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Méthodes
Choix de la plante
Enquêtes ethnobotaniques
Le choix de la plante à utiliser lors d’une étude phytochimique dépend de certains critères connus après une enquête ethnobotanique.
– Les utilisations traditionnelles de la plante dans le domaine médicinal
L’enquête ethnobotanique permet de savoir si la plante avait des utilisations empiriques dans la vie quotidienne. Parfois, les habitants se servent de la plante pour se soigner et traiter contre différentes maladies. Si la plante a été utilisée traditionnellement en tant que plante médicinale, il est intéressant de l’étudier chimiquement pour donner plus de précisions à son utilisation ainsi que de justifier ses propriétés biologiques.
– La localisation de la plante
– La chimiotaxonomie
Cette partie est basée sur l’étude bibliographique. La chimiotaxonomie permet de connaitre les informations sur les autres espèces du genre Psorospermum. Elle permet également d’assurer la présence ou non de métabolites secondaires à chercher.
Matériel végétal
– Lieu et date de la récolte ou collecte
Psorospermum sp a été récolté dans la Région de Vakinankaratra, District de Mandoto et Commune de Benielo au mois de Mai 2015.
– Préparations des échantillons de la plante
Les organes végétatifs aériens nécessaires (tiges et feuilles) ont été récoltés, mélangés puis séchés et broyés afin d’obtenir une poudre.
Extraction
L’extraction consiste à isoler une substance, par voie physique ou chimique, d’une phase à une autre.
Il existe deux types d’extraction :
– Extraction solide-liquide
C’est l’extraction d’un soluté contenu dans un solide par un liquide. Elle se fait par une macération directe de poudre de la plante dans un solvant organique extracteur. Ce mode d’extraction donne plus de rendement en extrait.
– Extraction liquide-liquide
L’extraction liquide-liquide est une méthode basée sur la différence de solubilité des deux phases non miscibles.
La méthode d’extraction utilisée dans le présent travail a été l’extraction liquide-liquide. Elle est composée de deux étapes :
La macération hydroalcoolique
500g de poudre obtenue ont été macérés dans 3l d’Ethanol à 80% pendant 10j et sous agitation. Après filtration, la solution a été évaporée pour obtenir l’extrait hydroalcoolique.
Séparation
L’extrait hydroalcoolique a été dilué par l’eau chaude pour obtenir une solution puis cette dernière a été versée dans une ampoule à décanter. Le partage liquide-liquide a été fait en premier lieu par l’ajout de 3 fois 100ml d’Hexane et ce qui dépigmente à la fois la solution. Après chaque décantation, les solutions hexaniques ont été récupérées, rassemblées puis évaporées pour obtenir l’extrait hexanique.
Les opérations précédentes ont été répétées pour le Dichlorométhane et l’Acétate d’éthyle pour obtenir respectivement les extraits au Dichlorométhane et celui à l’Acétate d’éthyle. Cette procédure est présentée dans le diagramme 1.
Diagramme 1 : L’extraction liquide-liquide de l’extrait hydroalcoolique de Psorospermum sp
Criblage phytochimique (BEKRO Y. A. et al, 2007) (YEMOA et al, 2008)
Généralement, le criblage phytochimique a pour but de caractériser les familles chimiques présentes dans une plante. Pour des plantes de même genre, ces familles chimiques présentes sont parfois similaires. Le criblage phytochimique utilise la poudre de plante ou l’extrait hydroalcoolique.
Screening des alcaloïdes
Le screening des alcaloïdes comprend le test préliminaire et le test de confirmation.
– Test préliminaire
Un volume de la solution hydroalcoolique, équivalent à 25g de la poudre de plante, a été mis dans un cristallisoir. Il a été ensuite évaporé afin d’obtenir un résidu. Ce dernier a été ajouté de 10ml de HCl 2N et agité en chauffant dans un bain marie bouillant pendant 3 à 5min. Après refroidissement à la température ambiante, la solution acide a été ajoutée de 0,5g de NaCl. Après agitation du mélange réactionnel, l’ensemble a été filtré et le précipité a été lavé avec du HCl 2N.
Ensuite, le filtrat a été reparti dans 4 tubes à essais pour effectuer les tests suivants :
– Tube n°1 : le témoin ;
– Tube n°2 : ajout de 5 gouttes de Réactif de Wagner ;
– Tube n°3 : ajout de 5 gouttes de Réactif de Mayer ;
– Tube n°4 : ajout de 5 gouttes de Réactif de Dragendorff. Les tests sont des tests de précipitation.
– Test de confirmation
Ce test n’est effectué que si le test avec le Réactif de Wagner et le Réactif de Mayer sont positifs.
L’alcool est éliminé, par évaporation sous pression réduite, de la solution hydroalcoolique avec un volume équivalent à 5g de la poudre de plante. Le résidu est ensuite ajouté d’une solution de NH4OH à 50% jusqu’à pH = 9 et est extrait 3 fois avec le chloroforme. Les solutions chloroformiques regroupées sont lavées dans une ampoule à décanter avec l’eau et séchées avec Na2SO4 anhydre. Ensuite, la solution est filtrée et évaporée à sec. Enfin, le résidu est repris par HCl 10% puis réparti dans 4 tubes à essais et les mêmes tests que ceux réalisés précédemment ont été refaits.
Screening des flavonoïdes et des leucoanthocyanes
L’extrait hydroalcoolique équivalent à 3g de poudre de plante a été dépigmenté par un épuisement à l’hexane. Après évaporation de l’hexane, le résidu a été dissout dans l’éthanol et filtré. Le filtrat a été ensuite réparti dans 5 tubes à essais pour effectuer les tests.
– Tube n°1 : le témoin
– Test de Wilstater
Dans le Tube n°2, le résidu a été ajouté de 0,5ml de HCl concentré et quelques tournures de Mg. Après 10min, il doit y avoir une apparition de couleur si le test est positif.
Si la coloration est rouge, présence de flavones.
Si la coloration est rouge à pourpre, présence de flavonols.
Si la coloration est rouge violacée, présence de flavanones et flavanols.
Dans le Tube n°3, le résidu a été ajouté de 0,5ml de HCl concentré et quelques tournures de Mg. Après dissolution de Mg, 1ml d’eau et 1ml d’alcool isoamilique ont été versés dans le mélange. Après 10min, l’apparition de la couleur de la phase supérieure est observée au cas où le test est positif.
Si la coloration est rouge, présence de flavone.
Si la coloration est rouge à pourpre, présence de flavonols. Ce test de coloration est représenté par la réaction suivante (Figure 2).
Flavone : coloration
jaune en générale
Anthocyanidine :
coloration rouge orangée
– Test de Bate Smith
Dans le Tube n°4, le filtrat a été ajouté de 0,5ml de HCl concentré et chauffé pendant 30min au bain marie. Après refroidissement, si la coloration est rouge violacée, il y a présence de leucoanthocyanes.
Dans le Tube n°5, le filtrat est ajouté de 0,5ml de HCl concentré à froid, si la coloration est rouge, il y a présence d’anthocyanes.
Screening des tanins et des polyphénols
Un extrait hydroalcoolique équivalent à 5g de poudre de plante a été ajouté de 15ml d’eau distillée. La solution est ensuite chauffée puis agitée. Après, elle a été additionnée de 4gouttes de solution de NaCl 10% puis filtrée.
Le filtrat a été réparti dans 4 tubes à essais pour faire les tests.
– Tube n°1 : le témoin ;
– Tube n°2 : ajout de 4gouttes de gélatine à 1%. L’apparition d’une précipitation implique la présence de polyphénols ;
– Tube n°3 : ajout de 4 gouttes de gélatine salée (gélatine à 1% + NaCl 10%).
L’observation d’un précipité est due à la présence de tanins ;
– Tube n°4 : ajout de 4 gouttes de FeCl3 10% dans MeOH. L’apparition de coloration confirme un test positif.
Si la coloration est bleu-vert, présence de tanins condensés.
Si la coloration est noir bleuâtre, présence de tanins hydrolysables.
S’il n’y a pas une coloration (incolore), absence de tanins.
Screening des quinones
Un extrait hydroalcoolique équivalent à 5g de poudre de plante a été dissout dans 15ml d’eau distillée puis la solution obtenue a été filtrée. Le filtrat a été ensuite extrait par un mélange Hexane-Chloroforme (3/1) (v/v) dans une ampoule à décanter (250ml). La solution a été ajoutée de 5ml de NH4OH au ½ puis agitée.
Si le changement de la coloration de la phase inférieure est rouge violacée, il y a présence de quinones.
Screening des stéroïdes et des terpénoïdes
Un extrait hydroalcoolique équivalent à 5g de poudre de plante a été dépigmenté par 3*5ml d’Hexane, agité puis filtré. L’opération a été répétée jusqu’à élimination des pigments. Le filtrat a été ensuite ajouté de 10ml de Chloroforme et agité pendant 10min. Après décantation, la solution a été séchée avec du Na2SO4 anhydre puis filtrée.
Le filtrat a été divisé dans 5 tubes à essais pour effectuer les tests.
– Tube n°1 : le témoin
– Test de Liebermann Burchard
– Tube n°2 : ajout de 5 gouttes d’anhydride acétique et 5 gouttes de H2SO4 concentré. L’apparition d’une coloration est caractéristique d’un test positif.
Si la coloration est rouge pourpre, présence de triterpénoïdes.
Si la coloration est violet ou bleu vert, présence de stéroïdes.
– Test de Salkowski
– Tube n°3 : inclinaison du tube à 45° puis ajout de 1ml de H2SO4 concentré.
Si l’anneau de séparation est de couleur rouge, il y a présence de stérols insaturés.
– Test de Badjet Kedde
– Tube n°4 : ajout de quelques grains d’acide picrique. Si la coloration est rouge, il y a présence de stéroïdes lactoniques.
– Test de Keller-Killiani
– Tube n°5 : ajout de 6 gouttes de FeCl3 10% et 6 gouttes d’acide acétique glacial. Ensuite, le tube a été incliné à 45°. Si l’anneau de séparation est de couleur rouge pourpre, il y a présence de 2-désoxy sucre.
Screening des saponines
1g de poudre de plante a été ajouté de 10ml d’eau distillée. La solution a été ensuite agitée vigoureusement pendant 30s. Ensuite, le tube a été placé verticalement pendant 30min et si après cette période, la hauteur de la mousse est supérieure ou égale à 3cm, la plante contient des saponines.
Screening des polysaccharides
Un décocté a été préparé avec 5g de poudre de plante puis filtré. Le filtrat a été ensuite ajouté de 3 fois de la quantité du filtrat avec un volume d’alcool. La formation d’un précipité indique la présence de polysaccharides.
Pour la qualification des résultats du criblage phytochimique, le barème d’appréciation est donné dans le tableau VI suivant.
Test d’activité antioxydante
Test qualitatif
Dans 100ml de Méthanol, 25mg de DPPH a été dissout afin d’obtenir une concentration de 25%. Cette solution a été gardée à -20°C et à l’abri de la lumière avant utilisation La plaque contenant le produit ou extrait à tester a été pulvérisée par la solution Méthanolique de DPPH et le résultat a été observé après séchage de la plaque.
Quantification du pouvoir antioxydant
– Principes
L’addition du radical DPPH à une solution Ethanolique (ou Méthanolique) contenant un composé potentiellement antioxydant et pouvant céder un atome d’hydrogène entraine donc une diminution de la coloration violette caractéristique de l’apparition de la forme réduite du DPPH (figure 3). Cette diminution peut être facilement suivie par un spectrophotomètre à une longueur d’onde λ = 517nm. La rapidité de la perte de couleur est directement proportionnelle à l’activité antioxydante du donneur d’hydrogène (GRIGORAS C. G., 2012).
Mode opératoire
Cette activité est déterminée selon la méthode d’AWIKA et al, 2003. 25mg de DPPH sont dissous dans 100ml de méthanol et gardés à -20°C à l’abri de la lumière avant utilisation. Dans des tubes secs, 200μl de la solution à tester sont introduits, puis ajouté de 3800µl de la solution de DPPH à 25%. Pour chaque concentration, un blanc constitué de 3800μl de DPPH, additionné de 200µl de méthanol est préparé. Après 30min d’incubation à l’obscurité à la température ambiante, une mesure de l’absorbance à λ = 517nm a été effectuée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’activité antioxydante qui exprime la capacité de piéger le radical libre est estimée par le pourcentage de décoloration du DPPH en solution dans le méthanol. Elle est donnée par la formule suivante :
Inhibition (%) = (Abscontrol – Abstest /Abscontrol) x 100 (YOO et al, 2008)
Où Abs désigne l’absorbance à la longueur d’onde de λ = 517nm.
Les résultats ont été exprimés par la moyenne de 3 mesures ± écart type.
Le pourcentage d’inhibition ainsi calculé a été comparé en utilisant deux courbes d’étalonnage de l’α- tocophérol des valeurs comprises entre 6,25µM à 100µM et 150µM à 600µM.
Résultat du test d’activité antioxydante
Test qualitatif d’activité antioxydante de l’extrait à l’Acétate d’éthyle développé sur une plaque chromatographique
La plaque chromatographique contenant l’extrait à l’Acétate d’éthyle à séparer a été pulvérisée par la solution Méthanolique de DPPH à 25%. Après séchage de la plaque, presque tous les produits contenus dans l’extrait à l’Acétate d’éthyle ont présenté la coloration jaune, ce qui signifie test positif. Ainsi, les deux produits isolés sont supposés avoir une activité antioxydante.
Les figures (13) ci-après montrent respectivement le test qualitatif d’activité antioxydante de l’extrait à l’Acétate d’éthyle développé par les proportions : 50/48/02, 50/45/05 et 50/40/10 (v/v/v) (Hex/AcOEt/MeOH).
Résultat de la quantification du pouvoir antioxydant des extraits Ethanoliques et à l’Acétate d’éthyle ainsi que le produit P1 du Psorospermum sp
La quantification de l’activité antioxydante d’un extrait ou un produit est mesurée en se référant à l’activité antioxydante de l’α-tocophérol en variant sa concentration. Cette variation de concentration de l’α-tocophérol en fonction de l’absorbance est présentée dans la figure 14 suivante. Or, avant d’utiliser cette courbe, les valeurs de l’absorbance du DPPH à λ = 517nm des extraits Ethanolique et à l’Acétate d’éthyle ainsi que du produit isolé (P1) ont été mesurées. Ces valeurs sont données dans le tableau XX suivant.
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Table des matières
INTRODUCTION
I. GENERALITES
I.1 Classification botanique
I.1.1 La famille CLUSIACEAE
I.1.2 La sous-famille HYPERICOIDEAE
I.1.3 La tribu VISMIEAE
I.1.4 Le genre Psorospermum
I.2 Description botanique
I.2.1 Psorospermum sp
I.2.2 Travaux antérieurs sur quelques espèces du Psorospermum
I.3 L’activité antioxydante
I.3.1 Définition
I.3.2 Mécanisme
I.4 La spectroscopie de RMN
I.5 Les polyphénols
I.5.1 Définition et importance
I.5.2 La classification des polyphénols
I.6 Les Flavonoïdes
I.6.1 Définition et importance
I.6.2 La classification des flavonoïdes
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 Les Matériels utilisés
II.1.1 Matériel végétal
II.1.2 Matériels de laboratoire
II.2 Méthodes
II.2.1 Choix de la plante
II.2.2 Extraction
II.2.3 Criblage phytochimique
II.2.4 Fractionnement et isolement
II.2.5 Méthode de purification
II.2.6 Détermination de structure
II.2.7 Test d’activité antioxydante
III. RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1 Résultats du criblage phytochimique
III.2 Résultats des extractions
III.2.1 Masse de l’extrait hydroalcoolique et son rendement
III.2.2 Résultats de l’extraction liquide-liquide de l’extrait hydroalcoolique
III.3 Résultats du test antioxydant de chaque extrait
III.4 Résultats du fractionnement et isolement
III.4.1 Résultats de la chromatographie sur couche mince
III.4.2 Résultats de la chromatographie sur colonne
III.5 Résultats de la purification
III.6 Résultats de la détermination de structure
III.7 Résultats du test d’activité antioxydante
III.7.1 Test qualitatif d’activité antioxydante de l’extrait à l’Acétate d’éthyle
III.7.2 Résultats de la quantification du pouvoir antioxydant
IV. CONCLUSION
V. REFERENCES
VI. WEBOGRAPHIES
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