Résistance bactérienne aux antibiotiques 

ETIOLOGIES DES INFECTIONS RESPIRATOIRES

Les principaux virus 

Les virus représentent environ 80 % des causes d’infections respiratoires aigues.
La gravité d’une infection virale est fonction du virus respiratoire en cause et d’une susceptibilité individuelle des germes de surinfection.
Les virus les plus fréquemment rencontrés sont le virus respiratoire syncytial (VRS), le rhinovirus, le virus para influenzae, le virus influenzae, l’adénovirus et le coronavirus.

Virus Respiratoire Syncytial(VRS)

Le VRS appartient à la famille des Paramyxoviridae. C’est un virus à ARN simple brin enveloppé de structure hélicoïdale, transmis seulement par contamination direct par un patient excréteur.

Rhinovirus

Virus nus de structure icosaédrique, relativement peu thermosensibles, non détruits par les enzymes digestives. Les rhinovirus appartiennent à la famille des Picornaviridae. Ce sont des virus à ARN simple brin.

Coronavirus

Le coronavirus appartient à la famille des Coronaviridae. C’est un virus à ARN simple brin enveloppé.

Adénovirus

Virus nus, de structure icosaédrique, ils sont relativement thermosensibles. Les adénovirus appartiennent à la famille des Adénoviridae. Ce sont des virus à ADN non enveloppé.

Myxovirus influenzae et parainfluenzae

Il s’agit de virus de structure hélicoïdale enveloppés, très fr agile, transmis par contamination direct par un patient excréteur, quand il est en incubation de la maladie.

Virus parainfluenzae

Les virus para-influenzae appartiennent à la famille des Paramyxoviridae. C’est un virus à ARN simple brin.

Virus influenzae

Le virus influenzae appartient à la famille des Orthomyxoviridae. C’est un virus à ARN simple brin segmenté.

Les bactéries typiques

De nombreuses études ont montré que l’on retrouve pratiquement les mêmes germes aussi bien dans les infections respiratoires hautes que dans les infections respiratoires basses mais avec des fréquences différentes.

Streptococcus pneumoniae

Le pneumocoque appartient à la famille des Streptococcaceae comportant les genres Streptococcus et Enterococcus, les plus fréquemment rencontrés en médecine humaine. C’est un germe commensal de l’oropharynx.
Streptococcus pneumoniaese présente sous forme de diplocoque à Gram positif.
La culture est délicate en raison de sa tendance à la lyse spontanée et exige des milieux nutritifs enrichis comme la gélose au sang de mouton. L’addition de gentamicine rend le milieu sélectif au pneumocoque. Les colonies apparaissent petites, rondes, de 0,1 à 1,5mm de diamètre, développent une hémolyse alpha avec verdissement du milieu.

Streptococcus pyogenes

Encore appelé Streptocoque bêta-hémolytique du groupe A, appartient à la famille des Streptococcaceae. Streptococcus pyogenes est un commensal des muqueuses nasale et pharyngée. Il est en effet retrouvé à l’état de simple portagechez15 à 25% des enfants et moins fréquemment chez l’adulte
Ce germe se présente sous forme de cocci à Gram positif disposés en chaînettes courtes ou longues Streptococcus pyogenes donne sur gélose au sang ordinaire des colonies grisâtres, de 0,5 à 1 mm, lisses, bombées ou convexes entourées d’une zone d’hémolyse totale (bêta).

Staphylococcus aureus

Appartenant à la famille des Micrococcaceae au sein de laquelle une espèce Staphylococcus aureus (staphylocoque doré) occupe une place non négligeable dans les infections respiratoires aiguës. Cette espèce fait partie de la flore normale de nombreux individus qui sont des « porteurs asymptomatiques ». Les Staphylocoques sont retrouvés au niveau des fosses nasales antérieures. Staphylococcus aureusest un cocci à Gram positif qui tend à se grouper en amas.
La bactérie doit son nom à l’aspect pigmenté de ses colonies.
Ce germe peut être impliqué dans les phlegmons de l’amygdale, des sinusites ou des otites parfois récidivantes.

Moraxella catarrhalis

Il appartient à la famille des Moraxellaceae. C’est une espèce commensale de la flore oro-pharyngée. Le taux de portage est faible chez l’adulte (3 à 4 %) beaucoup plus élevé chez l’enfant, tout particulièrement l’enfant de moins de 2 ans, où il peut passer de 9 à 40% en fonction des saisons.
Moraxella catarrhalisse présente sous la forme de diplocoques Gram négatif.
La culture se fait sur gélose chocolat supplémentée en facteurs X et V à 37°C sous une atmosphère enrichie en 5℅ de CO2. Les colonies apparaissent nonpigmentées, de couleur grise, rosâtre ou marronne, non hémolytique, avec unesurface lisse, des bords nets et une consistance friable.

Haemophilus influenzae

C’est une espèce appartenant à la famille des Pasteurellaceae et au genre Haemophilus. Haemophilus influenzae est un commensal des voies aériennes supérieures. Ainsi 50℅ des enfants sont porteurs de cette bactérie dans leur nasopharynx.
Ce sont des bacilles (coccobacilles) à Gram négatif immobiles. La présence d’une capsule est habituelle. C’est une bactérie très fragile qui exige des milieuxspéciaux contenant des facteurs de croissance présents dans le sang : facteur V (hémine) et facteur X (NAD).

Les bactéries atypiques 

Bactéries anaérobies

Celles-ci peuvent être retrouvées dans les infections ORL telles que Bacteroїdes fragilis, ainsi que Fusobacterium, qui associé à un Spirochète est responsable de l’angine de Vincent.

Legionella pneumophila

C’est une bactérie d’origine hydro tellurique, présente à l’état naturel dans les eaux douces et sols humides. Les Légionelles sont des bacilles à Gram négatif, formant une famille de 46 espèces et 64 séro-groupes. L. pneumophilia est l’espèce la plus importante en pathologie humaine.
La légionellose ou maladies des légionnaires se traduit habituellement par une pneumopathie aiguë de sévérité variable.

Mycoplasma pneumoniae

C’est une bactérie de la famille des Mycoplasmataceae, qui a la particularité d’être dépourvue de paroi et d’être non colorable par la méthode de Gram. Elle colonise la muqueuse des voies respiratoires.
Elle est responsable de pharyngite, bronchite ou plus rarement de pneumonie atypique ; peut provoquer des pneumonies graves chez les sujets immunodéprimés ou âgés.

Chlamydia pneumoniae

C’est une bactérie intracellulaire obligatoire à Gram négatif, de la famille des Chlamydiaceae, spécifiquement humaine qui se transmet par voie aérienne Elle provoque diverses infections respiratoires le plus souvent bénignes, notamment des infections broncho-pulmonaires et des sinusites.

RESISTANCE BACTERIENNE AUX ANTIBIOTIQUES

L’antibiorésistance

La résistance bactérienne aux antibiotiques est apparue rapidement après leur introduction dans le traitement des maladies infectieuses. Cette résistance est un facteur majeur compliquant le traitement des infections bactériennes et la dissémination des souches multi-résistantes.
La résistance bactérienne aux antibiotiques se caractérise par son caractère naturel ou acquis, son mécanisme et son support génétique.

Définition

La résistance bactérienne aux antibiotiques a deux définitions :
 Une souche est dite résistante lorsque la concentration d’antibiotiques qu’elle est capable de supporter est notamment plus élevée que la concentration atteignable in vivo.
 Une souche est dite résistante lorsqu’elle supporte une concentration d’antibiotique notamment plus élevée que ce qui inhibe le développement de la majorité des autres souches de la même espèce.

Les différents types de résistance

La résistance des bactéries aux antibiotiques est soit naturelle, soit acquise. Elle peut aussi être clinique.

Résistance naturelle

La résistance naturelle d’une espèce ou d’un genre est une caractéristique propre, contenant l’ensemble des souches de l’espèce ou du genre. Elle est portée par un chromosome donc toujours transmissible à la descendance (transmission verticale).
C’est un caractère permettant de définir le phénotype sauvage et une aide à l’identification d’une espèce bactérienne.

Résistance acquise

La résistance acquise ne concerne qu’une proportion plus ou moins importante des souches d’une espèce. Elle résulte d’une modification génétique par mutation ou par acquisition de plasmides ou transposons, transmissible horizontalement, parfois entre espèces différentes. La résistance acquise définit des phénotypes résistants.
Les résistances croisées s’expriment au sein d’une même classe d’antibiotique et sont dues au même mécanisme.

Résistance clinique

La résistance clinique se traduit par l’échec thérapeutique. Plusieurs facteursentrent en cause dans ce type de résistance :des facteurs environnementaux (cations, protéines inhibitrices etc.) ; la pharmacocinétique ; le choix judicieux de l’antibiotique ; certains mécanismes de résistance développés par les bactéries

Les mécanismes de résistance

La résistance bactérienne aux antibiotiques peut découler : soit d’une modification de la cible des antibiotiques
Il peut s’agir de la substitution de la cible au profit d’une autre cible ou de la diminution de l’affinité de la cible pour l’antibiotique; soit d’une synthèse bactérienne d’enzymes inactivant les antibiotiques.
C’est un mécanisme qui repose sur l’inhibition de l’antibiotique; soit d’une diminution de la quantité d’ATB à l’intérieur de la bactérie
Elle peut être due à une diminution de la perméabilité bactérienne vis-à-vis de l’antibiotique ou à un efflux actif de l’antibiotique de l’intérieur vers l’extérieur de la bactérie.
Plusieurs de ces mécanismes peuvent coexister chez une bactérie et agir en synergie, conférant une résistance plus élevée non seulement aux antibiotiques d’une même famille mais également à des antibiotiques de familles différentes, surtout en cas de modification de la perméabilité bactérienne.

Support génétique de la résistance

D’une manière générale la résistance des bactéries aux antibiotiques est de déterminisme génétique. La résistance naturelle est portée par un chromosome.
La résistance acquise peut survenir par mutation ou par remaniement ou encore par acquisition de matériel génétique étranger.

Support chromosomique

Résistance chromosomique par mutation

Il s’agit d’une mutation ponctuelle dans un gène de résistance entrainant par exemple une hypersécrétion d’enzymes inactivant les antibiotiques ou dans un gène de structure qui modifie les pectre d’une enzyme.

Résistance aux antibiotiques des germes typiques

Streptococcus pneumoniae

Les pneumocoques étaient encore récemment réputés sensibles aux β – lactamines. Toutefois des souches résistantes à la Pénicilline ont été isolées. La résistance aux Céphalosporines de troisième génération est beaucoup plus récente. [7] Ces résistances, d’origine chromosomique ne sont pas dues à une production de bêta-lactamase. Elles résultent de modifications des protéines cibles de la bactérie : les protéines liant les pénicillines (PLP). En ce qui concerne la résistance à la Pénicilline on distingue des souches de bas niveau de résistance et des souches de haut niveau de résistance.
Plusieurs mécanismes sont à la base de la résistance aux Macrolides et apparentés:
Modification de la cible de l’antibiotique par une méthylase ribosomale codée par le gène ermB. Ce gène est associé à la résistance de haut niveau aux MLS B;
Efflux de l’antibiotique hors de la bactérie, lié au gène mefA. Ce gène est responsable de la résistance de bas niveau aux Macrolides ;
Mécanisme codée par le gène ermA(ermTR).
On note une résistance aux Kétolides (Télithromycine). Le mécanisme évoqué est une modification de la cible, notamment une déméthylation de l’ARNr par le gène ermE [13,31].
La résistance au Chloramphénicol est liée à une enzyme inactivatrice, le chloramphénicol acétyl transférase. La résistance aux Fluoroquinolones qui est rare est due à une mutation des gènes codants pour les enzymes Topo-isomérase et ADN gyrase. La résistance aux Tétracyclines est liée à un phénomène d’efflux de l’antibiotique hors de la membrane bactérienne [1, 27].

Haemophilus influenzae

H. influenzae résiste aux β- lactamines. Le mécanisme le plus fréquent est la production de β-lactamase type TEM. Ce qui est à l’origine de sa résistance à l’Ampicilline. L’activité est restaurée en présence d’un inhibiteur de β-lactamase. Un mécanisme non enzymatique est observé reposant sur une modification de la cible des β-lactamines, les PLP ayant subit des mutations ponctuelles.
Les Macrolides classiques (Erythromycine, Spiramycine, Lincomycine) sont peu actifs sur H.influenzaecontrairement aux nouveaux Macrolides (Azithromycine et Clarithromycine) [1, 27, 33].
La résistance au Chloramphénicol est de nature plasmidique. Elle est liée à la production d’une enzyme, le chloramphénicol acétyl transférase qui inactive l’antibiotique.
La résistance aux Tétracyclines est également de nature plasmidique. Elle est liée à l’insuffisance de concentration intracellulaire d’antibiotique, due à un efflux excessif de l’antibiotique hors de la membrane cytoplasmique du germe.

Examen microscopique

Deux frottis étaient réalisés : l’un coloré au Gram et l’autre au bleu de méthylène pour apprécier : le nombre de Leucocytes par champ, témoin de l’inflammation; le nombre de cellules épithéliales par champ ; l’aspect de la flore bactérienne (qualitativement et quantitativement).
Le dénombrement des leucocytes et des cellules épithéliales a été pris en compte dans la validation de l’examen bactériologique des expectorations comme l’indique le tableau ci- dessous.

Lecture et interprétation

Les diamètres d’inhibition étaient mesurés à l’aide d’une règle à coulisse, puis comparés aux valeurs critiques de l’antibiotique et interprétés suivant les recommandations du CLSI et du CASFM 2011. Les souches étaient catégorisées sensibles (S), intermédiaires (I) ou résistantes (R).

Epsilometer- test

La bandelette E-test consiste en une bande en plastique non poreuse calibré par un gradient pré-établi de concentration d’antibiotiques couvrant 15 dilutions pour déterminer la CMI en µg/ml d’une souche bactérienne à tester en milieu gélosé.

Technique

L’inoculum était préparé à partir d’une suspension d’une colonie obtenue à partir d’une culture jeune de 18 à 24heures. La suspension était ajustée à 0,5Mac Farland.
Le choix des milieux utilisés pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques ont était fonction des exigences de chaque espèce bactérienne : gélose MH + 5% de sang de mouton pour Streptococcus pneumoniae gélose polyvitex pour Moraxella catarrhalis
L’ensemencement était fait par écouvillonnage en diluant au préalable la suspension de l’inoculum au 1/10.
Les bandelettes E-test étaient ensuite déposées à la surface de la gélose à l’aide d’un applicateur.
La lecture était faite après 18 à 24 heures d’incubation à 35 -37°C en atmosphère anaérobie (5%de CO 2).

Contrôles des milieux de culture

Deux contrôles étaient réalisés : la stérilité et la fertilité des milieux de culture Contrôle de stérilité
Le contrôle de stérilité consistait à incuber à l’étuve un échantillon des milieux de culture préparés non ensemencé. Si au bout de 24 heures d’incubation il n’y a pas pousse d’une quelconque bactérie, les milieux étaient considérés stériles.

Contrôle de fertilité

Ce contrôle de fertilité consistait à ensemencer un échantillon des milieux de culture préparés avec une souche de référence. Les milieux préparés sont dits fertiles si au bout de 24 heures d’incubation à l’étuve des colonies de la soucheensemencée poussent sur la boite de culture.

Contrôles des disques et bandelettes d’ATB

Il s’agissait de contrôler la qualité des disques d’antibiotiques et des bandelettes E-test. Les normes CLSI étaient utilisées pour conserver correctement les souches de contrôle ATCC (American Type Culture Collection)
Les souches de contrôle de qualité utilisées étaient les suivantes : Enterococcus faecalisATCC 29212 Streptococcus pneumoniaeATCC 49619 Haemophilus influenzaeATCC 49247.

Staphylococcus aureus (n=2)

Une souche de Staphylococcus aureus était résistante à l’Oxacilline et à la Céfoxitine définie comme une SARM ou Méti-R. Elle était également résistante aux Aminosides (Gentamicine et Tobramycine) et aux Fluoroquinolones (Ciprofloxacine et Lévofloxacine). La souche SASM (Staphylococcus aureus sensible à la Méthicilline) était résistante à la Spiramycine.

Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. ANATOMIE DE L’APPAREIL RESPIRATOIRE
I.1- Voies respiratoires supérieures (hautes)
I.2 – Voies respiratoires inférieures (basses)
II. PRINCIPALES INFECTIONS RESPIRATOIRES
II.1- Infections respiratoires hautes
II.2 – Infections respiratoires basses
III. ETIOLOGIES DES INFECTIONS RESPIRATOIRES
III.1 – Les principaux virus
III.2 – Les bactéries typiques
III.3 – Les bactéries atypiques
III.4 – Les champignons
IV. RESISTANCE BACTERIENNE AUX ANTIBIOTIQUES
IV.1- L’antibiorésistance
IV.2- Résistance aux antibiotiques des germes typiques
IV.2.1 – Streptococcus pneumoniae
IV.2.2 – Moraxella catarrhalis
IV.2.3 – Haemophilus influenzae
IV.2.4 – Pseudomonas aeruginosa
IV.2.5 –Entérobactéries
IV.2.6 – Staphylococcus aureus
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. CADRE DE L’ETUDE
II. OBJECTIFS
III. MATERIELS ET METHODES
III.1 – Matériels et réactifs
III.2 –Méthodologie
III.2.1 – Population d’étude
III.2.2 –Démarche diagnostic
III.2.3 – Etude de la sensibilité aux antibiotiques
III.2.4 – Contrôles de qualités
III.3 – Exploitation des résultats
IV. RESULTATS
IV.1 –Prélèvements
IV.2 – Souches bactériennes isolées
IV.3 – Sensibilités aux antibiotiques
IV.3.1- Klebsiella pneumoniae
IV.3.2 – Streptococcus pneumoniae
IV.3.3 – Pseudomonas aeruginosa
IV.3.4 – Haemophilus influenzae
IV.3.5 – Moraxella catarrhalis
IV.3.6 – Staphylococcus aureus
V. DISCUSSIONS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Lire le rapport complet