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Les caractères bactériologiques
Les caractères morphologiques
Toutes les entérobactéries ont une morphologie habituellement typique, sous forme de bacilles à gram négatif de 2 à 3 µ de long sur 0,6µ de large généralement polymorphes. Les espèces les plus représentées sont mobiles grâce à une ciliature péritriche. Les autres sont immobiles (Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis…). La présence d’une capsule visible au microscope est habituelle chez Klebsiella. La plupart des espèces pathogènes chez l’homme possèdent des pili (ou fimbriae) qui constituent des facteurs d’adhésion.
Les caractères culturaux
Les entérobactéries aérobie-anaérobies facultatives se développent facilement sur milieux nutritifs simples.
Sur milieux gélosés, les colonies d’entérobactéries sont habituellement lisses, brillantes, de structure homogène (type « smooth » ou S). Cet aspect peut évoluer après cultures successives vers des colonies à surface sèche et rugueuse (type « rough » ou R).
Les colonies de bactéries capsulées telles que Klebsiella sont mucoïdes, plus grandes que les colonies S, avec une tendance à la confluence.
Les caractères biochimiques
Le diagnostic de genre et d’espèce repose sur l’étude des caractères biochimiques, après que le diagnostic de famille ait été établi avec certitude.
Production d’hydrogène sulfuré (SH2)
La production de SH2 par les microorganismes est mise en évidence par incorporation du fer ou du plomb dans le milieu destiné à cette étude. Il se forme un précipité noir de sulfure de fer ou de plomb. Ce soufre réduit va se combiner avec le fer ferreux Fe2+ qui vient du sulfate de fer.
Recherche de l’uréase
Les bactéries possédant une uréase active scinde l’urée en dioxyde de carbone et en ammoniaque. Ceux-ci en se combinant donnent du carbonate d’ammonium. Le carbonate d’ammonium formé alcalinise le milieu, ce qui se traduit par le virage de l’indicateur coloré, de l’orange au rose framboise ou dans de rares cas au rouge violacé.
Production d’indole
Certaines bactéries dégradent le tryptophane grâce à une enzyme appelée tryptophanase. Il se forme de l’indole, de l’acide pyruvique et de l’ammoniaque. L’indole est apolaire et réagit fortement avec le para diméthylamino-benzaldéhyde en milieu acide pour donner un anneau rouge qui remonte en surface.
Recherche des décarboxylases
Les décarboxylases (la Lysine décarboxylase, l’Ornithine décarboxylase, et l’Arginine dihydrolase) scindent les acides aminés, entraînant la formation de l’amine correspondante et la libération de CO2.
Il s’agit d’enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH acide (pH optimum : 3,5 à 5,5) et des conditions d’anaérobiose. Le milieu d’étude contient du glucose, un indicateur coloré (le rouge phénol) et bien entendu un acide aminé.
Chez les bactéries à métabolisme, la fermentation du glucose entraîne une baisse de pH suffisante pour favoriser la synthèse de l’enzyme ; l’alcalinité due à l’amine entraîne ensuite le virage de l’indicateur au violet après une courte phase de jaunissement.
Si la bactérie étudiée ne possède pas de décarboxylases, le milieu restera acide, donc jaune.
Recherche des désaminases oxydatives
Les désaminases, enzymes induites, agissent sur les acides aminés en entrainant la formation des acides cétoniques correspondants.
Les acides cétoniques formés ont la propriété de donner des complexes colorés avec les ions Fe3+, réaction utilisée pour la lecture.
Utilisation du Citrate de Simmons (CS)
L’utilisation du citrate, comme seule source de carbone par les bactéries, se traduit par une alcalinisation du milieu (virage au bleu).
Utilisation du malonate
Le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate déshydrogénase).
Seules les bactéries qui peuvent utiliser le cycle glyoxalique sont capables de pousser sur un milieu au malonate.
L’utilisation du malonate s’accompagne d’une libération d’ions OH-alcalinisant.
Action de la Phényl Alanine Désaminase (PDA)
La PDA, enzyme induite, agit sur la phényl alanine en entraînant la formation d’acide cétonique correspondant.
L’acide cétonique formé a la propriété de donner des complexes colorés avec les ions Fe3+ donnant une coloration bleue.
Milieu au Citrate de Christensen (CC)
A la différence du Citrate de Simmons, ce milieu contient une faible quantité de glucose, d’extrait de levure et une source d’azote organique.
Dans ces conditions, certaines bactéries citrate négatif sur milieu de Simmons sont capables d’utiliser le citrate en milieu de Christensen.
La formation d’ions hydroxydes alcalinise le milieu (virage du jaune au rose).
Recherche de l’acétoïne ou Réaction de Voges-Proskauer (VP)
On étudie la formation de l’acétyl méthyl carbinol (A.M.C. ou acétoïne) soit à partir de deux molécules d’acide pyruvique, soit à partir du glucose.
En présence d’une base forte, l’acétoïne donne une coloration rouge en milieu très oxygéné (oxydation en diacétal).
Test à l’ONPG (Ortho nitrophényl β-D-Galactopyranoside)
Le terme ONPG hydrolase est plus à propos que celui de β-galactosidase dans la mesure où il précise que le substrat utilisé est l’ONPG et non le lactose.
En effet, il existe des germes qui reconnaissent l’ONPG du côté du nitro-2-phénol et non de celui du β-galactoside. Ces germes ont donc une activité ONPG hydrolase tout en ne fermentant pas le lactose.
Le test à l’ONPG est une technique basée sur l’action directe de l’enzyme sur une molécule chromogène pouvant être l’ortho-nitrophényl-β-D-galactopyranoside ou le 2-naphtol-β-D-galactopyranoside. Ceux-ci sont utilisés comme substrats et libèrent respectivement l’ortho nitrophénol (jaune) et le β-naphtol.
Etude des genres Escherichia, Klebsiella, et Salmonella
Escherichia
Ce genre ne comporte qu’une seule espèce Escherichia coli. Les souches immobiles et agazogènes anciennement décrites comme Alkalescens dispar ne sont plus qu’un biovar de Escherichia coli.
Escherichia coli
Hôte normal de l’intestin de l’Homme et des animaux, c’est l’espèce aérobie la plus représentée dans le tube digestif. La présence de colibacilles ou espèces voisines dans l’eau est un témoin de contamination fécale [5, 4].
Escherichia coli exprime les caractères généraux des entérobactéries. Il est en outre :
– Lactose +
– Indole +
– Citrate –
– Acétoïne –
– H2S-
– gaz +
– Uréase –
Il existe différents pathotypes de Escherichia coli responsables d’infections intestinales :
– ETEC : Enterotoxinogen Escherichia coli, responsable de la « diarrhée des voyageurs » ou « turista » et des syndromes épidémiques dans les pays du Tiers-monde ;
– EIEC : Enteroinvasive Escherichia coli, encore appelé Escherichia coli Shigella-like, responsable de syndromes dysentériques avec invasion de la muqueuse intestinale ;
– EHEC : Enterohaemorragic Escherichia coli, responsable des diarrhées sanglantes liées à la production de toxines ;
– EPEC : Enteropathogen Escherichia coli, responsable de gastro-entérites infantiles.
Klebsiella
Au sein des entérobactéries, les bactéries du genre Klebsiella se distinguent par leur immobilité constante, leur groupement en diplobacilles généralement encapsulés.
On distingue cependant plusieurs espèces mais Klebsiella pneumoniae est la plus fréquemment retrouvée en clinique humaine.
Klebsiella pneumoniae
Connue autrefois sous le nom de pneumobacille de FRIEDLANDER, Klebsiella pneumoniae est une bactérie commensale de l’intestin, des voies respiratoires de l’homme et des animaux.
Chez l’homme, elle est l’agent responsable des pneumopathies aiguës, d’angines, d’otites, de cystites et d’affections rénales.
Ce sont des bacilles à Gram négatif immobiles capsulés, surtout au sortir de l’organisme, très polymorphes.
Sur gélose : les colonies de type mucoïde ont un aspect caractéristique ; elles sont volumineuses (4 mm de diamètre), bombées, brillantes, opaques et souvent confluentes.
En bouillon, on note la formation d’un trouble dense avec collerette visqueuse.
Klebsiella pneumoniae est en général :
– Gaz +++
– Lactose +
– ONPG –
– Urée +
– Indole –
– VP+
– ODC–
QUELQUES NOTIONS SUR LA CROISSANCE BACTERIENNE
Conditions nutritionnelles et environnementales
La croissance bactérienne est dépendante de la composition de son environnement, qui lui fournit toutes les substances indispensables et les conditions convenables à son développement.
Besoins nutritifs de la cellule bactérienne
Les bactéries ont toutes des besoins communs de base, comme eau, sources d’énergie, et nutriments (sources de carbone, d’azote et autres éléments nécessaires aux biosynthèses).
Les nutriments de base permettant de générer la biomasse
La première indication des besoins est liée à la constitution de la cellule bactérienne. L’analyse de la cellule bactérienne montre que 95% de son poids sec correspond à quelques éléments majeurs. D’autres éléments sont nécessaires en quantité faible : micro-éléments ou micronutriments.
L’eau
L’eau représente 80 à 90% du poids cellulaire. C’est un élément fondamental, solubilisant les nutriments, assurant leur transport et réalisant des réactions d’hydrolyse. Un paramètre, l’Aw (activité de l’eau), qualifie la disponibilité de l’eau. Il est compris entre 0 et 1. Les micro-organismes exigent un certain seuil d’humidité. Si l’Aw est trop faible, la croissance diminue. Les formes de résistance des bactéries (endospores), peuvent se maintenir dans un environnement « sans eau libre ».
Macro-éléments
Six de ces éléments représentent environ les 95% du poids sec de la bactérie. Ce sont le carbone, l’azote, l’oxygène, l’hydrogène, le phosphate et le soufre, mais aussi les constituants des acides nucléiques, glucides, lipides et protéines.
D’autres ont une moindre importance quantitative, par exemple : potassium, magnésium, calcium et fer (certains participant à l’activation d’enzymes).
Besoins en carbone
Deux groupes de bactéries existent quant à l’assimilation du carbone : Ceux qui utilisent comme source unique de carbone, un carbone minéral (comme le CO2) : ce sont les C-autotrophes. La réduction du carbone à partir de l’anhydride carbonique demande beaucoup d’énergie et de nombreuses bactéries ne peuvent effectuer cette transformation. Celles qui utilisent comme source de carbone, un composé organique, préformé et réduit par d’autres organismes sont les C-hétérotrophes. Souvent les substances sont en même temps des sources d’énergie.
Certaines bactéries peuvent utiliser le carbone minéral et organique (« C-mixotrophes »). Certains substrats carbonés ne sont pas assimilés mais servent de source d’énergie.
Micro-éléments
Pour les autres bio-éléments, la cellule en demande de très faibles quantités. Ils sont souvent apportés comme impuretés du matériel, de l’eau, des sels utilisés pour fabriquer le milieu de culture. Citons les plus importants : Mn, Co, Cu, Mo, Zn, Ni.
Les aliments énergétiques
Les micro-organismes ont besoin d’énergie pour synthétiser la biomasse, pour réaliser un travail (mobilité, transport de substrats). La source d’énergie peut être la lumière ou souvent l’oxydation d’un substrat oxydable dit « énergétique » donneur d’électrons. La récupération de l’énergie sous forme d’ATP est liée, soit à un transfert d’électrons par des chaines de transport à partir d’un donneur vers un accepteur, soit à une phosphorylation au niveau du substrat.
Autres facteurs intervenant dans la croissance des bactéries
En dehors de l’eau, des nutriments et des sources énergétiques, le milieu de croissance doit présenter des paramètres physiques adaptés aux caractéristiques des bactéries présentes.
Le pH
Il intervient dans l’activité métabolique et la perméabilité membranaire. Les bactéries maintiennent un pH interne relativement constant, mais elles tolèrent de larges variations de pH. De nombreuses bactéries se multiplient préférentiellement à un pH neutre (6,5 – 7,5). Les acidophiles préfèrent des pH inférieurs à 6, les basophiles ou alcalinophiles se développent de façon optimale à pH supérieur à 8.
Par conséquent, il sera possible d’enrichir un prélèvement en un type de bactérie recherché par utilisation d’un milieu à un pH déterminé (ex : pH = 9 pour Vibrio cholerae).
Le développement de micro-organismes dans un milieu de culture peut modifier fortement le pH. Il est donc nécessaire d’introduire des substances tampons pour limiter ces variations.
La pression osmotique du milieu
La pression osmotique est fonction de la concentration du soluté de part et d’autre d’une membrane. Les bactéries ont des systèmes de transport qui assurent des conditions osmotiques constantes à l’intérieur de la cellule. La plupart des bactéries ont une bonne tolérance aux variations de pression osmotique, en raison de la présence d’une paroi rigide et maintiennent une pression de turgescence, à l’exception des mycoplasmes (sans paroi). Certaines bactéries ne peuvent croitre que dans des milieux à forte concentration de NaCL (supérieure à 0,2M), ce sont des halophiles. Il y en a qui sont non halophiles et qui se développent à des taux de NaCl inférieurs à 0,2M.
La température
Le domaine de température de croissance d’une bactérie est défini par les températures cardinales : température optimale, minimale et maximale.
Les bactéries mésophiles peuvent se développer entre 5 et 45°C (optimum 30 à 37°C).
Les bactéries thermophiles peuvent croître entre 25 et >55°C (optimum vers 50°C).
Les bactéries psychrophiles peuvent se développer entre environ -15°C et 20°C (optimum vers 5 – 10°C).
Les bactéries psychotropes quand à elles croissent à des températures comprises entre -5°C et 35°C (optimum souvent vers 20 – 25°C).
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. ENTEROBACTERIES
1.1. Définition
1.2. Taxonomie
1.2.1. Historique
1.2.2. Habitat
1.2.3. Classification
1.3 caractères bactériologiques
1.3.1 caractères morphologiques
1.3.2. caractères culturaux
1.3.3. caractères biochimiques
1.3.3.1. Production d’hydrogène sulfuré (SH2)
I.3.3.2. Recherche de l’uréase
1.3.3.3. Production d’indole
1.3.3.4. Recherche des décarboxylases
1.3.3.5. Recherche des désaminases oxydatives
1.3.3.6. Utilisation du Citrate de Simmons (CS)
1.3.3.7. Utilisation du malonate
1.3.3.8. Action de la Phényl Alanine Désaminase (PDA)
1.3.3.9. Milieu au Citrate de Christensen (CC)
1.3.3.10. Recherche de l’acétoïne ou Réaction de VogesProskauer (VP)
1.3.3.11. Test à l’ONPG (Ortho nitrophényl β-DGalactopyranoside)
1.4.1. Escherichia
1.4.2. Klebsiella
1.4.3. Salmonella 14
II. QUELQUES NOTIONS SUR LA CROISSANCE BACTERIENNE
2.1. Conditions nutritionnelles et environnementales
2.1.1. Besoins nutritifs de la cellule bactérienne
2.1.1.1. nutriments de base permettant de générer la biomasse
2.1.1.2. aliments énergétiques
2.1.2. Autres facteurs intervenant dans la croissance des bactéries
2.1.2.1. pH
2.1.2.2. pression osmotique du milieu
2.1.2.3. température
2.1.2.4. L’oxygène moléculaire
2.2. Croissance bactérienne
2.2.1. Définition
2.2.2. courbe et phases de la croissance
2.2.3. Techniques de mesure de la croissance bactérienne
2.2.4. Conditions de croissance des entérobactéries étudiées
III. QUELQUES PARAMETRES ET PROCEDURES DE VALIDATION
3.1. validation
3.2. Procédures et paramètres de validation
3.2.1. Procédures
3.2.2. Paramètres
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
II. MATERIELS ET METHODES
2.1. Matériels et réactifs
2.1.1. Matériels
2.1.1.1. Souches bactériennes
2.1.1.2. Matériel pour l’identification
2.1.1.3. Matériel pour la conservation des souches
2.1.1.4. Matériel pour l’enrichissement et l’isolement
2.1.2. Réactifs
2.1.2.1. Réactifs pour l’enrichissement et l’isolement
2.1.2.2. Réactifs pour l’identification
2.1.2.3. Réactifs de révélation
2.2. Contrôle de qualité des tests effectués
2.2.1. Contrôle de stérilité des milieux d’enrichissement et d’isolement
2.2.2. Contrôle de qualité des galeries d’identification déshydratées
2.2.2.1. Contrôle de stérilité
2.2.2.2. Contrôle d’efficacité
2.2.2.3. Contrôle des appareils
2.2.2.4. Contrôle des paramètres dynamiques
2.3. Méthodes pneumoniae, et Salmonella paratyphi A
2.3.2. Recherche de l’effet de l’inoculum et du temps d’incubation sur l’identification des entérobactéries par les galeries Micro-CSB
2.3.2.1. Préparation de l’inoculum de départ
2.3.2.2. Incubation et prélèvements
2.3.2.3. Dénombrement bactérien sur boîte de pétri
2.3.2.4. Ensemencement des galeries Micro-CSB
2.3.3. Exploitation des résultats
2.3.4. Validation des résultats
2.3.4.1. Test de reproductibilité
2.3.4.2. Test de répétabilité
III. EXPLOITATION DES RESULTATS
3.1. Résultats des galeries d’identification en fonction de l’inoculum et du temps d’incubation
3.1.1. Escherichia coli
3.1.1.1. Résultats du dénombrement
3.1.1.2. Résultats des galeries Micro-CSB
3.1.2. Klebsiella pneumoniae
3.1.2.1. Résultats du dénombrement
3.1.2.2. Résultats des plaques Micro-CSB
3.1.3. Salmonella paratyphi A
3.1.3.1. Résultats du dénombrement
3.1.3.2. Résultats des plaques Micro-CSB
3.2. Détermination du temps d’incubation et de l’inoculumcorrespondant
3.2.1 Analyse intraspécifique
3.2.2. Analyse interspécifique
3.2.2.1. Première méthode
3.2.2.2. Deuxième méthode
3.3. Validation des résultats de l’analyse interspécifique
3.3.1. Résultats des tests de répétabilité et reproductibilité
3.3.1.1. Répétabilité
3.3.1.2. Reproductibilité
3.3.2. Probabilités d’identification
3.3.2.1. Avec un inoculum de 107 UFC/ml
3.3.2.2. Avec un inoculum de 108 UFC/ml
IV. COMMENTAIRES
4.1. souches bactériennes
4.2. dénombrement sur boîte de pétri
4.3. Identification
4.3.1. choix de la méthode : Micro-CSB (Entérobactéries)
4.3.2. Méthode d’étude de l’effet de l’inoculum et du temps d’incubation sur l’identification
4.3.3. Exploitation des résultats
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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