Rôle de la voie de signalisation de Notch3 dans le myocarde adulte

Pour assurer ses fonctions et sa survie, chaque cellule de l’organisme a besoin d’un apport continu en oxygène et en nutriments. Cet apport est assuré par le système cardiovasculaire constitué d’une double pompe, le cœur (droit et gauche) ; d’un fluide, le sang; ainsi que d’un réseau de conduction fermé, les vaisseaux sanguins. Le système cardiovasculaire permet également l’élimination des métabolites vers les poumons et les reins (dioxyde carbone, urée, créatinine), la transmission des réponses hormonales, la régulation de la température corporelle et la défense immunitaire via le transport des anticorps et des cellules immunitaires (lymphocytes, monocytes…) à travers les vaisseaux.

Le système vasculaire se compose de deux circuits de transport distincts en série : la circulation pulmonaire et la circulation systémique, auquelle s’ajoute la circulation lymphatique. La circulation pulmonaire, assurée par le cœur droit, permet l’oxygénation du sang au niveau des alvéoles pulmonaires, alors que la circulation systémique, assurée par le cœur gauche, distribue les nutriments et l’oxygène aux différents organes, au premier rang desquels figurent le cœur lui-même mais aussi le cerveau, le foie et les reins. Au cours de la vie, le système cardiovasculaire peut subir des changements hémodynamiques, que ce soit pour des causes physiologiques (entraînement physique ou grossesse chez la femme) ou pathologique dans le cas d’une hypertension artérielle (HTA). Lorsque ces modifications hémodynamiques deviennent chroniques, le système cardiovasculaire, y compris le myocarde, subit un remodelage afin de s’adapter et d’assurer le maintien de sa fonction c’est à dire une perfusion adéquate des tissus sur les différents organes. Bien que ce remodelage soit bénéfique à l’origine, il peut conduire à une insuffisance cardiaque à long terme. Les mécanismes impliqués dans le remodelage cardiovasculaire ont été beaucoup étudiés ces dernières années, mais certains points, notamment au niveau des cellules musculaires lisses, restent encore à être éclaircis.

Le réseau vasculaire 

La circulation pulmonaire

La circulation pulmonaire est un système à basse pression (14 mm Hg en moyenne), à faible résistance, mais à haut débit. En effet, le poumon est le seul organe à recevoir l’intégralité du débit cardiaque. Ces caractéristiques sont liées à 2 propriétés particulières à cette circulation : 1- une grande capacité à recruter des vaisseaux pour faire face à une augmentation de flux sanguin 2- une compliance des artérioles pré-capillaires liée à une paroi composée d’un endothélium recouvrant une seule couche de CMLV, alors que la paroi des vaisseaux systémiques est plus épaisse et très riche en cellules musculaires donc moins compliante. La circulation pulmonaire se distingue également par sa réponse au stress hypoxique. En effet, la diminution de l’oxygène au niveau alvéolaire entraine une vasoconstriction des vaisseaux adjacents permettant une redistribution du flux sanguin, alors que l’hypoxie est responsable d’une vasodilatation dans les autres organes.

La circulation systémique

La circulation systémique prend naissance au niveau du ventricule gauche pour aboutir à l’oreillette droite. Elle fournit à l’ensemble des tissus de l’organisme les éléments nécessaires à leur bon fonctionnement et assure l’élimination des déchets métaboliques. Contrairement à la circulation pulmonaire, la circulation systémique est un système à haute pression (100mm Hg en moyenne) qui perfuse les autres organes de l’organisme à des débits différents. Ce maintien de la pression au niveau du réseau artériel se fait grâce aux résistances opposées par tous les vaisseaux périphériques et notamment au niveau des artérioles, principaux vaisseaux résistifs. Dans la circulation systémique, comme la circulation pulmonaire, le contrôle du tonus myogénique vasculaire est indispensable dans les phénomènes d’adaptation aux modifications de débit ou de pression. Le tonus vasculaire et son contrôle sont directement liés à la structure des vaisseaux sanguins.

Structure du système vasculaire

La paroi des vaisseaux

La paroi des artères et des veines, à l’exception des plus petites, est composée de trois tuniques distinctes qui entourent un espace central rempli de sang, la lumière : l’intima, la média et l’adventice (de l’intérieur vers l’extérieur du vaisseau) .

L’intima

Au contact direct avec le sang, la tunique interne, ou intima, du vaisseau sanguin est constituée d’un endothélium reposant sur une couche sous-endothéliale et est délimitée de la média par la limitante élastique interne. L’endothélium est constitué d’une monocouche de cellules endothéliales pavimenteuses (0,1-1 µm d’épaisseur). Leur orientation en parallèle du vaisseau est la conséquence des forces de cisaillement appliquées à leur surface par le flux sanguin (Levesque and Nerem 1985). La surface de ces cellules est recouverte de glycocalyx, une couche de glyocaminoglycanes chargées négativement, qui joue un rôle dans l’inhibition de la thrombose sur la surface endothéliale et dans la régulation des grosses molécules dont les lipoprotéines et les protéines plasmatiques. Les cellules endothéliales sont jointives via des jonctions de types serrées ou desmosomes (Movat and Fernando 1963) (Schwartz and Benditt 1972). L’endothélium dans les vaisseaux cérébraux présentent ainsi des cellules endothéliales hautement jointives limitant les échanges dans la barrière hématoencéphalique, alors que certains capillaires (capillaires sinusoïdes) sont constitués de cellules endothéliales disposées de manière discontinue et fenêtrée. Outre sa fonction de barrière physique entre le sang et les tissus, l’endothélium module le tonus et la vasomotricité des CMLV sous-jacentes via la sécrétion de médiateurs vasoconstricteurs tels que l’endothéline (Yanagisawa et al. 1988), l’enzyme de conversion de l’angiotensine qui produit l’angiotensine II (Carmines et al. 1986) ou le thromboxane A2 (Taddei and Vanhoutte 1993) ; mais aussi des molécules vasorelaxantes comme la prostacycline (Shimokawa et al. 1988), le facteur hyperpolarisant ou le monoxyde d’azote (NO) (Ignarro 1989). L’endothélium repose sur la lame basale constituée de collagène (principalement de type IV) et de glycoprotéines qui servent de support lors de la régénération de l’endothélium. L’intima est enfin délimitée par une limitante élastique interne composée de fibres élastiques transversales.

La média 

La tunique moyenne, ou média, comprend principalement des cellules musculaires lisses organisées de manière concentrique autour de l’axe luminal du vaisseau, ainsi que de feuillets d’élastine continus (aorte) ou non (artère de résistance) formant des unités lamellaires. Chaque unité lamellaire est constituée de CMLV entourées d’une matrice extracellulaire (MEC) composée de microfibrilles de collagène, d’élastine et de glycosaminoglycanes (Wolinsky and Glagov 1967). Leur nombre augmente suivant le diamètre du vaisseau sanguin. L’activité contractile du muscle lisse vasculaire est contrôlée par le système nerveux sympathique et par les médiateurs vasoactifs. La média a un rôle clé dans la régulation de la circulation. En effet, de mineures variations du diamètre des vaisseaux ont des effets marqués sur la pression et le débit sanguins.

Les cellules musculaires lisses. Les CMLV sont les seules cellules de la média. De forme généralement fusiforme, ces cellules sont mononucléées et mesurent de 2 à 5 μm de diamètre pour une longueur allant jusqu’à 500 µm. Les CMLV sont continuellement soumises à des signaux mécaniques ou biochimiques du fait de la pulsatilité de la circulation sanguine. Elles transforment cette stimulation mécanique en signaux intracellulaires via des processus de mécanotransduction impliquant des protéines intégrines, des récepteurs à activité tyrosine kinase et/ou des canaux ioniques (Haga et al. 2007). Ces multiples voies de signalisation lui permettent de répondre en se contractant ou se relaxant. Les CMLV synthétisent et sécrètent également les constituants de la matrice extracellulaire environnante et participent à la réparation vasculaire en cas de lésions.

Les CMLV ont la capacité de modifier leur phénotype pour répondre aux modifications environnementales. Elles peuvent évoluer d’un phénotype différencié dit « contractile » vers un d’un phénotype dédifférencié dit « sécrétoire ». Chacun de ces phénotypes se caractérise par un profil protéique spécifique (voir Table 2). Le phénotype sécrétoire, qui est aussi dit immature, est observé dans les vaisseaux de l’embryon, mais aussi dans certaines pathologies vasculaires telles que l’athérosclérose et l’HTA. Ces cellules ont la capacité de proliférer, de migrer et de sécréter une quantité plus importante de MEC. Le phénotype contractile, observé dans les vaisseaux sains de l’adulte, se caractérise par la présence de protéines contractiles et une faible capacité de croissance.

Le processus de mécanotransduction, via les intégrines, modifie le phénotype des CMLV et leurs fonctions en modulant ainsi la différenciation, la prolifération, la survie, la migration et l’organisation de la MEC (Shyy and Chien 2002). En réponse à un stress mécanique, l’expression rapide et transitoire de molécules régulatrices est induite telle que des facteurs de transcription (c-Fos, Sp1, Egr1), des molécules de signalisation (JNK, P38, ERK), des facteurs de croissance (FGF-2, PDGF) et des protéines contractiles (Caldesmone, SMMHC) (Chapman et al. 2000 ; Cheng et al. 2007 ; Albinson et Hellstrand 2007 ; Qu et al. 2007). D’autres facteurs influencent également la différenciation des CMLV tels que l’interaction avec les cellules endothéliales, l’endocytose de molécules ou des facteurs de croissance. Ainsi, les voies Notch et Wnt, si elles sont activées, peuvent contrôler le phénotype des CMLV en modulant l’expression génique des protéines contractiles. Les facteurs, comme Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) et Transforming growth factor-β (TGF β), conduisent également à une transition phénotypique des CMLV (Tang et al. 2011). Alors que le PDGF-BB réprime l’expression des gènes contractiles des CMLV, le TGF-β exerce le rôle inverse. Par ailleurs, in vitro il est montré des interactions entre ces voies de signalisation. La voie Notch interagit avec les voies du PDGF-BB (Jin et al. 2008) et du TGF-β (Tsaousi et al. 2011) (Kurpinski et al. 2010) pour moduler la migration et la différenciation des CMLV via l’activation de kinases telles que : Extracellular signalRegulated Kinase (ERK), c-Jun-N-terminal Kinase (JNK), p38 Mitogen-Activated Protein Kinase, RAC-alpha Serine/Threonin-protein (AKT), Rho/Rho-kinase, and calcineurin/calmodulin kinase.

L’adventice 

La tunique externe, aussi appelée externa ou adventice, est riche en fibroblastes. Elle est principalement composée de fibres collagènes lâchement entrelacées qui protègent et renforcent les vaisseaux afin de permettre l’ancrage aux structures environnantes. L’adventice est parcourue de neurofibres et de vaisseaux lymphatiques, ainsi que de fibres élastiques dans les grandes veines. Dans les gros vaisseaux, elle est parcourue par de minuscules vaisseaux sanguins, nommés vaso vasorom (« vaisseaux des vaisseaux »), qui nourrissent les parties externes de la media, alors que la partie interne est nourrie directement par le sang qui s’écoule dans la lumière.

Les différents types d’artères 

Les artères de conductance

Les artères de conductance constituent les gros troncs du système circulatoire. Elles assurent l’amortissement de la pulsatilité du flux à l’éjection du cœur et une fonction de conduction du sang vers les organes cible. La média est constituée de lames élastiques qui leur confèrent une compliance. Les artères de conductance transforment cette pression pulsatile au niveau de l’aorte en une pression continue au niveau artériolaire, ce qui permet la réduction des dépenses énergétiques de la perfusion des organes cibles.

Table des matières

I. Introduction
1. Le réseau vasculaire
1.1. La circulation pulmonaire
1.2. La circulation systémique
1.3. Structure du système vasculaire
1.3.1. La paroi des vaisseaux
1.3.2. L’intima
1.3.3. La média
1.3.4. L’adventice
1.4. Les différents types d’artères
1.4.1. Les artères de conductance
1.4.2. Les artères de résistances
1.4.3. Le cas de la circulation coronaire
1.5. La microcirculation
1.5.1. La densité capillaire
1.5.2. L’angiogenèse
1.5.2.1. La voie du VEGF
1.5.2.2. Les autres voies de l’angiogenèse
1.6. Le remodelage vasculaire
1.6.1. Définition
1.6.2. Les différents types de remodelage
1.6.2.1. Remodelage externe hypertrophique
1.6.2.2. Remodelage interne hypertrophique ou eutrophique
1.6.2.3. Remodelage vasculaire et HTA
2. Le remodelage cardiaque
2.1. Hypertrophie cardiaque, un phénomène compensatoire
2.2. L’hypertrophie physiologique
2.2.1. Principaux mécanismes moléculaire de l’hypertrophie physiologique du cardiomyocyte
2.2.2. Autres déterminants l’hypertrophie physiologique
2.3. L’hypertrophie pathologique
2.3.1. Hypertrophie concentrique versus hypertrophie excentrique
2.3.2. Les intervenants de l’hypertrophie cardiaque pathologique
2.3.2.1. Principaux mécanismes moléculaires de l’hypertrophie pathologiques du cardiomyocyte
2.3.2.2. La fibrose
2.3.2.3. L’inflammation et le stress oxydant
3. La voie de signalisation Notch
3.1. Généralités
3.1.1. Les ligands
3.1.2. Les effecteurs
3.1.3. Les récepteurs
3.1.4. La cascade de signalisation de Notch
3.2. Rôle de la voie Notch dans le système cardiovasculaire
3.2.1. Notch et le développement cardiovasculaire
3.2.2. Notch et le cœur au stade post-natal
3.2.3. Notch et le système vasculaire
3.3. Notch3, rôles physiologiques et pathologiques
3.3.1. Rôle de Notch3 dans la physiologie des CMLV
3.3.1.1. Notch3 et le phénotype des CMLV
3.3.1.2. Notch3 et la prolifération, migration et survie des CMLV
3.3.2. Implication de Notch3 en pathologie humaine
3.3.2.1. Notch3 et CADASIL
3.3.2.2. Notch3 et hypertension artérielle pulmonaire
4. Objectifs
II. Matériels&Méthodes
1. Modèles animaux
1.1. Souris Notch3 KO (Notch3-/-)
1.2. Oligonucléotides antisens Notch3
1.3. Souris avec invalidation inductible de RBPJκ dans les CML
1.4. Souris reportrices de l’activité recombinase de la CRE dans les CMLV
2. Modèles d’hypertrophie cardiaque
2.1. Hypertension artérielle par infusion d’Angiotensine II
2.2. Surcharge de débit induite par un entraînement physique
2.3. Surcharge de débit induite par la gestation
3. Evaluations fonctionnelles
3.1. Mesure de la pression artérielle
3.2. Echocardiographie
4. Mise à mort des souris et prélèvement des organes
5. Analyses quantitatives et qualitatives
5.1. Extraction des ARN totaux et réverse transcription
5.2. RT-PCR quantitatives
6. Histologie
6.1. Marquages fluorescents
6.2. Estimation de la fibrose par coloration au rouge Sirius
6.3. Localisation de l’activité de la CRE par marquage à la ß-Galactosidase et coloration hématoxyline-éosine
7. Quantification protéique par western blot
7.1. Extractions protéiques
7.2. Western Blot
8. Analyses statistiques
III. Conclusion

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