Regulation fonctionnelle des cellules natural killer par le recepteur activateur nkp46

Le système immunitaire est composé des cellules de l’immunité innée et adaptative. L’immunité innée représente la première barrière de défense contre les agressions. Les cellules composant le système immunitaire inné peuvent détecter la présence d’agents étrangers par différents mécanismes de reconnaissance impliquant les récepteurs PRR (Pattern Recognition Receptor), capables de détecter des motifs conservés parmi les micro-organismes appelés les PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns). La réponse innée est caractérisée par une réponse rapide et certaines cellules de l’immunité innée telles que les cellules présentatrices de l’antigène (CPA) sont capables d’activer les cellules du système adaptatif. La réponse immunitaire adaptative se met en place plus tardivement et est spécifique vis-à-vis du pathogène rencontré. Le système immunitaire adaptatif est composé des lymphocytes T et des lymphocytes B qui expriment des récepteurs de surface spécifiques de l’antigène. Ces récepteurs sont codés par des réarrangements somatiques du locus V (D) J et correspondent aux TCR (T Cell Receptor) exprimés par les lymphocytes T et aux BCR (B Cell Receptor) sur les lymphocytes B.  Contrairement aux cellules immunitaires innées, les cellules T et B naïves doivent d’abord rencontrer leur antigène et être pré-activées par les cellules présentatrices de l’antigène pour exercer leurs fonctions effectrices. Après une phase d’expansion puis de contraction, une fraction des lymphocytes T et B spécifiques de l’antigène persiste, ce sont des lymphocytes mémoires. La mémoire immunologique permet une réponse adaptative plus rapide et plus efficace lors d’une nouvelle exposition avec le même pathogène. Les cellules Natural Killer (NK) font partie du système immunitaire inné. Initialement, elles ont été décrites comme de grands lymphocytes granuleux doués d’une activité cytotoxique spontanée contre des cellules tumorales (Kiessling et al., 1975). Ces effecteurs sont impliqués dans la lutte contre divers pathogènes intracellulaires mais sont aussi capables de reconnaitre les cellules stressées ou transformées tout en épargnant les cellules saines. Pour prévenir une rupture de la tolérance au soi, une telle activité nécessite la présence de mécanismes de régulation. Les mécanismes moléculaires permettant aux cellules NK de distinguer une cellule stressée d’une cellule saine reposent sur un équilibre dynamique résultant de l’intégration de signaux activateurs et inhibiteurs délivrés par leurs récepteurs de surface (Vivier et al., 2008). Les cellules NK activées vont lyser leurs cellules cibles via le relargage de granules lytiques et vont également sécréter des cytokines ainsi que des chimiokines (Vivier et al., 2008).

Développement et maturation des cellules NK

Le développement des cellules NK est initié dans le foie fœtal puis se déroule dans la moelle osseuse à partir de la naissance. Les cellules NK sont également présentes dans les organes lymphoïdes secondaires tels que la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques, le foie et les poumons. Le développement des cellules NK repose sur l’acquisition d’un répertoire NK diversifié, l’acquisition de la tolérance au soi et des fonctions effectrices des cellules NK. Une récente étude a identifié les cellules Pré-pro NK comme le stade de différenciation le plus précoce dans le développement des cellules NK. Belz et son équipe ont en effet montré que les cellules Id2+ Sca1+ CD127+ CD122- correspondent au stade le plus précoce engagé dans la voie du développement des cellules NK (Carotta et al., 2011). Les cellules Pré-pro NK se différencient ensuite en cellules NKP puis en NK immatures et NK matures. Les cellules NKP se caractérisent par l’expression de la chaîne commune b des récepteurs à l’IL-2 et à l’IL-15 (CD122) et par l’absence de marqueurs pour d’autres lignages  cellulaires (Lin- ). Les cellules NKP expriment également les récepteurs aux facteurs de croissance c-kit (récepteur du facteur de cellules souches SCF) et Flt3 (FMS-Like Tyrosine kinase 3), ainsi que des facteurs de transcription nécessaires au développement lymphoïde (PU.1, GATA-3, Id2 et Ets1). A ce stade, les cellules NKP ne sont pas cytotoxiques et ne produisent pas de cytokines (Colucci et al., 2003).

Plusieurs modèles de différenciation des cellules NK ont été proposés et reposent sur l’acquisition de différents marqueurs de surface. Les cellules NK immatures sont caractérisées par l’acquisition du récepteur NK1.1 puis par l’induction de molécules d’adhésion comme CD49b (ou DX5) et de différents récepteurs activateurs et inhibiteurs (CD94/NKG2A et Ly49) qui constituent les différentes étapes de maturation et conduisent au développement de cellules NK matures (Colucci et al., 2003). Hayakawa et Smyth ainsi que notre laboratoire avons montré que la maturation des cellules NK peut être subdivisée en 4 étapes: CD11blowCD27low _ CD11blowCD27high _ CD11bhighCD27high _ CD11bhighCD27low (Chiossone et al., 2009; Hayakawa et al., 2006).

Une des limitations majeures de ces classifications réside toutefois dans l’utilisation de marqueurs présents chez la souris mais qui ne sont pas conservés chez l’homme (par exemple DX5 et NK1.1). Une nouvelle classification des différents stades de maturation des cellules NK de souris basée sur l’acquisition de marqueurs stables et conservés entre l’homme et la souris sera présentée et développée dans la première partie de mémoire (Partie 1, p.45).

Fonctions effectrices des cellules NK

Les cellules NK sont essentiellement connues pour leur fonction cytotoxique mais outre cette fonction, elles sont également capables de réguler la réponse immune par le biais de leur production de cytokines/chimiokines et de leur interaction avec les cellules dendritiques et les lymphocytes T effecteurs.

Mécanismes de cytotoxicité

La reconnaissance de cellules stressées et/ou infectées par les cellules NK conduit à l’activation des cellules NK et à leur dégranulation, phénomène appelé cytotoxicité naturelle. Les cellules NK reconnaissent également des cellules opsonisées par des anticorps comme notamment les IgG via le récepteur CD16 ce qui entraine la dégranulation et la lyse de la cellule cible par ADCC (Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity). Outre la voie dépendante de l’exocytose des granules, une autre voie faisant intervenir les interactions entre les récepteurs de mort de la famille du TNF (Tumor Necrosis Factor) et leurs ligands conduit à l’apoptose de la cellule cible. Par cette fonction cytotoxique, les cellules NK jouent un rôle primordial dans l’immunosurveillance des tumeurs et le contrôle de certaines infections microbiennes.

Exocytose des granules lytiques :
La reconnaissance des cellules stressées par les cellules NK conduit à la mort par apoptose de la cellule cible par l’action des différentes molécules lytiques qui sont libérées par la cellule NK et internalisées par la cellule cible. Le mécanisme de cytotoxicité correspond à l’éxocytose de granules lytiques contenant de nombreuses molécules telles que la perforine (molécules de perméabilisation membranaire), les granzymes (sérines protéase) et la granulisine (molécules lytiques antimicrobiennes). La protéine LAMP1 (« LysosomalAssociated Membrane Protein 1 » ou CD107a) est un marqueur témoin des activités cytotoxiques des cellules NK car cette glycoprotéine transmembranaire est contenue à l’intérieur des granules lytiques et se retrouve à la surface membranaire des cellules NK après le processus de dégranulation (Alter et al., 2004).

La voie des récepteurs de mort
Des mécanismes alternatifs sont également utilisés par les cellules NK pour induire la mort de leurs cibles. Ils dépendent des molécules de la famille du TNF telles que le TNF-a, TRAIL  (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) et FASL (FAS ligand), exprimées par les cellules NK, et de leurs récepteurs respectifs TNF-R, FAS et TRAIL-R exprimés par les cellules cibles. Ces récepteurs font partie de la super famille des récepteurs aux TNF (TNF-R) comportant dans leur partie intra-cytoplasmique des domaines de mort (« death domain »). L’engagement de ces récepteurs entraine l’activation de caspases qui induisent l’apoptose des cellules. Les cellules NK expriment constitutivement la protéine FAS-L (Arase et al., 1995) alors que la protéine TRAIL est seulement exprimée à la surface sur les cellules NK activées hormis une sous-population particulière de cellules NK dans le foie (Kayagaki et al., 1999; Takeda et al., 2005). A la différence des ligands FASL et TRAIL, le TNF-a est une cytokine sécrétée par les cellules NK activées.

Table des matières

INTRODUCTION
I- Généralités
II- Développement et maturation des cellules NK
III- Fonctions effectrices des cellules NK
1- Mécanismes de cytotoxicité
1.1- Exocytose de granules lytiques
1.2- Voies des récepteurs de mort
2- Production de cytokines et de chimiokines
IV- Mécanismes de reconnaissance
1- Les récepteurs inhibiteurs
1.1- les récepteurs KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptor)
1.2- Les récepteurs apparentés aux lectines de type C
1.2.1- Famille Ly49
1.2.2- Récepteur CD94/NKG2
1.3- Les récepteurs reconnaissant les molécules indépendantes du CMH-I
1.4- Signalisation des récepteurs inhibiteurs
2- Les récepteurs activateurs
2.1- Les récepteurs de types KIR et Ly49
2.2- NKG2D
2.3- CD16
2.4- Les récepteurs de cytotoxicité naturelle (NCR)
2.5- Les autres récepteurs activateurs
2.6- Signalisation des récepteurs activateurs
V- Education et tolérance des cellules NK
1- Mécanismes d’éducation par les molécules du CMH de classe I
1.1- Hypothèse initiale de la reconnaissance du soi manquant
1.2- Théories actuelles de l’éducation des cellules NK
a) le modèle « arming »
b) le modèle « disarming »
c) le modèle du rhéostat
2- Mécanismes d’éducation par les récepteurs activateurs
3- Plasticité de la réactivité des cellules NK
VI- « Priming » des cellules NK
VII- Rôles biologiques des cellules NK
1- Activité antitumorale
2- Activité antivirale
3- Rôles des cellules NK dans la mise en place de la réponse immune
MATERIELS ET METHODES
I- Matériels
1- Lignées de souris
1.1- Génération de la souris NKp46iCre Knock In
1.2- Croisements des souris NKp46iCre
1.3- Génération des souris Noé par mutagénèse aléatoire
1.4- Autres lignées de souris
2- Outils utilisés pour la cytométrie de flux
3- Toxine Diphtérique
4- Souches de pathogènes
5- Cytokines destinées aux activations cellulaires in vitro
II- Procédures expérimentales
1- Préparation des cellules
2- Stimulation in vitro des cellules NK
3- Marquages phénotypiques de surface et marquages intracellulaires
4- Génération et stimulation des cellules NK in vitro activées par l’IL-2 : Obtention de Lymphokine Activated Killer (LAK)
4.1- Génération des LAK
4.2- Stimulation in vitro des LAK
5- Enrichissement des cellules NK à partir de suspensions cellulaires
6- Différenciation in vitro des progéniteurs NK (NKP)
7- Marquage par immunofluorescence sur coupe de tissus
8- Traitement des souris avec la toxine Diphtérique
9- Co-culture des cellules NK et des cellules dendritiques CD11c+
10- Stimulation in vitro des lymphocytes T
11- Génération des chimères de moelle osseuse
12- Infection MCMV et titration du virus
13- Infection Lm-OVA et titration de la bactérie
14- Infection par le virus Influenza
15- Activités effectrices des cellules NK pendant les infections MCMV, H1N1 et Lm-OVA
16- Traitement des souris avec l’anticorps anti-NKp46 in vivo
17- Séquençage
18- Modélisation bio-informatique de la protéine NKp46 W32R
19- Transfection de lignées et test de détection de l’expression de la protéine NKp46W32R
20- Analyse transcriptomique
21- Génération des lentivirus shRNA d’Hélios
22- Transduction des LAK par les shRNA d’Hélios
23- Analyses statistiques
RESULTATS
Partie 1 : Génération et caractérisation d’une nouvelle lignée de souris NKp46iCre Knock-In
I- Présentation et objectifs des travaux
II- Résultats
1- Caractérisation de la souris NKp46iCre
1.1- Caractérisation de l’expression et de la fonctionnalité du récepteur NKp46
1.2- Caractérisation de l’expression et de la spécificité de l’iCre
2- Un modèle de différenciation des cellules NK commun à l’homme et à la souris
2.1- NKp46 : check point dans la maturation des cellules NK
2.2- CD16
3- Identification de sous-populations cellulaires NKp46+
3.1- Les cellules NKp46+ de l’intestin
3.2- Les cellules NKp46+ du foie
Partie 2 : Etude de de la régulation fonctionnelle des cellules NK
I- Présentation et objectifs des travaux
II- Résultats
1- Identification et caractérisation d’un mutant obtenu par mutagénèse aléatoire : La souris Noé
1.1- Hyperréactivité des cellules NK in vitro
1.2- Le phénotype Noé est intrinsèque aux cellules NK
1.3- Hyperréactivité des cellules NK des souris Noé in vivo
1.4- Séquençage du génome et identification de la mutation W32R dans le gène NCR1
2- L’absence d’expression de NKp46 est responsable du phénotype d’hyper-réactif des cellules NK des souris Noé
2.1- La complémentation génétique de la protéine NKp46 humaine restaure la réactivité des cellules NK
2.2- Validation du rôle de NKp46 dans l’hyperréactivité des cellules NK dans le modèle de souris NKp46iCre
2.3- Hyperréactivité des cellules NK dans un autre modèle d’infection virale
3- Mécanismes moléculaires impliqués dans régulation du seuil de réactivité des cellules NK via NKp46 : down-régulation du facteur de transcription Hélios
3.1- Mise en évidence du rôle d’Hélios
3.2- Expression d’Hélios dans les souris Ncr1Noe/Noé et Ncr1iCre/iCre
4- Rôle immunorégulateur des cellules NK sur la réponse immunitaire adaptative
4.1- Impact sur la réponse adaptative primaire antivirale
4.2- Impact sur la réponse adaptative mémoire
5- Manipulation de la réactivité des cellules NK via le récepteur NKp
5.1- Le blocage du récepteur NKp46 in vivo permet de programmer des cellules NK
hyper-réactives
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Partie 1 : Génération et caractérisation d’une nouvelle lignée de souris NKp46iCre Knock-In
Partie 2 : Etude de de la régulation fonctionnelle des cellules NK
1- Régulation du seuil d’activation des cellules NK via NKp46
2- Implication du facteur de transcription Hélios dans la calibration de la réactivité des cellules NK
3- Un rôle immunorégulateur des cellules NK
4- Manipulation de la réactivité des cellules NK et reprogrammation des cellules NK sauvages
CONCLUSION

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