Soutenance mémoire
Régulation des protéines des centres réactionnels par la lumière
Chez les eucaryotes, les protéines constituant les CR des deux photosystèmes sont codées au niveau des chloroplastes (Grossman et al. 1995). Comme tous les gènes chloroplastiques, les gènes codant pour les CR semblent transcrits à des taux relativement constants en lumière continue et le niveau d’accumulation des transcrits est semblable quelle que soit l’intensité lumineuse (Bruick and Mayfield 1999, Green and Salter 1996, Herrmann et al. 1992, Mayfield et al. 1995). Cependant, une augmentation du flux de photons provoque une induction à très court terme de la traduction des ARNm. En effet, le facteur prépondérant affectant l’accumulation des protéines chloroplastiques semble être la synthèse protéique en elle -même. La traduction d’ARNm spécifiques peut être par exemple accrue d’un facteur 100 durant la biogenèse des chloroplastes induite par la lumière (Gillham et al. 1994). Bien que le processus de traduction comporte des similitudes entre les chloroplastes et les procaryotes (fort degré d’homologie des ARNs ribosomaux, similitude du motif Shine Delgarno), il existe aussi des différences importantes qui font que le mode de contrôle de la régulation de la traduction est certainement différent (Mayfield et al. 1995). En particulier, il a été démontré à plusieurs reprises que des produits codés par le génome nucléaire s’associent spécifiquement avec des ARNm chloroplastiques et interviennent dans la régulation de la traduction en interagissant avec la 5′- UTR de ces ARNm (Bruick and Mayfield 1999, Mayfield et al. 1995, Rochaix 1992).
Chez les procaryotes, la possibilité de transformer certaines souches de cyanobactéries (Synechocystis PCC 6803 et Synechococcus PCC 7942) a permis une avancée considérable dans l’étude des mécanismes de régulation de l’expression des gènes photosynthétiques vis à vis de la lumière. En effet, la construction de gènes rapporteur fusionnés avec le promoteur du gène à étudier permet de mesurer aisément l’expression de différents gènes photosynthétiques en fonction des conditions environnementales. Ainsi, plusieurs groupes ont rapporté que l’expression des gènes psbA était variable en fonction de l’intensité lumineuse chez les cyanobactéries (Bouyoud et al. 1993, Lönneborg et al. 1988, Mohamed et al. 1993). En particulier, l’équipe de S. Golden a observé que les copies du gène psbA étaient différentiellement affectées par la lumière chez Synechococcus PCC 7942. L’expression de psbAI est inversement reliée à l’intensité de la lumière alors que les niveaux d’accumulation des transcrits de psbAII et psbAIII augmentent en fonction de l’intensité lumineuse (Fig. 16 ; Bustos et al. 1990, Schaefer and Golden 1989a).
L’utilisation d’inhibiteurs de transcription et de traduction a permis de montrer un contrôle transcriptionnel de l’induction de psbAII et psbAIII à forte lumière, alors que la synthèse rapide d’un facteur permettrait d’accélérer la dégradation du transcrit psbAI lorsque les cellules sont placées en haute lumière (Kulkarni et al. 1992). De plus, le transcrit psbAIII subirait aussi un contrôle posttranscriptionnel de par la synthèse d’un facteur de dégradation de ce messager (Kulkarni et al. 1992).
D’un point de vue fonctionnel, les trois copies du gène psbA codent pour deux formes différentes de la protéine D1 (Golden et al. 1986, Schaefer and Golden 1989b). Une forte augmentation de l’intensité lumineuse se fera donc en faveur de la forme II de la protéine D1 issue de la transcription des messagers psbAII et psbAIII (Bustos et al. 1990). La prédominance de cette forme de protéine semble donc primordiale pour la croissance des cyanobactéries à forte intensité lumineuse (Golden 1994).
L’un des membres de la famille psbD de Synechococcus PCC 7942 (codant D2) présente aussi des variations de l’expression en fonction de l’intensité lumineuse. Des expériences de fusion d’un gène rapporteur avec les promoteurs des gènes psbDI, psbC et psbDII ont montré que seul psbDII répondait à une augmentation de l’intensité lumineuse. Cette réaction se manifeste par une rapide augmentation de l’expression du gène psbDII ainsi que de la quantité de la protéine D2 (Bustos and Golden 1992). Les séquences d’acides aminés de D2 prédites à partir des gènes psbDI et psbDII étant identiques, l’induction de psbDII à forte intensité lumineuse ne modifie donc certainement pas la composition qualitative du PS II (Bustos and Golden 1992). Cependant, l’induction de ce gène chez les souches sauvages permet de maintenir la synthèse de protéine D2 à un niveau suffisant sous des conditions de forte luminosité (Bustos and Golden 1992) .
De par les variations de leur expression en fonction de l’intensité lumineuse, la famille des gènes psbA/psbD offre donc la possibilité d’altérer de façon importante la composition qualitative du PS II chez les cyanobactéries. Les modifications de l’expression de ces gènes ont pour conséquence une augmentation de la quantité de messagers codant pour les polypeptides D1 et D2 à forte lumière (Bustos and Golden 1992). Ces réactions sont en accord avec le turnover accéléré de ces polypeptides dans les mêmes conditions chez les chloroplastes (Matto et al. 1984, Virgin et al. 1988). La régulation de la synthèse et du turnover de D1 semble faire partie d’un système de réparation qui permettrait le remplacement rapide des CR endommagés par un excès de lumière (Andersson and Barber 1996, Barber and Anderson 1992, Campbell et al. 1998, Ohad et al. 1984, Oquist et al. 1995). Ce phénomène de photoprotection semble particulièrement important chez les cyanobactéries, qui ne possèdent pas de mécanisme par l’intermédiaire des antennes permettant de dissiper l’énergie excessive sous forme de chaleur (Oquist et al. 1995).
Régulation des protéines d’antenne par la lumière
En général les gènes Lhcs, codés au niveau nucléaire chez les eucaryotes, sont fortement régulés par la lumière à la fois au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel (Green and Salter 1996, Grossman et al. 1995, Silverstone and Tobin 1987, Thompson and White 1991, Tobin and Silverstone 1985). Chez la plupart des espèces étudiées, le niveau des ARNm des différents gènes Lhc augmente avec l’intensité lumineuse. Cependant la réponse à la lumière du niveau de transcrit est spécifique des cellules, des tissus et du stade de développement des chloroplastes (White et al. 1992).
Il semble que cette augmentation du taux des ARNm de Lhc soit le résultat d’une augmentation du niveau de transcription plutôt que d’un changement dans la stabilité des transcrits (Marrs and Kaufman 1989, Mösinger et al. 1985, Sylversthorne and Tobin 1984, Warpeha and Kaufman 1990, Warpeha et al. 1989). Par ailleurs, le niveau d’accumulation des protéines Lhc est seulement partiellement déterminé par le niveau d’ARNm (Mathis and Burkey 1987). Il semble que le second facteur primordial soit la stabilité des protéines (Burgess and Taylor 1987, Burgess and Taylor 1988, Mayfield and Taylor 1984, Oelmüller and Mohr 1986). Celle-ci est elle même étroitement liée à la disponibilité en molécules de Chl et à l’intégration des protéines à la membrane thylacoïdale, qui influencent ainsi le niveau de transcription de plusieurs gènes photosynthétiques (Thompson and White 1991).
Expression des protéines photosynthétiques en lumière jour-nuit
La capacité à anticiper les événements à venir, et en particulier les changements répétitifs avec une périodicité de 24 h, est apparemment avantageuse pour survivre dans l’environnement naturel, puisque les mécanismes qui permettent à ces organismes de prédire ces changements sont conservés au cours de l’évolution (Piechulla 1999). En effet, plusieurs rapports récents ont montré que les cyanobactéries régulaient également certains processus cellulaires par des stimulateurs circadiens, alors que l’on pensait que ce mécanisme était présent uniquement chez les eucaryotes (Chen et al. 1991, Huang et al. 1990, Kondo and Ishiura 1999, Kondo et al. 1993, Mitsui et al. 1986). La photosynthèse nécessite un contrôle endogène journalier précis, de façon à optimiser en permanence l’efficacité de l’appareil photosynthétique (Piechulla 1999).
Ainsi, de nombreux gènes codant pour des protéines thylacoïdales sont sujets à des fluctuations régulières jour-nuit du point de vue de leur niveau de transcrits, bien que cela n’implique pas forcément une fluctuation des niveaux des protéines in vivo (Oelmüller et al. 1995, Piechulla et al. 1998). Ces gènes soumis à un contrôle circadien comprennent les gènes codant pour les protéines des antennes mineures et majeures (Lhca et Lhcb), des gènes codant pour des protéines de stress telles que les ELIP, et les gènes codant pour les protéines extrinsèques du PS I et du PS II (Adamska et al. 1991, Kay 1993, Kay and Millar 1993, Oelmüller et al. 1995, Piechulla 1993). Dans le cas des Lhc, ces oscillations circadiennes de l’accumulation des transcrits semblent contrôlées essentiellement au niveau de la transcription (Hwang and Herrin 1994, Millar and Kay 1991, Piechulla 1993, Taylor 1989), alors que la stabilité des ARNm ne jouerait qu’un rôle mineur (Hwang and Herrin 1994). En général, il semble que les niveaux des ARNm codant pour des protéines appartenant au même complexe multi-protéique oscillent en parallèle et présentent un maximum spécifique de complexe (Oelmüller et al. 1995). En particulier, les ARNm des protéines du PS I apparaissent avant ceux des polypeptides du PS II, eux même précédant les ARNm des trois polypeptides constituant lescomplexes-évoluant-oxygène (Oelmüller et al. 1995).
|
Table des matières
CHAPITRE I : INTRODUCTION
I- LES PROTEINES DE L’APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE LIANT LA CHLOROPHYLLE
I.1- PHOTOSYNTHESE OXYGENIQUE
I.2- LA PIGMENTATION DE L’APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE
I.3- PROTEINES PIGMENTAIRES DE L’APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE
I.3.1- Les complexes du centre
I.3.1.1- Le complexe du centre du photosystème II
Le centre réactionnel du PS II (D1/D2) : CR II
CP47 et CP43
CP43′ (IsiA)
I.3.1.2- Le centre réactionnel du PS I (PsaA/ PsaB) : CR I
I.3.2- Les complexes antennaires
I.3.2.1- Les phycobilisomes des cyanobactéries et des algues rouges
I.3.2.2- Les protéines à Chl a/b des plantes supérieures
Antenne collectrice associée au PS II
Antenne collectrice associée au PS I
I.3.2.3- Les antennes collectrices procaryotiques à Chl a/b
I.3.2.4- Les antennes collectrices des algues
Les algues à Chl a/b
Les algues à Chl a et phycobiliprotéines (Rhodophyta)
Les Algues à Chl a/c
I.3.2.5- Protéines apparentées aux Lhc
Protéines induites par le stress (ELIP, HLIP)
Gènes putatifs présentant des homologies avec les Lhcs
I.4- ADAPTATION AUX VARIATIONS LUMINEUSES
I.4.1- Adaptation à court terme
I.4.1.1- Transition Etat1-Etat2
I.4.1.2- Le cycle des xanthophylles
I.4.1.3- Agrégation de l’antenne LHC II
I.4.2- Adaptation à long terme
I.4.2.1- Réponses physiologiques à la lumière
I.4.2.2- Réponses moléculaires à la lumière
Régulation des protéines des centres réactionnels par la lumière
Régulation des protéines d’antenne par la lumière
Expression des protéines photosynthétiques en lumière jour-nuit
II- PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, PROCHLOROCOCCUS
II.1- MISE EN EVIDENCE DE PROCHLOROCOCCUS ET POSITION PHYLOGENETIQUE
II.1.1- Découverte de Prochlorococcus
II.1.2- Position phylogénétique par rapport aux cyanobactéries typiques
II.2- PARTICULARITES CELLULAIRES
II.2.1- Ultrastructure
II.2.2- Taille du génome et composition en bases
II.3- CARACTERISTIQUES PHOTOSYNTHETIQUES
II.3.1- Composition pigmentaire
II.3.1.1- Chlorophylle
II.3.1.2- Caroténoïdes
II.3.1.3- Phycoérythrine
II.3.2- Photoacclimatation et photoadaptation
II.3.3- Caractérisation de l’appareil photosynthétique
II.4- DISTRIBUTION OCEANIQUE DE PROCHLOROCOCCUS
II.5- DIVERSITE GENETIQUE DE PROCHLOROCOCCUS
II.5.1- Diversité des souches de Prochlorococcus en culture
II.5.2- Diversité des populations naturelles de Prochlorococcus
III- DEMARCHE ADOPTEE AU COURS DE CE TRAVAIL DE THESE
IV- LISTE DE PUBLICATION EFFECTUEES PENDANT LA THESE
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
I- DESCRIPTION ET CULTURE DES SOUCHES DISPONIBLES AU LABORATOIRE
I.1- SOUCHES CULTIVEES A LA STATION BIOLOGIQUE DE ROSCOFF
I.2- METHODES DE CULTURE
II- METHODE DE CARACTERISATION DES COMPLEXES PIGMENTS-PROTEINES
II.1- METHODE D’ISOLEMENT ET DE CARA CTERISATION DU PHOTOSYSTEME I
II.1.1- Extraction des thylacoïdes
II.1.2 – Isolement du photosystème I
II.1.2.1- Solubilisation des thylacoïdes
II.1.2.2- Séparation des complexes Chl-protéines
Séparation des complexes Chl-protéines sur gel non dénaturant
Isolement des complexes protéiques par gradient de saccharose
II.1.3- Analyse du photosystème I
II.3.1.1- Analyse de la composition protéique du PS I sur gel d’électrophorèse
II.3.1.2- Détection immunologique
II.3.1.3- Caractérisation des fractions enrichies en PS I
Spectrofluorimétrie
Spectrophotométrie
Chromatographie liquide à haute pression (HPLC)
Microscopie électronique
III- OUTILS MOLECULAIRES
III.1- TECHNIQUES D’EXTRACTION DES ACIDES NUCLEIQUES
III.1.1- Extraction de l’ADN total
III.1.2- Extraction d’ADN plasmidique à l’aide du kit « Flexiprep »
III.1.3- Extraction des ARN totaux
III.1.4- Extraction de l’ADN bicaténaire des bactériophages
III.2- AMPLIFICATION D’ADN PAR REACTION EN CHAINE DE LA POLYMERASE (P.C.R.)
III.3- ANALYSE DES ACIDES NUCLEIQUES
III.3.1- Analyse électrophorétique
III.3.1.1- Analyse de l’ADN sur gel d’agarose 0.8 %
III.3.1.2- Analyse de l’ADN sur gel de polyacrylamide
III.3.1.3- Analyse de l’ADN par electrophorèse en champs pulsé (PFGE)
III.3.1.4- Analyse des réactions de séquence sur gel de polyacrylamide 6%
III.3.1.5- Analyse des ARN sur gel d’agarose 1.5 % / formaldéhyde 4 % / MEN 1X
III.3.1.6- Purification de fragments d’ADN sur gel d’agarose avec le kit « Wizard » (Pharmacia Biotech)
III.4- TECHNIQUE D’HYBRIDATION DES ACIDES NUCLEIQUES
III.4.1- Marquage radioactif d’une sonde ADN par amorçage aléatoire (« Random Priming »)
III.4.2- Marquage radioactif d’une sonde ARN
III.4.3- Southern blot
III.4.4- Northern blot
III.4.5- Méthode de protection à la RNase (« R.P.A. »)
III.4.6- Criblage d’une banque phagique
III.4.6.1- Préparation de bactéries compétentes
III.4.6.2- Titrage de la banque de phages
III.4.6.3- Criblage de la banque de phages
III.5- SEQUENÇAGE
III.5.1- Clonage du produit de PCR
III.5.2- Réaction de séquence
III.6- ALIGNEMENT ET ANALYSE PHYLOGENETIQUE DE SEQUENCES
IV- ANALYSES STRUCTURALES DES SEQUENCES PROTEIQUES
IV.1- PRINCIPE DE L’ANALYSE DE GROUPES HYDROPHOBES (« HCA »)
IV.1.1- La représentation HCA
IV.1.2- Interprétation des diagrammes
IV.1.3- Intérêt de l’HCA dans l’alignement de séquences primaires
CHAPITRE III : LE PHOTOSYSTEME I
Article 1 : Isolation and characterization of the photosystem I from two strains of the marine oxychlorobacterium Prochlorococcus
CHAPITRE IV : L’ANTENNE MAJEURE A CHL A/B
Article 2 : Multiplication of antenna genes as a major adaptation to low light in a marine prokaryote
Article 3 : Expression and phylogeny of the multiple antenna genes of the low-light adapted Prochlorococcus strains CCMP1375
CHAPITRE V : CONCLUSION
