Réponses de l’organisme face a un stress

LA VARIABILITE PHENOTYPIQUE DE L’AXE CORTICOTROPE EST EN PARTIE D’ORIGINE GENETIQUE

Chez l’homme:
L’utilisation de marqueurs génétiques a permis d’établir des « pedigrees » humains et la cartographie génétique de 400 maladies mendéliennes (Lander et Schork, 1994).

Analyse de liaisons

Elle consiste à rechercher le mode de transmission d’un trait dans un pedigree. Cette approche est particulièrement adaptée à la recherche des gènes responsables de maladies mendéliennes (transmission simple).

Méthode des allèles partagés

Cette approche mesure la probabilité de liaison d’un allèle au sein de familles d’individus malades : les patients apparentés héritent-ils plus souvent d’une région chromosomique (« région Identical-By-Descent ») que lors d’une transmission aléatoire (mendelienne). Cette méthode est applicable à la recherche de gènes responsables de traits qualitatifs mais également quantitatifs (Haseman et Elston, 1972) : la similarité phénotypique existant entre deux parents peut être corrélée au nombre d’allèles partagés au niveau du locus supposé causal.

Etudes d’associations

Ces études comparent des groupes de malades (et non des familles comme précédemment) à des groupes contrôles, et testent si un allèle apparaît à une fréquence plus élevée chez les individus malades que chez les sains. Elles peuvent cependant mettre en évidence de faux positifs qui co-ségrègeraient avec les véritables allèles en cause, ou qui seraient particuliers à une sous-population humaine à l’histoire et donc au génome différents.
Exemples : le polymorphisme d’un marqueur microsatellite mitoyen du gène 11β-Hsd2 est associé à l’hypertension provoquée par l’ingestion de sel chez l’homme (Lovati et al., 1999). Un dysfonctionnement de l’enzyme 11β-HSD2 provoque une hyperactivation du MR par le cortisol et donc une hypernatrémie, une hypokaliémie et une hypertension artérielle, d’autant plus marquées que l’apport exogène de sel est élevé.
Geller et al. (2000) mettent en évidence une mutation ponctuelle du domaine de liaison au ligand du MR (sérine=>leucine au niveau du codon 810) qui induit une activation constitutive du MR, associée à une hypertension artérielle modérée à l’état basal, mais fortement aggravée lors d’une grossesse chez la femme. Ces auteurs montrent que la progestérone, normalement antagoniste du MR, devient agoniste lorsque le récepteur est muté.

Conclusion
La recherche des bases génétiques des variabilités interindividuelles de fonctionnement d’un système, comme par exemple l’axe corticotrope, est difficile du fait du caractère polygénique de cette variabilité, qui se combine au caractère polyfonctionnel de chacun des gènes impliqués. Le polymorphisme génétique des populations humaines étant très important (Sachidanandam, 2001), l’utilisation de modèles animaux spécifiquement sélectionnés sur la base des différences de fonctionnement de leur axe corticotrope simplifie de façon appréciable l’étude.
Chez l’animal:

Recherche de locus de traits quantitatifs:
L’étude de QTL (Quantitative Trait Locus) associe par cartographie génétique une ou plusieurs régions génomiques à la variation d’un trait phénotypique (Lander et Schork, 1994, Weeks et Lathrop, 1995). La cartographie est réalisée à l’aide de microsatellites. Ces séquences sont souvent très polymorphes entre souches ou lignées animales et peuvent donc être utilisées pour caractériser la souche d’appartenance d’un allèle. On désigne généralement les marqueurs microsatellites par D-numéro du chromosome-Rat-numéro du marqueur.

L’importance du phénotypage

Le phénotypage est sans doute l’étape la plus importante lors d’une exploration génétique. Les mesures endocriniennes classiquement menées afin de caractériser le fonctionnement de l’axe corticotrope de souches de rats sont effectuées généralement en poststress ou après des tests au CRF ou à l’ACTH. Ces mesures sont certes intéressantes, mais les données obtenues sont difficilement exploitables compte tenu de la complexité des mécanismes et de la régulation mutuelle des MR, des GR, de la CBG et de la sécrétion de corticostéroïdes. Afin d’identifier les différences fonctionnelles caractérisant l’axe corticotrope entre deux souches de rats ou de souris, les mesures neuroendocriniennes peuvent être réalisées après surrénalectomie (ADX) à long terme, avec et sans traitement chronique à dose fixe de corticostérone ou de ligands spécifiques des MR/GR. L’étude des effets d’une ADX est largement répandue dans le milieu scientifique car elle permet aux chercheurs de faire abstraction de toute régulation de l’axe corticotrope dépendante de la concentration de corticostéroïdes et donc d’analyser la structure « constitutionnelle » des différents intervenants de cet axe (Dallman et al., 1985, Spinedi et al., 1991). Un traitement à dose fixe à la corticostérone ou aux ligands spécifiques des récepteurs (déoxycorticostérone ou aldostérone pour le MR, dexaméthasone ou RU28362 pour le GR) permet de tester la sensibilité des différents étages de l’axe corticotrope au rétrocontrôle négatif exercé par les stéroïdes (libération de CRF, d’ACTH, densités de récepteurs,…), ou la sensibilité des tissus
cibles aux actions médiées par les MR (natriurèse, kaliurèse, volume urinaire, quantité d’eau bue, comportement…), ou les GR (poids corporel, glycémie, défenses immunitaires, comportement…). Cette stratégie a notamment permis à Redei et al. (1994) de mettre en évidence un dysfonctionnement du rétrocontrôle négatif exercé par les glucocorticoïdes chez les rats Wistar Kyoto.
Classiquement, deux souches consanguines de rats ou de souris, très différentes pour un phénotype, sont croisées afin de produire une population ségrégeante d’individus F2 (2ème génération de croisement, Figure 13), ou « backcross » (issus du croisement en retour des individus F1 avec les parents). Le génome de chaque individu est alors cartographié à l’aide des marqueurs génétiques qui identifient l’appartenance à l’un ou l’autre des parents de chacun de leurs allèles. Si les parents présentent des allèles polymorphes (A et B) au niveau d’un locus particulier, les individus F2 pourront être homozygotes (génotype AA ou BB) ou hétérozygotes (génotype AB) pour ce locus. Les individus issus d’un backcross ne pourront présenter que les génotypes AA et AB, ou BB et AB suivant le croisement en retour choisi.
Les chromosomes de chacun des individus F2, ou backcross, est ainsi passé au crible : test d’un microsatellite environ tous les 20 centiMorgan de sa séquence.
Si un trait phénotypique et un marqueur ont tendance à être hérités ensembles, le gène responsable du phénotype est proche génétiquement du marqueur. Les associations trait phénotypique / incidence d’un marqueur sont estimées à l’aide d’un calcul de lod score (logarithme de la probabilité de liaison entre un marqueur et le trait sur la probabilité de nonliaison).
Pour une étude de population F2, cette association sera considérée comme suggestive quand le lod score sera de l’ordre de 2.8, et significative quand le lod score sera supérieur à 4.3 (Lander et Kruglyak, 1995).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
I. REPONSES DE L’ORGANISME FACE A UN STRESS
A. Les réponses comportementales
B. Les réponses physiologiques
1. Le système orthosympathique
2. L’axe corticotrope
a. Organisation fonctionnelle de l’axe corticotrope
b. Les récepteurs aux corticostéroïdes
c. Rythme circadien
d. Activation de l’axe corticotrope
e. Le rétrocontrôle négatif
f. Rôle des corticostéroïdes
α. Les minéralocorticoïdes régulent essentiellement le métabolisme de l’eau et des électrolytes
β. Les glucocorticoïdes sont impliqués dans de nombreuses fonctions
g. Sensibilité tissulaire aux corticostéroïdes
CONCLUSION
II. LA VARIABILITE PHENOTYPIQUE DE L’AXE CORTICOTROPE EST EN PARTIE D’ORIGINE GENETIQUE
A. Chez l’homme
1. En situation basale
a. Mise en évidence de l’origine partiellement génétique de la variabilité interindividuelle de l’activité de l’axe corticotrope
b. Conséquences pathologiques de cette variabilité génétique de l’activité basale de l’axe corticotrope
α. Système immunitaire
β. Maladies psychiatriques
γ. Maladies métaboliques
2. En réponse à une stimulation
a. Variabilité interindividuelle de l’activation corticotrope en réponse à un stress ou à une stimulation et son origine partiellement génétique
b. Conséquences pathologiques de cette variabilité génétique de la réactivité de l’axe corticotrope
α. Système immunitaire
β. Hypertension
Conclusion
B. Chez l’animal d’expérience
1. L’origine partiellement génétique de la variabilité du fonctionnement de l’axe corticotrope a été montrée en comparant différentes souches ou lignées de souris et de rats.
2. Application à l’étude des modèles pathologiques du système immunitaire
Conclusion
C. Chez l’animal d’élevage
1. Mise en évidence de cette variabilité
2. Origine partiellement génétique de la variabilité de la réactivité6corticotrope aux stimulations 
3. Impacts économiques de ces variations d’activité / réactivité au stress de l’axe corticotrope
CONCLUSION
III. BASES MOLECULAIRES DE CETTE VARIABILITE D’ORIGINE GENETIQUE
A. Stratégie du gène candidat
1. Séquençage du gène
2. Etudes de polymorphisme
a. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism.
b. SNP : Single Nucleotide Polymorphism
B. Analyse de liaison génétique : dissection génétique de traits complexes
1. Les marqueurs génétiques
2. Chez l’homme
a. Analyse de liaisons
b. Méthode des allèles partagés
c. Etudes d’associations
Conclusion
3. Chez l’animal
a. Recherche de locus de traits quantitatifs
b. Génomique fonctionnelle
Conclusion
C. Approche « du gène au phénotype »
1. L’étude des effets d’un knock out (KO) chez l’animal
2. Alternatives aux études de KO
a. Mutagenèse insertionnelle
b. Transcrit « antisens »
c. Transgenèse additionnelle
CONCLUSION
IV. TRAVAIL DE RECHERCHE
A. Résultats antérieurs à cette thèse
1. Article 1 : Strain differences in corticosteroid receptor efficiencies and regulation in Brown Norway and Fischer 344 rats (Journal of Neuroendocrinology, 1999)
2. Article 2 : Is the mineralocorticoid receptor in Brown Norway rats constitutively active ? (Journal of Neuroendocrinology, 2000)
3. Article 3 : Effects of adrenalectomy and of mineralocorticoid receptor / glucocorticoid receptor ligands in female Brown Norway and Fischer 344 rats and F1 hybrids (Journal of Neuroendocrinology, 2002)
4. Article 4 : Excretion of electrolytes in Brown Norway and Fischer 344 rats : effects of adrenalectomy and of mineralocorticoid and glucocorticoid receptor ligands (Experimental Physiology, 2004)
B. Conséquences fonctionnelles d’une mutation dans la partie N-terminale du MR de BN. Article 5 : Gain of function mutation in the mineralocorticoid receptor of the Brown Norway rat (Journal of Biological Chemistry, 2004)
1. Matériel et méthode
a. Animaux
b. Séquençage de l’ADNc du MR
c. Phénotypage de la population F2 issue du croisement BN x F344
d. Génotypage de la population F2 BN x F344
e. Etude in vitro des conséquences fonctionnelles de la substitution Y73C du MR de BN
f. Rôle de la progestérone dans l’insensibilité des rats BN à l’ADX in vivo
g. Analyse des données
2. Résultats
a. Le séquençage révèle la substitution d’une tyrosine par une cystéine dans la partie N-terminale du MR de BN
b. Les rats F2 portant le locus MR issu de la souche BN sont partiellement protégés des effets délétères d’une ADX
c. Des QTL sur les chromosomes 4 et 19 influencent la sensibilité du Rat à l’ADX
d. La substitution Y73C augmente la réponse transactivationnelle du MR en réponse à l’aldostérone et à la progestérone
e. Après castration, les rats BN deviennent sensibles aux effets d’une ADX
3. Discussion
4. Conclusion au travail de recherche
C. Perspectives
1. Séquençage d’un gène candidat positionnel : celui de la sous-unité α du canal sodique sensible à l’amiloride
2. Extension de l’étude à d’autres modèles animaux
3. Microdissection de la région du QTL de l’efficacité des GR (D1Rat256)
4. Application : étude de l’implication du locus MR et des autres QTL dans d’autres espèces animales
CONCLUSION GENERALE
ARTICLES SCIENTIFIQUES
Article 1
Article 2
Article 3
Article 4
Article 5
BIBLIOGRAPHIE

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