RISQUES CARDIOVASCULAIRES CHEZ LES RATS TRAITÉS À L’ÉRYTHROPOÏÉTINE RECOMBINANTE HUMAINE

L’érythropoïétine recombinante humaine 

   L’utilisation de l’EPO recombinante humaine (rHuEPO) en thérapie, a révolutionné le traitement de l’anémie associée à l’insuffisance rénale chronique (Moreno et coll., 2000). De plus, l’EPO est utilisée dans le traitement de l’anémie associée à d’autres pathologies : l’infection au VIH, les patients en chimiothérapie traitant le cancer, ou encore pour réduire la transfusion sanguine en chirurgie. Il existe de nos jours différentes formes de rHuEPO. Les époétines alpha et bêta, dites de 1ère génération (Eprex® : époétine alpha ; Neorecormon®, époétine bêta). Ces rHuEPO sont fabriquées à partir de cellules animales (ovaires de hamster chinois). Plus tard, une époétine delta (Dynepo®) sera commercialisée : c’est une rHuEPO issue des techniques recombinantes fabriquée à partir de cellules humaines tumorales (donc proche de l’EPO endogène). En 2001, apparaissent les rHuEPO de 2ème génération, les NESP (Novel Erythropoiesis Stimulating Protein) ou EPO retard. La NESP est considérée comme la rHuEPO la plus connue, et est connue aussi sous le nom de darbépoétine alpha (Aranesp®). Elle diffère de l’époétine par la substitution de cinq acides aminés permettant l’assemblage de cinq chaînes glycosylées au lieu de trois. Le CERA (Continuous erythropoietin receptor activator) est une molécule d’érythropoïétine à laquelle est insérée une longue chaîne protéique, doublant quasiment son poids. Sa demivie est très allongée, permettant une injection mensuelle. Il existe de nombreux autres types en cours de développement. Une classe particulière sont les peptides mimant l’érythropoïétine, dont la séquence d’acides aminés n’a rien à voir avec cette dernière, et qui agissent sur le récepteur de l’érythropoïétine. La première molécule de ce type, appelé hématide, est un oligopeptide modifié, produit par une bactérie. Son utilisation est en cours de test (Reichel et Gmeiner, 2010). L’administration de la rHuEPO se fait par deux voies : injection sous-cutanée et injection intraveineuse. Concernant les doses administrées, cela dépend du type de la rHuEPO, de l’âge et de l’état du patient et de la maladie concernée. Dans l’étude d’Eschbach et coll. (1989), des patients dialysés ont reçu différentes doses de 15 à 500 UI/kg de rHuEPO, trois fois par semaine. La réponse est plus rapide avec la plus haute dose (500 UI), mais une augmentation graduelle et adéquate de l’hématocrite est observée chez la plupart des patients prenant une dose de 50 UI/kg. Généralement, les praticiens sont d’accord sur une cible de 12 g/dl d’hémoglobine à atteindre.

La rHuEPO dans le domaine sportif (dopage)

   L’EPO artificielle a été largement détournée de son usage initial pour offrir aux sportifs une endurance à toute épreuve et des performances accrues. Avec l’étrange augmentation des résultats de certains athlètes, la suspicion est générale. Plusieurs décès suspects surviennent durant les années 1980-1990, surtout dans le monde du cyclisme (Eichner, 2007). Depuis, de nombreux exemples de dopage à l’EPO ont fait les gros titres. Nous pouvons citer l’affaire impliquant l’équipe Festina, lors du Tour de France 1998, qui a révélé un abus généralisé d’EPO dans le cyclisme et a conduit à un changement drastique dans l’approche du Comité Internationale Olympique (CIO) sur le dopage dans le sport. Ceci a finalement mené, à la création de l’Agence Mondiale Antidopage (AMA). Le retrait de six athlètes chinoises aux Jeux olympiques de Sydney 2000 a Revue générale de littérature coïncidé avec l’introduction du premier test sanguin de détection de l’EPO, alimentant les soupçons d’abus d’EPO comme étant la cause de leurs précédentes performances exceptionnelles. Les méthodes de détection du dopage à l’EPO comprennent la combinaison d’approches directes et indirectes (Delanghe et coll., 2008). La méthode directe, actuellement utilisée par les laboratoires antidopage accrédités par l’AMA, est basée sur des différences dans la structure et l’étendue de la glycosylation de la rHuEPO par rapport à la protéine endogène. Les différents arrangements des résidus de sucre présent dans les rHuEPO résultent des différences dans leurs points isoélectriques qui sont détectés par une méthode d’isoélectrophorèse (test IEF) (Jelkmann, 2007). Les méthodes indirectes incluent les changements des paramètres hématologiques de l’érythropoïèse, comme les taux d’hémoglobine, le pourcentage des réticulocytes et les concentrations sériques de l’EPO et de ces récepteurs de transfert solubles (Delanghe et coll., 2007). Une approche indirecte alternative est la mise en place de passeport hématologique de l’athlète. C’est l’établissement du profil hématologique en comparant les valeurs des paramètres sanguins mesurés et établir une référence historique de l’individu. L’Union Cycliste Internationale est devenue la première fédération sportive internationale à mettre en œuvre l’approche de passeport hématologique de l’athlète dans le cadre de ses programmes antidopages. L’application d’un profil longitudinale permettrait d’éliminer l’inter-variabilité observée dans la population, et pourrait aussi aider à éliminer les cas rapportés d’EPO indétectable qui ont été observés dans diverses situations. Ces cas pourraient avoir été causés par la manipulation de l’échantillon avec des protéases dégradant l’EPO.

Le risque cardiovasculaire de la rHuEPO 

   Les deux principaux effets secondaires d’une administration chronique de rHuEPO sont l’HTA et les risques de thromboses. Chez les sportifs, notamment les cyclistes, divers cas de mortalité suspecte sont apparus durant les années 1990. L’apparition ou l’aggravation d’une HTA est un effet secondaire constaté chez environ 30% des patients urémiques dialysés traités par rHuEPO (Eschbach et coll., 1989). Il a aussi été cliniquement observé que l’administration de darbepoetin alpha (rHuEPO) à des patients suivant une chimiothérapie, augmente les événements thrombotiques et les embolies pulmonaires. De plus, la darbepoetin augmente le risque d’infarctus du myocarde et d’attaque d’apoplexie, tout ceci associé à une élévation rapide et accentuée du taux d’hémoglobine dans le sang et de la viscosité sanguine (Abramowicz, 2001). Des études cliniques ont démontré que l’administration de rHuEPO chez des sujets sains volontaires augmente la production des protéines d’adhésion endothéliales (E-sélectine, ICAM-1, VCAM-1) (Stohlawetz et coll., 2000). Les conséquences de cette activation endothéliale par la rHuEPO ne sont pas connues, mais laissent entrevoir une activation de la thrombogénèse et de l’athérogénèse chez des sujets à risque. Il est reconnu que l’EPO active les plaquettes, stimule la production endothéliale de l’ET-1 et active la vasoconstriction des catécholamines et de l’angiotensine II (Smith et coll., 2003). L’EPO possède donc un effet hypertenseur par augmentation du tonus vasculaire via un effet vasoconstricteur direct sur la cellule musculaire lisse en augmentant le calcium libre intracellulaire (Schiffl et Lang, 1997). Ruschitzka et coll. (2000) ont produit récemment une lignée de souris transgéniques surexprimant l’EPO humaine avec une polyglobulie sévère. Malgré un hématocrite élevé (80%), ces souris ne développent pas d’HTA ou de foyers thromboemboliques. Par contre, lorsque ces souris sont traitées avec un inhibiteur de la NO-synthase (L-NAME), l’HTA se développe rapidement avec une élévation de la vasoconstriction des territoires artériolaires, se traduisant par une mortalité importante. L’ensemble des ces résultats suggèrent que l’élévation des forces de cisaillement induites par l’élévation de la viscosité chez ces souris stimule la production endothéliale de NO, celle-ci s’oppose à l’action vasoconstrictrice indirecte de l’EPO via divers facteurs (comme l’ET-1) et protège l’intégrité cardiovasculaire.

La dysfonction endothéliale dans l’IRC

Généralités : La dysfonction endothéliale est principalement caractérisée par une réduction de la biodisponibilité du NO, et survient souvent de façon précoce dans le développement de plusieurs pathologies cardiovasculaires (Raij et coll., 2006; Taddei et coll., 2003). Les vaisseaux sanguins de l’organisme sont tapissés d’une seule couche de cellules endothéliales, qui forment l’endothélium vasculaire. Ce dernier constitue une couche semi-perméable entre les éléments circulant du sang et la paroi des vaisseaux sanguins. Il sécrète aussi des substances vasoactives (vasoconstrictrices et vasodilatatrices) qui permettent de maintenir un tonus vasculaire approprié. En condition physiologique normale, il existe un équilibre entre ces facteurs vasoactifs pour maintenir le tonus vasculaire. Parmi les substances vasoconstrictrices relâchées par l’endothélium, nous retrouvons ET-1, Ang II, le TXA2 et les radicaux libres oxygénés (ROS). Les substances vasodilatatrices sont représentées par le NO, la prostacycline (PGI2), le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF) et la bradykinine (BK). Parmi les substances citées ci-dessus, le NO représente la principale substance protectrice synthétisée par l’endothélium (Wheatcroft et coll., 2003). En effet, au niveau de la cellule endothéliale, le NO inhibe la production d’ET-1, l’oxydation des LDL, l’expression de molécules d’adhésion et par conséquent, l’adhésion des leucocytes (Vanhoutte, 2003). Le NO exerce des effets paracrines, il favorise la relaxation des fibres musculaires lisses des vaisseaux, inhibe l’agrégation plaquettaire, empêche la prolifération des cellules musculaires lisses et exerce une action anti-inflammatoire et anti-oxydante (Boulanger, 1999 ; Kurowska, 2002; Shaul, 2002; Vanhoutte, 2003). Le NO est un gaz liposoluble synthétisé par les NOS. En présence de NADPH, d’oxygène, de BH4, de FAD et de FMN, les NOS catalysent dans une première étape l’oxydation de la L-arginine en Nω-hydroxy-L-arginine. Dans une deuxième étape, la Nω-hydroxy-L-arginine est transformée en L-citrulline et NO. Dans la paroi vasculaire, le NO diffuse de l’endothélium vers la cellule musculaire lisse en traversant librement les membranes cellulaires. Dans les cellules musculaires lisses, le NO se lie à la guanylate cyclase soluble (sGC) qui produit alors de grandes quantités de GMPc. La GMPc active la protéine kinase G (PKG) qui, à son tour, entraîne une diminution de la concentration intracellulaire en calcium, induisant la vasorelaxation. Comme nous l’avons mentionné précédemment, le NO est produit par la famille des NOS. Cette dernière comprend trois isoformes : la NOS neuronale (nNOS), la NOS inductible (iNOS) et la NOS endothéliale (eNOS). L’eNOS représente le principal isoforme impliqué dans le maintien des fonctions vasculaires. L’activité de l’enzyme eNOS peut être régulée par différents facteurs, notamment par des changements de la concentration intracellulaire de Ca2+, ce qui affecte sa liaison avec la calmoduline (Domenico, 2004 ; Walford et Loscalzo, 2003). En effet, il a été démontré que certains agonistes, comme l’acétylcholine et la bradykinine, pouvaient stimuler l’eNOS en augmentant les concentrations de calcium cytosolique (figure 5). La liaison de ces  substances vasodilatatrices à leur récepteur a pour effet d’induire une augmentation de la production d’IP-3. En retour, cela entraîne une augmentation de la libération du Ca2+ , ainsi qu’une augmentation de sa liaison à la calmoduline. Le complexe ainsi formé peut se fixer à la protéine eNOS et ainsi augmenter son activité. D’autre part, la protéine eNOS peut aussi être activée par une autre voie indépendante au Ca2+ (figure 5). À cet égard, il a été rapporté que l’insuline pouvait agir au niveau de l’endothélium vasculaire, et induire la production de NO par un mécanisme indépendant du calcium (Vincent et coll., 2003 ; Montagnani et coll., 2001). L’activation de l’eNOS peut également se faire par des stimuli mécaniques, comme les forces de cisaillement (Shear stress), qu’exerce le déplacement du sang sur la surface des cellules endothéliales. Ces forces orientées longitudinalement varient avec le débit sanguin local et les conditions d’écoulement. Les contraintes de cisaillement stimulent des récepteurs membranaires sensibles à l’étirement de la cellule. Ces mécanosenseurs ainsi activés, déclenchent des cascades complexes d’événements biochimiques, qui conduisent à des changements fonctionnels dans la cellule comme par exemple une activation de la transcription du gène codant pour la eNOS. L’induction de l’ARNm de la eNOS est d’autant plus importante que les forces de cisaillement sont importantes. Les forces de cisaillement activent la eNOS par un mécanisme calciumindépendant qui nécessite la phosphorylation de la eNOS (Corson et coll., 1996) (figure6). Cette modification post-traductionnelle survient sur le résidu sérine 1177 de l’eNOS etest médiée par la phosphorylation de l’Akt sur le résidu sérine 473. Il est à noter que ce mécanisme occupe une place cruciale dans la régulation de l’eNOS par l’exercice physique (Lehoux et Tedgui, 2004).
Dysfonction endothéliale et IRC : L’IRC se traduit aussi par des altérations biologiques vasculaires comme la dysfonction endothéliale. Ainsi l’IRC est souvent associée à une élévation du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction endothéliale se caractérise par une réduction de la production de vasodilatateurs comme le NO et/ou par une production excessive de vasoconstricteurs. La fonction endothéliale est altérée chez les patients souffrant d’IRC. Ceci a été démontré au niveau de la microcirculation (Demuth et coll., 1998), et des grosses artères (Joannides et coll., 1997). Au niveau de la microcirculation cutanée, Bradley et coll. (1988) ont démontré une vasodilatation post-ischémique réduite chez l’insuffisant rénal. Ceci a été confirmé par Demuth et coll. (1998). Par ailleurs, il a été également démontré une réduction de la vasodilatation induite par la chaleur chez lez patients atteints d’insuffisance rénale (Wilkinson et coll., 1989). Chez le patient IRC, l’altération de la fonction endothéliale touche également les grosses artères de conductance telle l’artère radiale (Joannides et coll., 1997). En utilisant les méthodes d’echotracking pour mesurer les changements de diamètre de l’artère radiale au cours d’une ischémie provoquée, ces auteurs ont démontré une diminution significative de la vasodilatation post-ischémique chez les sujets urémiques. De même, la réponse directe de l’artère radiale à l’injection locale d’acétylcholine est nettement diminuée, alors que la réponse à un donneur exogène de NO (administration sous-linguale de glycéryl-trinitrate) provoque une réponse normale (Joannides et coll., 1997). Les causes de l’altération de l’endothélium ne sont pas claires, mais semblent être liées à l’activation chronique des cellules endothéliales, aboutissant à leur dysfonctionnement. Ceci est objectivé au plan biologique par l’augmentation des concentrations sanguines des nombreux facteurs humoraux synthétisés et relargués par l’endothélium tels : l’ET-1, le type 1 de l’activateur du plasminogène ou encore, l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène (Demuth et coll., 1998 ; Haaber et coll., 1995 ; Gris et coll., 1994). Les altérations de la vasodilatation postischémique semblent étroitement liées à l’augmentation des taux circulants d’ET-1, suggérant fortement un lien de causalité entre la souffrance endothéliale et les troubles vasomoteurs chez les patients urémiques (Demuth et coll., 1998). Les études histologiques ont montré l’existence d’une micro-angiopathie des capillaires sous-épidermiques chez les patients insuffisants rénaux, caractérisée entre autre, par la présence d’une activation et d’une apoptose des cellules endothéliales (Ichimaru et Horie, 1987). Une étude a démontré que les séances d’hémodialyse et la supplémentation des insuffisants rénaux par de la L-arginine améliorent la réponse vasculaire à l’acétylcholine, suggérant surtout la présence d’un inhibiteur de la synthèse du NO (Vallance et coll., 1992). Des taux élevés d’inhibiteurs de la NOS tels la méthylguanidine et l’ADMA sont présents chez l’insuffisant rénal, et leur épuration au cours de la séance de dialyse pourrait expliquer l’amélioration des fonctions endothéliales (Hand et coll., 1998). L’hyperhomocystéinémie observée chez le patient IRC pourrait aussi être une cause des altérations endothéliales. L’hyperhomocystéinémie exerce un effet « toxique » sur l’endothélium par la génération de radicaux oxygénés (Welch et Loscalzo, 1998). Néanmoins, Van Guldener et coll. (1998) n’ont pas pu démontrer, chez des patients en dialyse péritonéale, de lien direct entre les altérations de la vasodilatation endothélium-dépendante et les taux circulants d’homocystéine. Les anomalies de la vasodilatation endothéliale peuvent être améliorées par l’administration d’antioxydants (Levine et coll., 1996) et la diminution d’activité des systèmes anti oxydants pourrait, chez l’insuffisant rénal, expliquer en partie la perte de fonction endothéliale. D’autre part, il a été observé que le sérum de sujets urémiques induisait des troubles de l’adhérence des cellules endothéliales à leur matrice extracellulaire, les rendant plus sensibles aux forces de friction entretenues par l’augmentation des flux sanguins caractéristique de l’IRC (Aznar-Salati et coll., 1995).

Mécanismes de production des dérivés de l’oxygène

   Dans la cellule, l’anion superoxyde peut être formé par différentes enzymes telles que la NADPH oxydase, la xanthine oxydase, les cyclooxygénases, les lipoxygénases, l’enzyme eNOS, le cytochrome P450 et les enzymes de la chaine respiratoire mitochondriale (Cai et Harrison, 2000; Wassmann et coll., 2004). La contribution relative de chacune de ces sources au cours d’un stress oxydatif n’est pas encore tout à fait élucidée. Cependant, dans un contexte de maladies vasculaires, plusieurs études expérimentales et cliniques ont révélé que l’enzyme NADPH oxydase représente la principale source de production de l’anion superoxyde au niveau vasculaire, intervenant dans plusieurs pathologies associées à la dysfonction endothéliale comme l’athérosclérose, l’HTA, le diabète, l’obésité ou encore l’hypercholestérolémie (Hwang et coll., 2003 ; Laight et coll., 2000 ; Pierce et coll., 2009 ; Thomas et coll., 2003). La NADPH oxydase est un complexe enzymatique multiprotéique constituant une famille d’enzymes comptant 7 membres (Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox 1 et 2) (Bedard et Krause, 2007). Elles transfèrent successivement des électrons du NADPH jusqu’à l’accepteur final O2, pour générer des anions superoxydes. Parmi les membres de cette famille, la gp91phox (phagocyte oxydase) ou Nox2 est la mieux caractérisée. Cette protéine a été clonée en 1986 (gène CYBB sur le chromosome X, locus Xp21.1), et elle est fonctionnelle sous forme de complexe assemblé suite à un stimulus. Ce complexe comprend un coeur catalytique membranaire (gp91phox et p22phox, formant le cytochrome b558) et des protéines cytosoliques (p40phox, p47phox, p67phox et Rac) (figure 7). Désassemblée quand elle est inactive au repos, la NADPH oxydase devient active à la suite de la translocation des facteurs cytosoliques à la membrane, formant ainsi un complexe enzymatique fonctionnel. En fait, l’activation de la NADPH oxydase implique deux types de phénomènes: la phosphorylation et la translocation à la membrane des sous-unités cytosoliques (Touyz et coll., 2003). En effet, suite à l’activation de la cellule, les composantes cytosoliques p40phox, p47phox, p67phox deviennent phosphorylées et vont migrer à la membrane pour s’associer aux facteurs membranaires gp91phox et de p22 phox. Parallèlement, la molécule Rac va échanger son GDP avec un GTP, se dissocier de son inhibiteur Rho-GDI, et migrer de façon indépendante à la membrane. Le cytochrome b558 est ensuite activé par la p67phox, par l’intermédiaire de son domaine d’activation (figure 7). La NADPH oxydase ainsi activéeva utiliser la NADPH cytosolique pour réduire l’oxygène et produire de l’anion superoxyde (Paclet et coll., 2000).

Table des matières

REVUE GÉNÉRALE DE LITTÉRATURE
PREMIÈRE PARTIE : L’ÉRYTHROPOÏÉTINE
1. Présentation de l’érythropoïétine 
1.1. Synthèse de l’EPO
1.2. Récepteurs et mécanismes d’action
2. L’érythropoïétine recombinante humaine 
3. La rHuEPO dans le domaine sportif (dopage) 
4. Les effets de l’EPO (Bénéfices)
5. Le risque cardiovasculaire de la rHuEPO 
DEUXIÈME PARTIE : L’INSUFFISANCE RÉNALE CHRONIQUE
1. Définition 
2. La dysfonction endothéliale dans l’IRC 
2.1. Généralités
2.2. Dysfonction endothéliale et IRC
3. Le stress oxydatif dans l’IRC
3.1. Généralités
3.1.1. Les radicaux libres
3.1.2. Mécanismes de production des dérivés de l’oxygène
3.1.3. Mécanismes de défense contre des dérivés de l’oxygène
a. Le système antioxydant enzymatique
b. Le système antioxydant non-enzymatique
3.2. Stress oxydatif et IRC
4. Les conséquences d’un traitement rHuEPO chez les patients IRC 
5. La rHuEPO et le stress oxydatif dans l’IRC
TROISIÈME PARTIE : L’EXERCICE PHYSIQUE ET LES RISQUES CARDIOVASCULAIRE ET RÉNAL
1. Effet bénéfique sur la mortalité cardiovasculaire 
2. Effets bénéfiques sur les facteurs de risque cardiovasculaire 
3. Effets de l’exercice sur la fonction endothéliale 
4. Effets de l’exercice sur le stress oxydatif 
5. Effets de l’exercice sur l’IRC 
HYPOTHESES ET OBJECTIFS
Hypothèses générales
Objectifs :
TRAVAUX EXPERIMENTAUX
PREMIÈRE PARTIE : L’EXERCICE AGGRAVE LES RISQUES CARDIOVASCULAIRES ET LA MORTALITÉ CHEZ LES RATS TRAITÉS À L’ÉRYTHROPOÏÉTINE RECOMBINANTE HUMAINE DONT LA VOIE NO SYNTHASE A ÉTÉ INHIBÉE
1. But de l’étude 
2. Méthodologie 
2.1. Animaux et traitements
2.2. Traitements
2.3. Le protocole d’exercice
2.4. Les paramètres étudiées
3. Résultats principaux 
3.1. Les effets du L-NAME seul
3.2. Les effets de la rHuEPO
3.3. Les effets de l’exercice
4. Discussion et conclusion 
DEUXIÈME PARTIE : LES RISQUES CARDIOVASCULAIRE ET RÉNAL DES RATS IRC SONT PRÉVENUS PAR L’EXERCICE PHYSIQUE MAIS AGGRAVÉS QUAND LES RATS ENTRAÎNÉS SONT TRAITÉS À L’ÉRYTHROPOÏÉTINE RECOMBINANTE HUMAINE. IMPLICATION DE LA NAD(P)H OXYDASE ET LA VOIE DES MAPK ERK 1/2
1. But de l’étude 
2. Méthodologie 
2.1. Animaux
2.2. Traitement et chirurgie
2.3. Protocole d’exercice
2.4. Les paramètres étudiés
3. Résultats principaux 
3.1. Les effets de l’exercice chez le rat IRC
3.2. Les effets du traitement rHuEPO chez le rat IRC
3.3. Les effets de l’exercice combiné au traitement rHuEPO
4. Discussion et conclusion 
DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALES

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