Résistance moléculaire et paludisme grave

Résistance moléculaire et paludisme grave

En zone d’endémie palustre, le paludisme à P.falciparum affecte surtout les enfants de moins de 5 ans. Plus de 40% des enfants de la planète vivent dans les zones où le paludisme est stable et chaque année près de 300 à 500 millions d’infections palustres engendrent 1.7 à 2.5 millions de décès. En effet, les statistiques de l’OMS estiment que le paludisme tue un enfant toutes les 30 secondes en Afrique. L’insuffisance pondérale à la naissance, L’anémie sévère, les problèmes neurologiques et l’épilepsie compromettent la santé et le développement de plusieurs millions d’enfants dans les pays tropicaux [189]. Pourquoi certains cas de paludisme sont sévères ? En effet, la plupart des cas de paludisme sont non compliqués. Seul un petit nombre a une évolution grave entraînant le plus souvent la mort. Le mécanisme étiopathogénique du paludisme sévère est encore mal élucidé et des facteurs intrinsèques au parasite (la virulence, résistance, espèce), à l’hôte (Immunité, âge, génétique, nutrition) et même des facteurs environnementaux (intensité de la transmission, socioéconomiques) sont souvent avancés pour expliquer le pronostic grave de certains cas de paludisme. Toutefois, l’émergence de la résistance de P.falciparum à la chloroquine en Afrique tropicale est associée à une forte augmentation de la mortalité palustre et le risque de décès chez les enfants de 0-9 ans a été multiplié par 2 voire par 5 dans la plupart des contextes épidémiologiques [203], [218].

La gravité de l’accès palustre est-elle due à la résistance du parasite ou la virulence des souches plasmodiales ? La virulence ou pouvoir pathogène d’un micro organisme est son aptitude à déclencher dans des conditions favorables chez son hôte, l’apparition d’une maladie plus ou moins grave et d’évolution plus ou moins rapide.

Au Niger, le nombre de cas notifiés de paludisme sévère au premier trimestre 2003-2004 est de 23.752 dont 185 décès. A l’hôpital national de Niamey, le paludisme est la principale cause de consultation et 86% des enfants de moins deux ans présentent un accès grave. La mortalité due au paludisme sévère est estimée à 21% des cas enregistrés [73]. A Niamey, le taux d’échec thérapeutique à la chloroquine est 20% chez les sujets de 1 à 5 ans et 16.7% chez les sujets de 1 à 15 ans [163]. La résistance au traitement a un impact majeur non seulement sur la gravité mais aussi et surtout sur la mortalité et constitue l’obstacle majeur dans la prise en charge médicale des malades. Nous avons analysé le lien entre le profil clinique utilisé comme indicateur de la virulence du parasite et les marqueurs de la résistance à la chloroquine (pfcrtK76T) et à l’association sulfadoxine pyriméthamine (dhfrS108N) chez les patients référés à l’hôpital national de Niamey et présentant les différents profils cliniques du paludisme grave :
❖ Neuropaludisme : Evolution d’une simple prostration au coma (NP),
❖ Convulsions : Crise convulsive ou mouvements stéréotypes (C)
❖ Anémie sévère : Hémoglobinémie ≤ 5g/dL ou hématocrite < 15% (AS),
❖ Hyperparasitèmie : Parasitèmie ≥ 4% (HP)
❖ Hypoglycémie : Glycémie < 2.2 mmol/L (HG).

Cartographie et mise en place d’un réseau de surveillance : RSRA

Bien avant 1970 la chloroquine est utilisée en première intention pour traiter les accès palustres simples au Niger. Cela s’explique non seulement par son efficacité et sa faible toxicité mais aussi et surtout par son faible coût. La première mention d’une résistance à la chloroquine au Niger a été faite en 1984 sur la base d’observations cliniques d’échecs thérapeutiques dans la région de Tillabery [159]. Cette observation fut confirmée en 1988 à l’hôpital Pitié-Salpêtrière de Paris. Les résultats des enquêtes in vivo ont révélé respectivement 9.7 % d’échec thérapeutique de type RII à Niamey, 14% de type RII à Tillabery [34]. Depuis 1978, la résistance de P.falciparum à la chloroquine a obligé de nombreux pays subsahariens à modifier le schéma thérapeutique de l’accès palustre simple [125]. Ainsi, le Niger met en place progressivement une nouvelle politique thérapeutique avec l’adoption des ACT comme traitement de première intention. Cependant, la chloroquine demeure encore très utilisée au Niger. La surveillance de l’efficacité des antipaludiques est recommandée par l’OMS. Au Niger, les résultats des tests d’efficacité clinique de la chloroquine publiés sont limités à la ville de Niamey [163], [63]. Cependant, plusieurs sites sentinelles ont été mis en place par le Programme National de Lutte contre le Paludisme (PNLP) où des études in vivo en cours de réalisation. Parallèlement aux études in vivo, les tests de résistance moléculaires offrent la possibilité d’élargir la surveillance au sein des systèmes de suivi temporels ou spatiaux. Cette surveillance permet, de manière précoce, d’identifier les zones et les périodes à risque afin d’y conduire ultérieurement des enquêtes in vivo. [28], [115], [12], [114], [98]. Plusieurs marqueurs moléculaires ont pu être associés à la résistance in vivo de P.falciparum à certaines molécules. C’est notamment le cas de la mutation K76T du gène pfcrt qui confère une résistance à la chloroquine [57]. Ce marqueur est particulièrement bien corrélé à l’échec clinique en Afrique. La mutation S108N du gène pfdhr présente une importance fondamentale dans le phénotype de résistance du parasite à la pyriméthamine [46]. La corrélation est excellente avec les tests in vitro et la présence d’autres mutations aux codons 51, 59 et 164 renforce le niveau de cette résistance [18]. Ces marqueurs moléculaires ont été jusqu’à présent peu étudiés au Niger où il a été rapporté à Niamey en 2001 26,9% de mutations K76T du gène pfcrt (n=26) et 20% de mutations S108N du gène pfdhfr (n=25) [2]. Les données disponibles sur la résistance in vivo et moléculaire sont donc fragmentaires au Niger. Il nous a paru opportun, à l’occasion du changement de politique nationale de traitement, de surveiller l’évolution de la résistance de P.falciparum à la chloroquine et à la pyriméthamine. En complément des études menées par le PNLP dans ses sites sentinelles, nous avons mis en place un Réseau de Surveillance de la Résistance moléculaire aux Antipaludiques (RSRA). En utilisant des marqueurs moléculaires nous avons évalué la prévalence des mutations de gènes d’intérêt et établi la cartographie les foyers de résistance et leur extension éventuelle. Pour cet essai pilote, nous avons préféré nous limiter à une zone géographiquement définie, relativement proche de Niamey afin de pouvoir tester les procédures de recueil et de traitement des échantillons.

Transmission anophélienne et résistance moléculaire 

A côté d’études in vivo menées par le Programme National de Lutte contre le Paludisme (PNLP) et l’OMS Niger, le CERMES a mis en place une surveillance moléculaire de la résistance [92]. Mais seuls deux marqueurs moléculaires (pfcrt76 et pfdhfr108) étaient jusqu’ici étudiés par PCR-RFLP. La technique PCR-RFLP ne permet pas, sur une grande échelle, le traitement d’un grand nombre de sites de mutations potentiellement impliquées dans la résistance. Actuellement, les bio-puces à ADN offrent la possibilité d’analyser le polymorphisme de nombreuses mutations ponctuelles ou SNPs [107], [47] et de ce fait, elles permettent le criblage de nombreux isolats plasmodiaux, y compris ceux de terrain [176]. En collaboration avec l’Institut Pasteur du Cambodge, une puce à ADN récemment développée et destinée à la surveillance de la chimiosensibilité de P.falciparum nous a permis d’étudier un plus grand nombre de sites de mutations potentiellement impliquées dans la résistance moléculaire de P.falciparum au Niger. Ainsi, la relation entre l’intensité de la transmission du paludisme et le polymorphisme de 34 SNPs de 5 gènes associés à la résistance de Plasmodium falciparum aux antipaludiques a été étudiée dans deux villages d’intensité de transmission différente. Ces gènes d’intérêt sont :
1. pfcrt : La résistance à la chloroquine est associée à la mutation ponctuelle K76T du gène pfcrt situé sur le chromosome 7 du P.falciparum. La mutation pfcrtK76T est corrélée positivement et de manière forte à la chloroquinorésistance [192]. Dans tous les cas d’échec thérapeutique à la chloroquine, la présence de cette mutation a été mise en évidence dans les isolats parasitaires [58], [151].
2. pfddhfr : La mutation ponctuelle dhfrSer108Ans du chromosome 4 est celle qui confère la pyriméthaminorésistance dont l’intensité est modulée par celles des codons 51 et 59. La triple mutation dhfrSer108Ans, dhfrCys519Arg, dhfrAns51Ile est sélectionnée au cours des échecs thérapeutiques après traitement par la sulfadoxine pyriméthamine [112], [90].
3. Pfdhps : Les mutations du gène pfdhps, situées sur le chromosome 8 et codant pour la dihydroptéroate synthétase (dhps) sont sélectionnées lors de la résistance aux sulfamides. Les mutations dhpsSer436Ala, dhpsAla437Gly, dhpsLys540Glu et dhpsAla581Gly ont été rapportées [164], [204]. Cependant, c’est la double mutation dhpsAla437Gly-dhpsLys540Glu ou la triple mutation pfdhpsSer436Ala-dhpsAla437Gly- dhpsLys540Glu qui confère des niveaux de résistance élevés [112].
4. pfmdr : Est un homologue du gène mdr (Multi drug resistant) des cellules cancéreuses des mammifères. La mutation pfmdrAsn86Tyr située sur le chromosome 5 du P.falciparum et codant pour la glycoprotéine P serait à l’origine de la résistance croisée à l’amodiaquine et à la chloroquine [71], [72]. Le nombre de copie du gène pfmdr est susceptible d’entrainer la résistance à la méfloquine [171], [30].
5. pfTPase : Le SERCA-pfATPase6 est un gène candidat de la résistance à l’artémisinine des souches de P.falciparum. La mutation pfATPase6Ser769Asn du gène codant pour cette enzyme serait associée à une augmentation des CI50 des souches plasmodiales en Guyane française [97]. Cependant, il a été observé que le Plasmodium peut développer une résistance à l’artémisinine sans mutation pfATPase6Ser769Asn [4].

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
1. CONTEXTE DE L’ETUDE
2. PROBLEMATIQUES
2.1. RESISTANCE MOLECULAIRE ET PALUDISME GRAVE
2.2. CARTOGRAPHIE ET MISE EN PLACE D’UN RESEAU DE SURVEILLANCE
2.3. TRANSMISSION ANOPHELIENNE ET RESISTANCE MOLECULAIRE
2.4. ETUDE DU POLYMORPHISME DU PFATPASE 6 AU NIGER
3. APPROCHE METHOLOGIQUE
I. GENERALITES
1. LE PALUDISME
1.1. DEFINITION
1.2. AMPLEUR DU PALUDISME ET DE LA RESISTANCE DU P.FALCIPARUM
2. LE PARASITE ET SON CYCLE BIOLOGIQUE
2.1. LE PARASITE
2.1.1. Taxonomie du Plasmodium
2.1.2. Biologie du Plasmodium
2.1.3. Métabolisme du Plasmodium
2.2. LE CYCLE BIOLOGIQUE DU PLASMODIUM
2.2.1. La transmission moustique-homme
2.2.2. La transmission homme-moustique
3. LES VECTEURS ET LA TRANSMISSION DU PALUDISME
3.1. CYCLE BIOLOGIQUE DES ANOPHELES
3.2. LA TRANSMISSION DU PALUDISME ET NOTION DE PALUDOMETRIE
4. LES MOLECULES ANTIPALUDIQUES
4.1. LES AMINO-4-QUINOLEINES
4.1.1. La chloroquine
4.1.2. L’amodiaquine
4.2. LES ARYLMETHANOLS
4.2.1. Les arylméthanols de synthèse : la méfloquine
4.2.2. Les dérivés phénanthrènes : l’halophantrine
4.3. LES ANTIFOLATES
4.3.1. Les inhibiteurs de la dihydrofolate réductase
4.3.2. Les inhibiteurs de la dihydroptéroate synthétase
4.4. LES ANTIPALUDIQUES D’ORIGINE VEGETALE
4.4.1. La quinine et ses dérivés
4.4.2. Artémisinine et ses dérivés
4.5. LES COMBINAISONS THERAPEUTIQUES
4.5.1. Définition et justification
4.5.2. Justification
5. MODE D’ACTION DES ANTIPALUDIQUES
5.1. MODE D’ACTION DES LYSOSOMOTROPES
5.1.1. Mode d’action des 4-amino-quinoléines
5.1.2. Mode d’action des amino-alcools
5.1.3. Mode d’action l’artémisinine
5.2. MODE D’ACTION DES ANTIMETABOLITES
5.2.1 Mode d’action des antifoliques
5.2.2 Mode d’action des antifoliniques
5.2.3 Mode d’action des gamétocytocides
6. MECANISME DE RESISTANCE AUX ANTIPALUDIQUES
6.1. DEFINITION ET EVOLUTION DE LA RESISTANCE AUX ANTIPALUDIQUES
6.2. MECANISMES DE LA RESISTANCE AUX ANTIPALUDIQUES
6.2.1 Mécanisme de la résistance à la chloroquine
6.2.2 Mécanisme de la résistance aux antifolates
6.2.3. Mécanisme de la résistance à l’atovaquone
6.2.4. Mécanisme de la résistance à l’artémisinine
7. METHODES D’EVALUATION DE LA CHIMIORESISTANCE
7.1. LA METHODE IN VIVO
7.1.1 Définition et objectif
7.1.2 Mise au point du test standardisé de l’OMS
7.1.3. Méthode d’étude du test standardisé de l’OMS/2001
7.2. LES METHODES IN VITRO
7.2.1 Les tests optiques
7.2.2 Les tests isotopiques
7.2.3 Les tests enzymatiques ou colorimétriques
7.3. LA METHODE IN GENO OU MOLECULAIRE
7.4. NOTION DE « GENOTYPE FAILURE INDEX OU GFI»
8. LES FACTEURS DE RESISTANCE
8.1. FACTEURS TENANT AU PARASITE
8.2. FACTEURS MEDICAMENTEUX
8.3. FACTEURS TENANT A L’HOTE
8.4. FACTEURS TENANT AUX VECTEURS
8.5. FACTEURS TENANT A L’ENVIRONNEMENT
9. ETAT ACTUEL DE LA RESISTANCE EN AFRIQUE DE L’OUEST
9.1. EPIDEMIOLOGIE GENERALE DE LA RESISTANCE AUX ANTIPALUDIQUES
9.1.1. La résistance à la chloroquine et l’amodiaquine
9.1.2. La résistance à la sulfadoxine-pyriméthamine
9.1.3. La résistance à la quinine et à la méfloquine
9.2. ETAT ACTUEL DE LA RESISTANCE MOLECULAIRE EN AFRIQUE DE L’OUEST
II. SITUATION EPIDEMIOLOGIQUE DU PALUDISME AU NIGER
1. CADRE D’ETUDE
1.1. Endémie palustre au Niger
1.2. Faciès épidémiologiques du paludisme au Niger
1.3. Vecteurs du paludisme au Niger
2. ETAT DE LA CHIMIORESISTANCE DE PLASMODIUM FALCIPARUM AU NIGER
III. MATERIEL ET METHODE
1. RESISTANCE MOLECULAIRE ET PALUDISME GRAVE
1.1. SITE D’ETUDE ET COHORTE
1.2. PRELEVEMENT SANGUIN
1.3. EXTRACTION D’ADN
1.4. POLYMERASE CHAIN REACTION : PCR
1. 5. ELECTROPHORESE
1. 6. RESTRICTION ENZYMATIQUE : RFLP
1. 7. ANALYSE STATISTIQUE
2. CARTOGRAPHIE ET RESEAU DE SURVEILLANCE : RSRA
2. 1. ZONE D’ETUDE
2. 2. COLLECTE DES ECHANTILLONS
2. 3. CONFIRMATION BIOLOGIQUE DES CAS PRESOMPTIFS
2. 4. AMPLIFICATION GENIQUE ET RESTRICTION ENZYMATIQUE : PCR/RFLP
2. 5. ANALYSE STATISTIQUE
3. TRANSMISSION ANOPHELIENNE ET RESISTANCE MOLECULAIRE
3.1. SITES D’ETUDE
3.2. METHODOLOGIE
3.3. ANALYSE STATISTIQUE
4. ETUDE DU POLYMORPHISME DU GENE PFATPASE 6 AU NIGER
4.1. SITE D’ETUDE ET ECHANTILLONNAGE
4.2. PCR ET SEQUENÇAGE
4.3 ANALYSE STATISTIQUE
IV. RESULTATS
1. RESISTANCE MOLECULAIRE ET PALUDISME GRAVE
1.1. CARACTERISTIQUE D’ECHANTILLONNAGE
1.2. LES MUTATIONS PFCRTK76T ET PFDHFRS108N
1.3. RELATION ENTRE MUTATIONS ET LES DIFFERENTS PROFILS CLINIQUES
1.3.1. Neuropaludisme et symptômes neurologiques
1.3.2. Anémie sévère palustre
1.3.3. Hyperparasitèmie
1.3.4. Hypoglycémie
1.4. LIEN ENTRE MORTALITE ET LES MUTATIONS PFCRT76T ET DHFR108N
2. CARTOGRAPHIE ET RESEAU DE SURVEILLANCE
2.1. CARACTERISTIQUES DE L’ECHANTILLON
2.2. PREVALENCES DES MUTATIONS PFCRTK76T ET DHFRS108N
2.3. DISTRIBUTION SPATIALE DES MUTATIONS
3. TRANSMISSION ET RESISTANCE MOLECULAIRE
3.1. CARACTERISTIQUES DE L’ECHANTILLON ET CODONS MONOMORPHES
3.2. CODONS POLYMORPHES ET PREVALENCE DES SNPS
3.3. LA RESISTANCE SELON LES VILLAGES
3.4. DYNAMIQUE DE LA RESISTANCE MOLECULAIRE
3.5. RESISTANCE SELON L’AGE, LA DENSITE PARASITAIRE ET LE SEXE
4. ETUDE DU POLYMORPHIME DU GENE PFATPASE6
4.1. CARACTERISTIQUE DE L’ECHANTILLONNAGE
4.2. CODONS POLYMORPHES ET PREVALENCES GLOBALES DES MUTATIONS
4.3. ANALYSE BIVARIEE CODONS SELON LA DENSITE, SEXE, VILLAGE,ANNEE
V. DISCUSSION
VI. PERSPECTIVES
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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