Rôle de la protéine DprA dans la transformation par de l’ADN génomique et de l’ADN plasmidique chez D. radiodurans

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Des records de résistance

D. radiodurans est capable de tolérer l’exposition à des doses élevées de divers agents génotoxiques et se situe très souvent parmi les organismes les plus résistants (Figure 4).
Sa propriété la plus connue est celle de résister à des doses extrêmes de rayonnement ionisant. Elle peut résister sans aucune perte de viabilité à des doses allant jusqu’à 6 kGy de rayonnement γ alors que quelques centaines de Gy sont suffisants pour tuer la bactérie Escherichia coli. Une dose de 6 kGy génère des centaines de cassures de l’ADN et la radiorésistance de D. radiodurans ne s’explique pas par une protection particulière contre les cassures puisqu’à dose égale, on observe le même nombre de cassures de l’ADN que chez E. coli (Gerard et al., 2001). Elle est capable de réparer son génome en seulement deux à trois heures après une exposition à 6 kGy. Dans un milieu riche de culture, elle supporte également une exposition prolongée à une dose de 60 Gy/h sans aucun effet sur son taux de croissance (Lange et al, 1998).
Cette bactérie est capable de supporter des doses de rayonnement UV-C allant jusqu’à 500 J/m² sans perte de viabilité alors qu’on estime que cette dose induit la formation de 5000 dimères de pyrimidines par équivalent génome (Sweet & Moseley, 1976 , Battista, 1997). Quatre vingt dix minutes après une telle exposition, plus de 80% des dimères de thymines engendrés par les UV-C sont retrouvés dans le milieu de culture inclus dans des di- ou tri- nucléotides (Boling & Setlow, 1966).
Elle résiste également à une exposition de 10 minutes à une dose de 20 µg/mL de MMC générant 100 à 200 pontages de l’ADN sans perte de viabilité (Kitayama, 1982) et présente 90% de viabilité après exposition pendant 60 minutes à 10 mM d’H202.
La bactérie D. radiodurans est également capable de survivre avec une viabilité supérieure à 85% après plus de 6 semaines de dessication avec un taux d’humidité de moins de 5% (Mattimore & Battista, 1996). Les cycles de réhydratation/dessication génèrent des cassures de l’ADN. Etant donné qu’au cours de l’évolution, elle n’a jamais été exposée à des doses de radiations de plusieurs kGy, il est proposé que le développement d’une résistance à des cycles de dessication/réhydratation soit à l’origine de cette extrême radiorésistance. En effet, il a été montré que les réponses en terme d’expression des gènes sont proches après irradiation et dessiccation, avec la mise en évidence de 72 gènes induits dans une réponse commune à chacun de ces traitements, suggérant que certains facteurs impliqués dans la radiorésistance auraient pu être acquis lors d’exposition à des cycles répétés de dessiccation-réhydratation (Mattimore & Battista, 1996, Tanaka et al., 2004).

Un véritable kit de survie

Au vu de ses capacités à résister à des doses extrêmes d’agents génotoxiques sans aucune perte de viabilité, D. radiodurans possède un véritable kit de survie que les chercheurs ne cessent d’explorer. C’est une adaptation globale de l’organisme et la présence de plusieurs mécanismes agissant de concert qui constituent ce kit de survie.

Un nucléoïde compact

Des observations en microscopie à transmission électronique (Levin-Zaidman et al., 2003) ou confocale à épifluorescence (Zimmerman & Battista, 2005) montrent que le nucléoïde de D. radiodurans a une structure en anneau très compacte. Cette forte compaction semble être une caractéristique assez commune aux Deinococcaceae radiorésistants, elle est en effet retrouvée chez D. proteolyticus (Zimmerman & Battista, 2005), D. geothermalis (Zimmerman & Battista, 2005) et D. deserti (de Groot et al., 2005 , Toueille et al., 2012). On retrouve également cette caractéristique chez des bactéries radiorésistantes comme Rubrobacter radiotolerans phylogénétiquement éloignée de D. radiodurans (Zimmerman & Battista, 2005) alors que chez une bactérie sensible comme E. coli, l’ADN est plus diffus dans la cellule (Figure 5). Par contre, la forme en anneau n’est pas conservée chez les bactéries radiorésistantes.
Figure 5 : Structure du nucléoïde de Rubrobacter radiotolerans, D. radiodurans et E. coli. D’après (Zimmerman & Battista, 2005).
L’ADN est coloré au DAPI (coloration bleue) et les membranes au FM-4-64 (coloration rouge). Cette structure compacte est maintenue après exposition à une dose de 5 kGy de rayonnement γ (Zimmerman & Battista, 2005) ainsi que chez un mutant recA30 incapable de réparer son génome après irradiation. Il a été proposé que cette organisation du nucléoïde permette d’éviter une dispersion des fragments d’ADN et de faciliter ainsi la réparation des cassures double brin de l’ADN (Zimmerman & Battista, 2005).
Il a été montré que la protéine HU joue un rôle majeur dans la structuration du nucléoïde et est avec l’ADN gyrase, la protéine la plus abondante au niveau du nucléoïde (Toueille et al., 2012). La protéine HU est essentielle à la survie de la cellule et il est impossible de construire une souche mutante Δhns homozygote (Nguyen et al., 2009). Toutes les copies chromosomiques du gène hns peuvent par contre être délétées si le gène hns est exprimé en trans à partir d’un vecteur d’expression thermosensible pour sa réplication. A température permissive, les cellules sont viables. Par contre, la déplétion de la protéine HU à température non permissive entraîne dans un premier temps une décompaction du nucléoïde suivie d’une fragmentation du nucleoïde puis de la lyse des cellules (Nguyen et al., 2009). L’intégrité du nucléoïde joue un rôle majeur dans la viabilité cellulaire en absence ou en présence de stress.

Une protection des protéines contre l’oxydation

De nombreux agents génotoxiques n’agissent pas directement sur l’ADN, leur effet génotoxique provient du fait qu’ils augmentent la quantité de ROS intracelluaires et donc les dommages à l’ADN et cellulaires associés. Plusieurs mécanismes de protection contre ces ROS et le stress oxydatif sont présents chez les bactéries. Plusieurs niveaux de défense existent incluant des systèmes enzymatiques (impliquant une catalase, ou une superoxide dismutase), non enzymatiques (caroténoïdes, taux de manganèse) ou de nettoyage de la cellule (protéases).
Des systèmes enzymatiques permettent de convertir directement les ROS en molécules neutres ou moins réactives. Les superoxyde dismutases (SOD) catalysent la dismutation du superoxyde en dioxygène et peroxyde d’hydrogène et les catalases convertissent le peroxyde d’hydrogène en eau et dioxygène (Figure 6). D. radiodurans possède 4 SOD (Mn–dépendante DR1279, et Cu/Zn-dépendantes DR1546, DRA0202 et DR0644) et 3 catalases (DR1998, DRA0259, DRA0146). Elles sont toutes induites après irradiation (Tanaka et al., 2004) sauf DR1279 (Mn-SOD) exprimée de manière constitutive (Lipton et al., 2002). Leur absence rend les souches sensibles à H2O2 (Markillie et al., 1999). La catalase DR1998 et la MN-SOD DR1279 sont très proches des homologues retrouvés chez E. coli (Dennis et al., 2006, Markillie et al., 1999), cependant, chez D. radiodurans, l’activité catalase est plus élevée que chez E. coli (Wang & Schellhorn, 1995, Tian et al., 2004).
Figure 6 : Systèmes enzymatiques de traitement des espèces réactives de l’oxygène : réactions catalysées par les superoxide dismutases et les catalases D. radiodurans a une pigmentation rose due à la production de divers caroténoïdes. Le plus produit, la deinoxanthine, à un pouvoir antioxydant supérieur à celui des β-carotènes (Tian et al., 2007, Ji, 2010) et est capable de piéger H2O2 et l’oxygène singulet 1O2, forme excitée de la molécule d’O2. Un mutant ΔcrtB ou ΔcrtI, affecté dans des gènes impliqués dans la voie de production des β-carotènes, est plus sensible aux rayons γ, à la dessiccation et à H2O2 (Xu et al., 2007). Cependant, des mutants non pigmentés ont déjà été retrouvés après exposition des cellules aux rayons γ et ils présentaient la même résistance aux radiations qu’une souche sauvage probablement parce que les autres mécanismes de protection contre le stress oxydatif compensent l’absence de pigments antioxydants.
Des travaux de Daly en 2004, 2006 et 2007 ont mis en évidence l’importance du manganèse Mn(II) pour la survie de D. radiodurans après irradiation. Le Mn(II) est capable de se complexer aux ROS et ainsi de les piéger (Figure 7A) (Xu et al., 2007). Chez D. radiodurans, le ratio [Mn2+] / [Fe2+] est très élevé (Daly et al., 2004). On retrouve ce ratio élevé chez d’autres bactéries radio-résistantes (D. geothermalis) alors qu’il est beaucoup plus faible chez les bactéries radio-sensibles (E. coli, Neisseiria gonorrhoeae) (Daly, 2006, Krisko & Radman, 2010). On retrouve de façon corrélée, une plus faible oxydation des protéines chez les espèces avec un ratio [Mn2+] / [Fe2+] élevé ainsi qu’une meilleure résistance à l’irradiation (Figure 7B) (Daly et al., 2007). Chez D. radiodurans, il a été montré que les ions Mn2+ étaient majoritairement retrouvés au niveau du nucléoïde tandis que les ions Fe2+ sont concentrés au niveau des septums de division (Daly et al., 2007). En plus de limiter la concentration des ions Fe2+, l’accumulation de ces ions dans un endroit bien précis de la cellule permet de limiter la production de ROS liée aux réactions de Fenton et d’éviter que ces ROS n’attaquent l’ADN ou les protéines dans l’ensemble de la cellule.
Figure 7 : Rôle du Manganèse dans les mécanismes de protection contre les espèces réactives de l’oxygène (ROS).
(A) Complexes entre les ions Mn2+ et les bases (bleu), l’orthophosphate (rouge) et les acides aminés (vert) et leur activité de piégeage des ROS. (B) Relation entre le ratio [Mn2+]/[Fe2+], la carbonylation des protéines et la capacité de survie au rayonnement gamma chez différentes espèces. (D’après (Slade & Radman, 2011))
Lorsqu’on filtre la phase aqueuse d’un homogénat de cellules de D. radiodurans de manière à éliminer les protéines et les plus gros peptides, on trouve dans le filtrat du manganèse, du phosphate, des acides aminés, des peptides et des bases. Le manganèse est principalement en complexe avec les autres molécules. Ce filtrat est capable d’améliorer la résistance de la bactérie E. coli et de cellules humaines à une exposition à des doses d’irradiation létales si le filtrat n’est pas ajouté. In vitro, lorsque l’enzyme BamHI dont l’activité est sensible aux ROS (Daly et al., 2007) est exposée à une dose de 4 kGy d’irradiation en présence de ce filtrat, son activité est préservée (Daly et al., 2010). Il est proposé que l’abondance de métabolites complexés au manganèse dans le cytosol permette de protéger les protéines du stress oxydatif provoqué par l’irradiation ou la dessication (Culotta & Daly, 2013).
Tous ces mécanismes agissant de concert dans l’élimination ou le piégeage des ROS permettent une protection efficace des protéines contre l’oxydation. De cette manière, elles restent fonctionnelles immédiatement après irradiation pour participer à la réparation de l’ADN, la réponse au stress, la synthèse protéique ce qui permet de faire face à des doses extrêmes d’agents génotoxiques sans perte de viabilité.
En plus de ces systèmes de protection des protéines, D. radiodurans code un grand nombre de protéases potentielles (Makarova et al., 2001) et plusieurs d’entre elles ainsi que des protéines chaperonnes sont induites après irradiation (Tanaka et al., 2004), permettant un nettoyage efficace des protéines oxydées. De même, un système d’export de l’ADN endommagé est mis en place, puisqu’on retrouve un grand nombre de fragments d’ADN portant des lésions dans le milieu extracellulaire après irradiation (Vukovic-Nagy et al., 1974).

Une réponse au stress et des protéines originales

Afin de mettre en place tous ces mécanismes de défense, il est important qu’une réponse coordonnée et efficace soit activée. Les études transcriptomiques (Liu et al., 2003, Tanaka et al., 2004) et les annotations du génome (White et al., 1999, Makarova et al., 2007) ont mis en évidence un grand nombre de protéines spécifiques des Deinococcaceae induites après irradiation et de fonction inconnue. Elles ont été principalement regroupées sous le nom de Ddr-protéines pour « DNA damage response proteins » et la fonction d’un certain nombre d’entre elles a été élucidée depuis 2004 (voir plus loin).
Chez E. coli, lorsque des dommages de l’ADN sont présents, le clivage RecA-dépendant de la protéine LexA permet d’induire l’expression d’un certain nombre de gènes faisant partie de la réponse SOS comme des gènes impliqués dans la réparation de l’ADN dont recA (pour revue (Kreuzer, 2013, Baharoglu & Mazel, 2014).
Chez D. radiodurans, le clivage de LexA1 ou LexA2, les deux homologues de LexA d’E. coli, est également dépendant de RecA. Cependant, l’induction du gène recA n’est pas contrôlée par LexA1 ni LexA2 après irradiation (Narumi et al., 2001, Bonacossa de Almeida et al., 2002, Satoh et al., 2006). En revanche, le gène recA fait partie du régulon RDR pour Radiation Dessication Response. Ce régulon regroupe plus d’une vingtaine de gènes avec les caractéristiques communes d’être induits après irradiation et d’avoir un motif régulateur RDRM (Radiation Desiccation Response Motif) dans leur région promotrice. Parmi ces gènes, on trouve des gènes codant pour des protéines de maintien de l’intégrité du génome connues comme RecA, GyrA, SSB, UvrA, … , de protection contre le stress oxydatif comme KatA et des gènes codant des protéines spécifiques des Deinococacceae, DdrA, DdrB, DdrC, DdrD, DdrO, PprA, … Le motif RDRM (Figure 8) est palindromique et constitué de 17 pb avec un taux de conservation variable selon les bases (Makarova et al., 2007). Cela suggère qu’un régulateur transcriptionnel puisse cibler cette séquence et être un régulateur global du régulon RDR.
Figure 8 : Motif RDRM chez D. radiodurans (Makarova et al., 2007)
Il a été montré que la protéine IrrE est requise pour l’expression de plusieurs gènes de ce régulon : recA, ssb, pprA (Earl et al., 2002a , Hua et al., 2003 , Lu et al., 2012, Lu et al., 2009) et qu’elle est nécessaire à la résistance à l’irradiation et à la dessiccation (Earl et al., 2002a, Hua et al., 2003). Cependant, IrrE n’est pas capable de se fixer sur de l’ADN contenant le motif RDRM (Vujicic-Zagar et al., 2009) et des études structurales et de mutagénèse dirigée ont montré qu’il s’agit d’une métalloprotéase Mn dépendante présentant une activité protéolytique qui serait nécessaire à la radiorésistance (Wang et al., 2015 , Vujicic-Zagar et al., 2009). Récemment, un modèle de régulation du régulon RDR faisant intervenir IrrE et DdrO, un régulateur transcriptionnel putatif induit après irradiation et faisant partie du régulon RDR, a été proposé (Ludanyi et al., 2014 , Devigne et al., 2015).
DdrO, exprimé à un taux basal dans la cellule, réprime le régulon RDR probablement en se fixant sur le motif RDRM (Wang et al., 2015). Après irradiation, la quantité de protéine DdrO décroit de manière dépendante de IrrE (Ludanyi et al., 2014 , Devigne et al., 2015). En effet IrrE est capable après irradiation de cliver DdrO et de le rendre inactif ce qui lève la répression et permet l’expression des gènes du régulon RDR (Ludanyi et al., 2014). La dépletion de DdrO entraîne une augmentation de l’expression des protéines PprA, GyrA et DdrB (Devigne et al., 2015) ce qui est cohérent avec un rôle de répresseur du régulon RDR. Le gène ddrO fait partie du régulon RDR ce qui entraîne une boucle de rétrocontrôle de sa propre expression. Lorsque le clivage de DdrO cesse, sa concentration cellulaire augmente à nouveau et le régulon RDR est de nouveau réprimé. En revanche, si l’activation du régulateur IrrE perdure et/ou si le niveau de DdrO n’est pas retrouvé rapidement, comme il a été montré lors de déplétions de DdrO (Devigne et al., 2015), la cellule s’engage dans une voie apoptotique. En effet, une déplétion de DdrO entraine l’apparition de cellules fantômes, la formation de « bulles » dans les membranes ainsi qu’une fragmentation de l’ADN, des phénotypes caractéristiques d’une cellule en apoptose chez les bactéries (pour revue, voir (Bayles, 2014)). Il est proposé que des gènes pro-apoptotiques soient activés tardivement en absence prolongée de DdrO. Parmi ces gènes, on pourrait trouver un gène codant une nucléase qui dégraderait l’ADN. La balance entre la quantité d’IrrE actif et de DdrO non clivée est une étape déterminante dans le retour à l’état avant irradiation. Les signaux d’activation et d’inactivation d’IrrE ne sont pas connus. IrrE est exprimé de manière constitutive (Gao et al., 2006) ce qui suggère que son activité protéase soit activée après irradiation afin de cliver DdrO et d’induire une réponse globale face à ce stress. Il est proposé que le taux de ROS dans le cytosol ou la présence de lésions de l’ADN soient des signaux permettant d’activer la protéase IrrE (Devigne et al., 2015). A l’inverse, une diminution des ROS intracellulaires et la réparation des dommages de l’ADN après irradiation pourraient permettre une inactivation de l’activité protéase d’IrrE et la répression du régulon RDR par DdrO. Il est à noter que la protéine DdrO est essentielle à la viabilité de D. radiodurans et de D. deserti (Devigne et al., 2015 , Ludanyi et al., 2014) et qu’il est impossible d’inactiver toutes les copies de ce gène.

Table des matières

Introduction
Deinococcus radiodurans, un des organismes les plus radiorésistants connus à ce jour
La bactérie Deinococcus radiodurans
1. Origine et phylogénie
2. Morphologie et division cellulaire
3. Génome et outils génétiques
Une résistance exceptionnelle aux agents génotoxiques
1. Lésions engendrées par le métabolisme cellulaire et les agents génotoxiques
2. Des records de résistance
3. Un véritable kit de survie
A. Un nucléoïde compact
B. Une protection des protéines contre l’oxydation
C. Une réponse au stress et des protéines originales
D. Des mécanismes efficaces de réparation de l’ADN
Maintien de l’intégrité du génome chez D. radiodurans
1. Réparation des cassures double brin de l’ADN chez D. radiodurans
A. Mécanismes RecA-dépendants
a) La recombinaison homologue
b) La réparation par synthèse massive d’ADN et appariement des brins d’ADN néosynthétisés : l’ESDSA (extended synthesis-dependent strand annealing)
B. Mécanismes RecA-indépendants de réparation des cassures double brin de l’ADN …
a) Le SSA (Single Strand Annealing)
b) Le NHEJ
2. Réparation des bases et des nucléotides endommagés
A. Réparation par excision des bases endommagées : « Base excision repair » (BER)
B. Réparation des nucléotides endommagés : « Nucleotide excision repair » (NER)
C. Correction des mésappariements : « Mismatch repair » (MMR)
3. Blocage de la fourche de réplication au niveau de lésions encombrantes et mécanismes de sauvetage de la fourche
Plasticité du génome chez D. radiodurans
1. Les éléments mobiles
2. L’intégration de matériel génétique exogène et la transformation
3. La recombinaison entre séquences répétées
Objectifs de cette thèse
Chapitre 1 Les mécanismes d’instabilité génétique entre séquences répétées directes chez D. radiodurans : rôle majeur de l’appariement simple brin dans la recombinaison RecA-indépendante entre séquences répétées
Introduction
1. La taille des séquences répétées et des régions espaceurs influence la recombinaison entre séquences répétées
2. Les mécanismes à l’origine d’instabilité génétique entre les séquences répétées
3. Stratégie d’étude de l’instabilité génétique entre séquences répétées chez D. radiodurans
Résultats
Résultats complémentaires
1. Tentavite de construction d’un mutant ΔruvC
2. Test génétique de l’essentialité du gène ruvC
Récapitulatif des résultats obtenus
Chapitre 2 Rôle de la protéine DprA dans la transformation par de l’ADN génomique et de l’ADN plasmidique chez D. radiodurans
Avant propos
INTRODUCTION
1. La transformation naturelle à travers les espèces bactériennes
2. La transformation, étape par étape
A. Internalisation de l’ADN extracellulaire
a) Les pseudopili dérivés des systèmes de formation des pili de type IV (T4P) et de sécrétion de type II (T2SS) et IV (T4SS).
b) Fixation, internalisation et translocation de l’ADN
B. Devenir de l’ADN internalisé
a) Protection de l’ADN transporté dans le milieu intracellulaire
b) Etablissement de l’ADN internalisé dans la cellule hôte Fixation, internalisation et translocation de l’ADN
3. Rôle de la protéine DprA dans la transformation
A. Découverte, distribution phylogénique, architecture structurale
B. Les rôles de DprA lors de la transformation
a) Fixation sur l’ADNsb entrant et protection contre la dégradation.
b) Levée de la barrière SSB et chargement de la recombinase RecA
c) Le rôle de DprA dans la régulation de la compétence
4. Deinococcus radiodurans, une bactérie naturellement compétente
Problématique
Résultats et discussion
1. Etude du rôle de la protéine DprA dans la transformation chez D. radiodurans.
A. Rôle de DprA dans la transformation par de l’ADN génomique
B. Rôle de DprA dans la transformation par de l’ADN plasmidique
2. Rôle des domaines N terminal et C terminal de la protéine DrDprA dans la transformation chez D. radiodurans.
A. Etude des domaines protéiques de DrDprA
B. Complémentation inter-espèces
3. Transformation et radiorésistance
Conclusion
Matériel et Méthodes
1. Tableau de souches et plasmides, culture des souches
2. Construction des souches et plasmides
A. Construction des simples et double mutants
B. Construction des souches pour l’expression de protéines DrDprA tronquées
C. Construction des souches et plasmides pour la complémentation inter-espèces
3. Préparation des cellules compétentes et tests de transformation chromosomique et plasmidique
4. Irradiation et courbe de survie
5. Western Blot
Conclusion générale
Références bibliographiques
Annexes

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