, deux travaux principaux ont permis de montrer qu’INPP5E pourrait remplir cette fonction via son activité 5-phosphatase par deux mécanismes principaux (Plotnikova et al., 2015; Phua et al., 2017). Le premier mécanisme implique sa liaison à la protéine AURKA (Aurora A Kinase), une kinase du centrosome qui régule à la fois la mitose et le désassemblage du cil. AURKA pourrait phosphoryler INPP5E, ce qui favoriserait son activité 5-phosphatase et permettrait d’activer la transcription du gène AURKA via des mécanismes de signalisation dépendant d’Akt (Plotnikova et al., 2015). Un deuxième mécanisme précise que sous l’action de facteur de croissance, INPP5E serait délocalisée de la partie distale du cil primaire et ce qui induirait un enrichissement de cette zone en PtdIns(4,5)P2. Ce remodelage lipidique de la région distale du cil engendrerait la polymérisation de l’actine et conduirait à l’excision du sommet du cil. Cette excision entrainerait l’activation d’un signal mitotique qui permettrait au cil de se désassembler et à la cellule d’entrer dans le cycle cellulaire (Phua et al., 2017). Ainsi, l’ensemble de ces travaux souligne le rôle central d’INPP5E dans cet organelle cellulaire. Il est important de noter que des mutations de cette 5-phosphatase dans son domaine d’activité catalytique ou entrainant la délétion de son domaine CAAX conduit aux ciliopathies telles que le syndrome de Joubert ou de MORM (Mental retardation, truncal obesity, retinal dystrophy and micropenis) respectivement (Bielas et al., 2009; Jacoby et al., 2009). Ceci illustre d’autant plus l’importance de garantir l’intégrité de la composition en phosphoinositide de la membrane ciliaire. En parallèle de l’action de ces trois 5-phosphatases, des kinases ont été également identifiées comme des acteurs puissants de la ciliogenèse en agissant soit directement à la base du cil soit indirectement en contrôlant le trafic de vésicule péricentriolaire du Golgi vers la base du cil. Présentant une action combinée à celle d’INPP5E, la PIPKIγ (phosphatidylinositol 4-phosphate Iγ ou PtdIns(4)P 5-kinase Iγ) est localisée au niveau du centrosome et coordonne l’initiation de la ciliogenèse (Xu et al., 2016). En absence d’un signal inducteur du cil primaire, INPP5E localisée au niveau du centriole mère enrichit cette région en PI(4)P qui bloque la liaison entre CEP164 (Centrosomal Protein 164) et TTBK2 (Tau-tubulin kinase 2), deux protéines essentielles à la levée d’inhibition de CP110 (Capping protein) sur la partie distale des microtubules ciliaires pour permettre leur assemblage. Suite à un signal inducteur de la ciliogenèse, PIPKIγ est recrutée au niveau du centriole mère, permet la diminution des taux de PI(4)P en produisant du PtdIns(4,5)P2, CEP164 peut alors interagir avec TTBK2 entrainant la levée d’inhibition de CP110 sur la partie distale des microtubules ciliaires, la translocation d’INPP5E au niveau de l’axonème naissant et la biogenèse du cil.
D’une manière indirecte la PI3KCIIα assure elle aussi l’assemblage du cil. En effet, comme nous le décrivons dans le chapitre III, partie III.1.1.b), cette kinase produit du PtdIns(3)P dans le but d’assurer un trafic péricentriolaire responsable de la localisation et de l’activation des Rab11 et 8 à la base du cil, deux GTPases essentielles à la biogenèse de cet organelle (Franco et al., 2014) (cf. chapitre III, partie I.3.b).
L’ensemble de ces résultats illustre que les phospholipides ciliaires métabolisés par ces différentes phosphatases et kinases jouent le rôle d’un « code barre » qui assure l’assemblage, la stabilité et le fonctionnement du cil. Ce code doit être minutieusement régulé pour garantir l’intégrité du cil primaire, nécessaire au développement embryonnaire ou l’intégrité tissulaire à l’âge adulte.

Fonction du cil primaire

La première et principale fonction du cil primaire est de détecter les stimuli extracellulaires à la surface des cellules. Il est un véritable centre de communication capable d’intégrer des signaux de diverses origines selon le type cellulaire: signaux environnementaux (lumière, odeur, son), biochimiques (morphogène, facteur de croissance ou hormone) et biomécaniques (force de tension, force de cisaillement, pression, force d’étirement) (Berbari et al., 2009). Il transmet ces informations en activant une variété de voies de signalisation coordonnées pour contrôler plusieurs processus cellulaire comme la migration, la différenciation, le cycle cellulaire, la polarité…etc, participant au développement embryonnaire ainsi qu’à l’homéostasie tissulaire à l’âge adulte.
Dans les cellules de mammifères, les voies de signalisation activées au niveau du cil primaire et majoritairement décrites sont dépendantes de signaux biochimiques et biomécaniques. Concernant les voies de signalisation dépendantes de signaux biochimiques, les voies des morphogènes Hedgehog (Hh) et Wnt, les voies activant des RTK comme PDGFRαα ou TGFβ seront plus particulièrement décrites dans cette partie. Concernant les signaux biomécaniques, nous détaillerons les voies impliquées en aval des forces de cisaillement engendrées par un flux, à savoir les voies calciques et les voies autophagiques.

Fonction du cil primaire dans la signalisation cellulaire

Voies de signalisation dépendantes de signaux biochimiques

La voie Hedgehog

La voie de signalisation dépendante d’Hh (Hedgehog) est impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire, la différenciation, la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et le maintien de l’homéostasie cellulaire à l’âge adulte (Simpson et al., 2009; Briscoe and Thérond, 2013). Il existe 3 ligands sécrétés de Hh : Shh (Sonic hedgehog), Ihh (Indian Hedgehog), and Dhh (Desert Hedgehog). Même si Shh semble le morphogène le plus largement exprimé, chacune de ses protéines présente des spécificités d’action tissulaires (Briscoe and Thérond, 2013). La signalisation Hh dépend d’une balance entre deux états des facteurs de transcription Gli (Glioma associated oncogene family) qui peuvent osciller entre des états activateurs ou répresseurs de la transcription dépendamment de la présence ou non de Hh et de sa liaison sur Ptch1 (Patched-1, récepteur de Hh à 12 segments transmembranaires).
En absence de ligand Hh, le récepteur Ptch1 dans un état inactif et localisé à la base du cil primaire et réprime l’activité du récepteur Smo (Smoothened) (récepteur à 7 domaines transmenbranaires) via un mécanisme à ce jour inconnu. Dans ce cas, la protéine SuFu (Supressor of Fused) est active, initie la dégradation partielle de Gli2/3 via la voie ubiquitine-protéasome, et la forme courte de Gli2/3-R fonctionne alors comme un répresseur de transcription des gènes cibles de la voie Hh.
Par contre, en présence du ligand Hh, Ptch1 activé induit une levée d’inhibition sur Smo qui est transloqué vers le cil primaire. Smo inhibe SuFu permettant la translocation de Gli2/3 du cil vers le cytoplasme. Gli2/3 jouent alors leur rôle de facteur de transcription et activent des gènes cibles comme la cycline et myc conduisant à la prolifération cellulaire ou le gène bcl-2 qui régule la mort cellulaire et encore le gène bmi-1 qui régule le renouvellement des cellules souches (Rohatgi et al., 2007; Wong and Reiter, 2008; Goetz et al., 2009) (Figure 21A).

La voie Wnt

Wnt appartient à une famille de glycoprotéines excrétées et agit de façon paracrine en activant 2 grands types de voies : la voie Wnt canonique dépendante de la β-caténine et la voie Wnt non-canonique indépendante de la β-caténine. Ces deux voies de signalisation Wnt médiée par la machinerie du cil primaire pourraient contrôler des processus cellulaires majeurs pour le développement embryonnaire: soit dépendant de la voie canonique et d’une activité transcriptionnelle comme la différenciation, la prolifération, la migration cellulaire, soit dépendant de la voie non-canonique et de processus associé à un réarrangement du cytosquelette comme le changement de morphologie cellulaire ou la polarité.
Concernant la voie canonique, en absence de Wnt le complexe de dégradation de la β-caténine Axin/APC (Polypose adénomateuse)/CK1 (Casein kinase 1)/GSK-3β (Glycogen Synthase Kinase-3 β) est localisé au niveau du corps basal du cil primaire où il est actif et contrôle la dégradation de la β-caténine suite à la phosphorylation de la β-caténine par CK1/GSK-3β. Lorsque Wnt lie son récepteur Frizzeld, DVL (Dishevelled) est activé et ancre à la membrane plasmique le complexe de dégradation de la β-caténine APC et GSK-3β empêchant ainsi la phosphorylation de la β-caténine et sa dégradation. Le niveau d’expression de la β-caténine augmente dans le cytoplasme puis elle migre dans le noyau où elle fonctionne comme un co-activateur transcriptionnel pour l’induction des gènes cible de Wnt (Cliffe et al., 2003; May-Simera and Kelley, 2012). A travers ces travaux, il apparaît que le corps basal du cil primaire est un site de régulation important pour le complexe APC (May-Simera and Kelley, 2012) (Figure 21B).
La voie de signalisation non-canonique dépend majoritairement de la protéine INVS (Inversine) qui a été proposée comme un interrupteur moléculaire entre les deux voies dépendantes de Wnt (Simons et al., 2005). En absence de Wnt, la protéine DVL est adressée au niveau du corps basal du cil primaire par INVS et est dégradée par le complexe APC/C-E3 ubiquitine ligase. En présence de Wnt et de sa liaison à Frizzled, c’est l’INVS qui est ubiquitinilée et dégradée par APC/C E3 ligase. La dégradation de l’INVS stabilise DVL et maintient un haut niveau d’expression de DVL dans le cytoplasme, entrainant deux types de signalisation non-canonique: la voie JNK/PCP (C-Jun N-terminal Kinase/Polarité Planaire) ou une voie calcium (Ca2+), préférentiellement observée dans un contexte où le cil primaire capte des signaux biomécaniques. La première voie JNK associée à ROCK (Rho-Kinase) permet l’activation de RhoA ou Rac et le réarrangement du cytosquelette d’actine, mécanisme majeur pour la régulation de la polarité cellulaire (Schlessinger et al., 2009). Tandis que la deuxième voie dépendante du Ca2+ active la PLC (Phospholipase C) qui génère de l’IP3 (Inositol trisphosphate) et du DAG (Diacylglycérol) entrainant une cascade de signalisation dépendante de CAMKII (Calmodulin-dependent kinase II), calcineurine et PKC (Protein kinase C) aboutissant à une régulation transcriptionnelle de gènes cibles spécifiques du tissus, par exemple rénal, où peut être activée cette voie (Balakumar and Jagadeesh, 2011) (Figure 21C).
Concernant cette voie de signalisation Wnt dépendante, plusieurs travaux restent contradictoires quant à sa connection systématique avec le compartiment ciliaire. En effet, certains travaux indiquent qu’en absence de cil aucun défaut de la voie Wnt n’est observée (Ocbina et al., 2009). Par contre, d’autres résultats confirment que le cil primaire est nécessaire au contrôle de cette voie (Lancaster et al., 2009, 2011).

Table des matières

Chapitre I : La cellule endothéliale: composante essentielle de la paroi vasculaire
I. La paroi artérielle saine
I.1 Structure de l’arbre vasculaire
I.2 Structure des artères saines
II. Fonctions de la cellule endothéliale saine
II.1. L’endothélium : une barrière semi-perméable
II.2. L’endothélium source des facteurs vasoactifs
II.3. Réponses aux facteurs hémodynamiques
II.3.1. L’endothélium : senseur mécanique du vaisseau
II.3.2. Modélisation des forces de cisaillement in vitro et in vivo
III. La cellule endothéliale en condition physiopathologique : exemple de l’athérosclérose.
III.1. Physiopathologie de l’athérosclérose
III.2. Rôle des cellules endothéliales au cours de l’athérosclérose
III.2.1. Mécanismes participants à la dysfonction endothéliale
III.2.2. Effet de l’autophagie sur les cellules endothéliales
III.2.2. a) Généralités sur l’autophagie
III.2.2. b) Rôle de l’autophagie sur le contrôle de la fonction endothéliale : conséquences pour l’évolution de l’athérosclérose
III. 3. Complications de l’athérosclérose
IV. Traitement de la plaque d’athérome symptomatique
IV.1. L’angioplastie avec pose de stent
IV.2. Complications des traitements de l’athérosclérose : rôle central de l’endothélium
IV.2.1. Les thromboses tardives
IV.2.2 La néoathérosclérose
Chapitre II : Le cil primaire : un centre de contrôle à la surface cellulaire
I. Cil primaire : qui es-tu ?
I.1 Ultrastructure
I.2. La ciliogenèse
I.3. Mécanismes moléculaires impliqués dans l’assemblage du cil
I.3.1. Le transport intraflagellaire : rôle des protéines IFT et des protéines motrices kinésines/dynéines
I.3.2. Contrôle du trafic ciliaire : rôle des Rab-GTPases
I.4. La membrane du cil primaire : importance de sa composition lipidique en phosphoinositides
II. Fonction du cil primaire
II.1. Fonction du cil primaire dans la signalisation cellulaire
II.1.1 Voies de signalisation dépendantes de signaux biochimiques
II.1.1. a) La voie Hedgehog
II.1.1.b) La voie Wnt
II.1.1.c) La voie PDGFαα
II.1.1.d) La voie TGF- β
II.1.2 Voies de signalisation dépendantes de signaux biomécaniques
II.1.2.a) voie de signalisation calcique dépendante des forces de cisaillements
II.2.2. b) Communication à double sens entre le cil primaire et les voies autophagiques : rôle des forces de cisaillements
II.2. Fonction du cil primaire dans le système cardiovasculaire
II.2.1. Ciliopathies et symptômes cardiovasculaires associées
II.2.2. Rôle du cil primaire au cours du développement dans le système cardiovasculaire
II.2.3. Le cil primaire des cellules endothéliales
II.2.3. a) Régulateur de l’homéostasie de la cellule endothéliale
II.2.3. b) Garant du développement des pathologies vasculaires
Chapitre III : La phosphoinositide 3-kinase IIα : une isoforme oubliée aux grandes fonctions
I. Le métabolisme des phosphoinositides
II. La famille des PI3K : structure, mécanismes d’activation et produits lipidiques
II.1- Structure des PI3K
II.2- Mécanismes d’activation et produits lipidiques
III. Fonctions cellulaires et physiopathologiques des PI3K de la classe II
III. 1- La PI3KCIIα
III.1.1 Fonctions cellulaires de la PI3KCIIα
III.1.1 a) Généralités sur le trafic intracellulaire
III.1.1 b) Rôle de la PI3KCIIα dans le trafic endocytaire
III.1.1 c) Rôle de la PI3KCIIα dans le trafic exocytaire
III.1.1 d) Nouveau rôle de la PI3KCIIα dans l’autophagie
III.1.2-Fonctions physiopathologiques de la PI3KCIIα
III.1.2 a) Rôle de la PI3KCIIα dans le diabète
III.1.2 b) Rôle de la PI3KCIIα dans la thrombose
III.1.2 c) Rôle de la PI3KCIIα dans le cancer
III.1.2 d) Rôle de la PI3KCIIα dans les pathologies vasculaires
III. 2- La PI3KCIIβ
III.2.1 Fonctions cellulaires de la PI3KCIIβ
III.2.2 Fonctions physiopathologiques de la PI3KCIIβ
III. 3- La PI3KCIIγ
IV. Inhibiteurs phamacologiques des PI3K de classe II
Partie II : Résultats expérimentaux
Article 1 : Phosphoinositide 3-kinase CIIα delays atherosclerosis initiation: a role for endothelial primary cilium
Partie III : Discussion / Perspectives Et Conclusion
Discussion et perspectives
Conclusion
BIBLIOGRAPHIE

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