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Canaux Calciques Dépendants du Voltage a. Généralité et Classification
Les canaux calciques dépendants du voltage sont, comme leur nom l’indique, régulés par le potentiel membranaire. Ces canaux sont généralement fermés quand la membrane plasmique est polarisée et leur ouverture se produit lors de la dépolarisation membranaire surtout quand le potentiel membranaire atteint un certain seuil. Ces canaux se trouvent au niveau de la membrane de cellules excitables (cellules musculaires, cellules gliales et neurones), mais également au niveau des cellules insensibles aux signaux électriques comme les lymphocytes.
En se basant sur leur sensibilité à la dépolarisation membranaire, les canaux calciques dépendants du voltage ont été classifiés en 2 familles : les canaux à haut seuil activés par une forte dépolarisation (canaux de type-L, -N, -P/Q, -R) et les canaux à bas seuil activés par de plus faibles dépolarisations (canaux de type-T) (Bean 1985; Miller 1992; Catterall et al. 2005). Les canaux de type-L ont d’abord été décrits comme étant responsables du couplage excitation/contraction dans les muscles squelettiques et cardiaques, tandis que les canaux de type-T ont été impliqués dans l’activité ‘pacemaker’ cardiaque (De Waard et al. 1995; Scott et al. 1996). Les canaux de type -N, -P/Q et -R ont été mis en evidence dans le système nerveux central et périphérique où ils jouent un rôle dans le contrôle de la libération des neurotransmetteurs (De Waard et al. 1995; Scott et al. 1996).
En plus de cette caractéristique biophysique, les canaux calciques dépendants du voltage diffèrent également dans leur composition en sous-unités (Figure 2). Les canaux à haut seuil comprennent une sous-unité transmembranaire formant le canal nommée α1 (Cavα1), associée à un dimère α2δ (Cavα2δ), une sous-unité β intracellulaire (Cavβ) et une sous-unité transmembranaire supplémentaire nommée γ (Cavγ). Les canaux à bas seuil ne sont eux composés que de la sous-unité α1 (Catterall et al. 2005).
Composition
Sous-unité1
La sous-unité Cavα1 constitue le pore ionique ainsi que le senseur du voltage, qui transforme la dépolarisation en un influx calcique. Cette sous-unité est donc la principale parmi les différentes sous-unités des CCDVs. C’est une protéine de 190-250 kDa formée par 4 domaines homologues (I, II, III et IV), liées par des boucles cytoplasmiques (Figure 3). Chaque domaine contient six segments transmembranaires (S1-S6) qui composent deux domaines structuraux distincts, le domaine de détection du potentiel (‘VSD’ pour ‘voltage-sensing domain’) et le domaine formant le pore. Le premier domaine est formé par les quatre premiers segments (S1-S4) alors que le 2ème comprend les segments S5 et S6 reliés par une boucle (‘P-Loop’ pour ‘pore-forming loop’) qui rentre dans la membrane formant ainsi le pore. Ces 4 boucles forment un filtre ionique sélectif où 4 acides aminés négatifs fortement conservés (glutamate ou aspartate), provenant chacun d’une boucle déterminent la sélectivité et la perméabilité au Ca2+ (Kim et al. 1993; Kuo & Hess 1993; Sather & McCleskey 2003).
De cette manière Cav1 est considérée comme la sous-unité clé responsable des différents aspects pharmacologiques et biophysiques du canal tel que l’ouverture du pore, la sélectivité et le flux du calcium (Buraei & Yang 2010).
Il faut noter que la nomenclature du canal est basée sur la nature de la sous-unité α1 qui le forme (Tableau 1). Chez les mammifères, cette sous-unité est codée par 10 gènes distincts. En se basant sur la similitude dans la séquence d’acides aminés, trois grandes familles de sous-unités Cavα1 (Cav1, Cav2 et Cav3), chacune contenant plusieurs membres, ont été définies. La famille Cav1, correspondante aux canaux de type-L, est constituée de quatre membres nommés Cav1.1, Cav1.2, Cav1.3 et Cav1.4. Les trois membres de la famille Cav2 (Cav2.1, Cav2.2 et Cav2.3) correspondent aux canaux de type -P/Q, -N et -R respectivement. Les trois types de canaux Cav3 (Cav3.1, Cav3.2 et Cav3.3) correspondent aux canaux de type-T (Catterall et al. 2005; Catterall 2011). A cette sous-unité s’associent, sauf pour les canaux de type-T, les sous-unités auxiliaires β, α2δ et γ qui contrôlent l’assemblage, le ciblage et l’ancrage des canaux à la membrane cytoplasmique. Ces sous-unités auxiliaires modulent les paramètres biophysiques des CCDVs.
Sous-unité
Les CCDVs de type -L, -P/Q, -N et -R contiennent aussi une sous-unité cytoplasmique, la sous-unité. Cette sous-unité joue un rôle majeur dans la régulation du canal calcique et son adressage membranaire. Durant ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à cette sous-unité qui sera décrite de façon plus détaillée dans le chapitre II.
Sous-unité2
A ce jour là, quatre isoformes de cette sous-unité ont été identifiées (Tableau 2), correspondants à l’expression de quatre gènes differents et possédant plusieurs variants d’épissage. C’est une glycoprotéine membranaire formée par deux peptides (2 et), possédant une grande partie extracelulaire attachée à la membrane par le peptide δ. Ces deux peptides résultant du clivage d’un peptide correspondant à un ARNm unique, sont liés par un pont disulfure (Klugbauer et al. 1999; Qin et al. 2002). Le peptide est relié à la membrane plasmique par un linker (glycosylphosphatidylinositol) et maintien le peptide2 extracellulaire en place (Figure 4) (Davies et al. 2010) permettant son interaction avec la sous-unité1 (Gurnett et al. 1997). La région correspondante sur1 qui interagit avec2 se trouve dans le 3ème domaine. Concernant leurs fonctions, ces sous-unités peuvent modifier les propriétés biophysiques du canal, mais leur rôle principal est d’accroitre les courants en favorisant l’adressage des sous-unités1 vers la membrane plasmique et/ou de les maintenir à ce niveau (Buraei & Yang 2010).
Sous-unité
Huit différents gènes codent les différentes isoformes de la sous-unité (Tableau 2). Cette dernière est formée de 4 segments transmembranaires et d’extrémités N- et C- terminales intracellulaires (Figure 4) (Buraei & Yang 2010).
Le domaine d’interaction de la sous-unité γ avec Cavα1 a été localisé sur la première moitié N-terminale de la protéine (Arikkath & Campbell 2003). Trois fonctions cellulaires différentes ont été proposées pour les membres de la famille des sous-unités : a) régulation de l’expression et des fonctions des CCDVs; b) régulation de l’adressage, de la localisation et des propriétés biophysiques des récepteurs AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) et plus récemment; c) la régulation de l’agrégation cellulaire (Chen et al. 2007).
Parmi les huit sous-unités,1 et6 ont les effets les plus prononcés sur la densité du courant calcique porté pas la sous-unité α1 (Arikkath et al. 2003; Hansen et al. 2004).2,3, 4,8 et probablement7 agissent comme des protéines régulatrices du récepteurtransmembranaire AMPA (Kato et al. 2007). Plus récemment,2 a été impliquée dans les processus d’interactions intercellulaires. En effet, l’expression de cette sous-unité entraine l’aggregation des fibroblastes murins qui ne peuvent normalement pas former d’agrégats cellulaires (Price et al. 2005).
La régulation de l’expression génique par les CCDVs
L’idée suggérant l’implication des CCDVs dans la régulation génique n’est pas récente, elle remonte à une trentaine d’années. En effet, la première preuve provient de deux études simultanées publiées en 1986 (Greenberg et al. 1986; Morgan & Curran 1986).
La première étude montre que la dépolarisation chronique de cellules PC12 induit une augmentation du niveau d’expression du pro-oncogène c-fos. Le lien entre cet effet et les CCDVs a été établi par l’abolition de cet effet suite à l’utilisation d’un inhibiteur du canal de type-L « la nisoldipine », ainsi qu’en antagonisant la calmoduline par la trifluoropérazine ou la chlorpromazine. Il a été donc conclu que l’élévation de la [Ca2+]i médiée par les CCDVs de type-L active l’expression de c-fos dépendante de la calmoduline (Morgan & Curran 1986). La deuxième étude montre que, dans les cellules PC12, l’expression de c-fos induite par l’activation des récepteurs nicotiniques également résulte de l’activation des canaux de type-L, parce que cet effet est bloqué par le vérapamil, un autre inhibiteur des canaux de type-L (Greenberg et al. 1986).
A partir de ces études fondatrices, les canaux calciques voltage-dépendants ont été montrés comme étant impliqués dans le contrôle de l’expression de différents gènes.
Régulation des facteurs de transcription par les protéines fixant le Ca2+ mais non associées au CCDVs
CCDVs de type-L
La calmoduline « CaM » est une protéine ubiquitaire capable de se lier aux ions Ca2+ présents dans le milieu intracellulaire. Cette liaison induit un changement conformationnel de la protéine formant ainsi un complexe calcium-calmoduline (CaM-Ca2+) qui permet l’activation de nombreuses protéines y compris la protéine kinase Ca2+/calmoduline-dépendante (CaMK). Cette kinase est impliquée dans la phosphorylation des facteurs de transcription et, par conséquent, dans la régulation de l’expression des gènes. De ce fait, il n’était pas surprenant que l’entrée du Ca2+ via les canaux calciques de type-L induise l’activation de la CaMK dans les neurones hippocampiques (Bading et al. 1993) et que ce processus soit lié à l’activation du promoteur de c-fos. En effet CaMKI, CaMKII et CaMKIV partagent la capacité de phosphoryler le facteur de transcription CREB au niveau de la Ser133 (Chawla et al. 1998; Yokokura et al. 1997). Bien que la phosphorylation de CREB soit généralement considérée comme un événement favorisant son activation, la situation est apparemment plus complexe car CREB peut être également phosphorylé au niveau de la Ser142 par la CaMKII conduisant à son inhibition (Sun et al. 1994). La CaMKIV est considérée comme l’enzyme la plus efficace de stimulation de la voie CREB car elle permet le recrutement de la protéine de liaison à CREB (‘CBP’ pour ‘CREB Binding Protein’) au niveau de CREB (Figure 5) (Bito et al. 1996). Ces différentes données ont soulevé la question sur les mécanismes d’activation de la CaMK nucléaire par le Ca2+ entrant via les canaux de type-L.
Premièrement, l’accumulation nucléaire du complexe CaM-Ca2+ a été décrite comme cruciale pour l’activation des CaMKs. En effet, il a été suggéré que le Ca2+, entrant dans la cellule par les canaux de type-L, active la calmoduline qui se lie aux Ca2+ pour former le complexe CaM-Ca2+ qui s’accumule dans le noyau (Deisseroth et al. 1998; Mermelstein et al. 2001). Dans les neurones pyramidaux hippocampiques, la CaM nucléaire est détectée dans 15 secondes après la stimulation et précède la phosphorylation de CREB. L’élévation de la CaM nucléaire induite par la dépolarisation a également été observée dans les cellules granulaires du cervelet, les neurones du néocortex et les cellules granulaires du gyrus denté. Cette translocation nucléaire n’est pas bloquée par la rupture des filaments d’actine ou des microtubules ni par le vidage des stocks intracellulaires de Ca2+ par la thapsigargine. Par contre, la translocation nucléaire de CaM-Ca2+ est inhibée par la fusion de la CaM à un peptide de liaison (M13) qui prévient le complexe CaM-Ca2+ de former des interactions dépendantes du Ca2+. Ceci suggère que la translocation nucléaire de CaM-Ca2+ exige une ou plusieurs protéines endogènes pour la stabilisation du complexe ainsi que pour son transport nucléaire (Mermelstein et al. 2001).
D’autre part, il a été montré que la voie de signalisation CREB, sous entendu l’activation de la CaMK, peut être activée par le calcium nucléaire seul et ne nécessite pas l’import des protéines cytoplasmiques dans le noyau (Hardingham et al. 2001). Cette étude montre que l’activation de la voie de signalisation CREB, induite par la stimulation des canaux de type-L, est maintenue après le blocage de l’import nucléaire par l’agglutinine du germe de blé. Dans ce cas, l’activation de la voie est exclusivement liée à l’augmentation de la concentration nucléaire de Ca2+ parce que le vidage des stocks intracellulaires de Ca2+ par l’acide cyclopiazonique ou la thapsigargine empêche l’activation de la voie CREB. Cette étude soutient les résultats précédents démontrant que l’injection d’un chélateur de Ca2+ adressé spécifiquement au noyau (BAPTA-D70), inhibe complètement l’activation de la voie CREB induite par l’activation des canaux de type-L (Hardingham et al. 1997; Chawla et al. 1998).
D’autres études montrent aussi un rôle important des phosphatases Ca2+-dépendantes dans la régulation de la voie CREB. La calcineurine est une phosphatase sérine/thréonine dépendante du calcium qui sert comme un modulateur et influence la déphosphorylation de CREB. En 1996, Liu et Graybiel ont montré que l’inhibition de la calcineurine par le FK506 dans des coupes striatales de nouveau-nés de rats peut maintenir la phosphorylation de CREB induite par l’activation des CCDVs de type-L (Liu & Graybiel 1996). Des études plus récentes ont contredit ces observations en suggérant que la calcineurine peut jouer un rôle positif dans l’expression des gènes sous la dépendance de CREB. De ce fait, l’inhibition de la calcineurine dans les cellules non-neuronales, comme les cellules chromaffines, bloque l’expression du gène codant pour la proenképhaline qui est sous la dépendance de la voie CREB (Hahm et al. 2003). Également, dans les neurones corticaux de souris, l’inhibition de la calcineurine bloque l’expression des gènes dépendants de la voie CREB induite par la dépolarisation. Il est nécessaire de noter que cette inhibition n’influence pas le flux calcique induit par la dépolarisation ni la phosphorylation de CREB au niveau de la Ser133 (Kingsbury et al. 2007). Ces résultats contradictoires mettent en premier plan la complexité des rôles joués par la calcineurine dans la régulation de la transcription dépendante de CREB.
Bien que l’implication des canaux de type-L dans le contrôle de la transcription soit la mieux caractérisée, certaines études suggèrent également l’implication des autres types de CCDVs dans le couplage excitation-transcription.
CCDVs de type-N
Plusieurs travaux ont mis en évidence l’implication du flux calcique via les CCDVs de type-N dans la régulation de la transcription. Dans les neurones des ganglions sympathiques, cette régulation met en jeu le facteur de transcription NFATc1 (Hernández-Ochoa et al. 2007). En effet, l’augmentation de la concentration de calcium intracellulaire entraine l’activation de la calcineurine, cette dernière déphosphoryle la partie N-terminale de NFATc qui correspond à la sous-unité du complexe de transcription NFAT. Ces modifications permettent la translocation nucléaire rapide de NFATc et la régulation de la transcription de différents gènes (Crabtree & Schreiber 2009). Il est important de noter que cette activation de NFATc1 repose uniquement sur l’activation des canaux calciques de type-N parce que cette voie d’activation est bloquée par la ω-conotoxine GVIA, un inhibiteur spécifique de ces canaux (Hernández-Ochoa et al. 2007).
En 2007, Zhao et al. ont montré que, suite à la dépolarisation des neurones des ganglions cervicaux supérieurs, la phosphorylation de CREB et l’augmentation en ARNm et en protéines de c-fos dépendent des CCDVs de type-N à des faibles fréquences de stimulation; par contre, à haute fréquence de stimulation la régulation de CREB engage exclusivement les CCDVs de type-L (Zhao et al. 2007). Dans le même contexte, il a été mis en évidence que l’activation spécifique des CCVD de type-N des neurones sensoriels primaires dissociés produit une augmentation de l’expression en ARNm et en protéines de la tyrosine hydroxylase (Brosenitsch & Katz 2001).
CCDVs de type-P/Q
Les canaux calciques de type-P/Q ont également été impliqués dans une voie importante de régulation des gènes. En effet, le blocage de ces canaux dans les cellules granulaires du cervelet par la ω-agatoxine IVA entraine l’inhibition de l’expression de l’ARNm de la syntaxine-1A, une protéine nécessaire pour la libération des neurotransmetteurs. Étant donné que les bloqueurs des canaux de type-N et -L n’inhibent pas l’expression de la syntaxine-1A, l’effet est donc spécifique aux canaux de type-P/Q. En outre, cet effet nécessite les réserves intracellulaires intactes de Ca2+ ainsi que les voies fonctionnelles des kinases : CaMKII et IV, PKA et MAPK (Sutton et al. 1999).
Régulation des facteurs de transcription par les protéines fixant le Ca2+ et associées au CCDVs
Cette voie implique également une modification des facteurs de transcription par des phosphatases ou des kinases activées par le Ca2+ mais elle diffère de la précédente par l’engagement de protéines qui peuvent directement interagir avec les CCDVs. En effet, il a été montré que l’activation des canaux de type-L dans les neurones corticaux induit la phosphorylation de la protéine CREB au niveau de la Ser133 par la voie de signalisation MAPK (Dolmetsch et al. 2001). Cet effet est spécifique aux canaux de type-L puisque l’activation de CREB induite par la dépolarisation est insensible aux bloqueurs d’autres types de canaux calciques (-N et -P/Q). Dans ce cas, l’activation par le Ca2+ de la CaM liée au motif isoleucine-glutamine (domaine IQ) de l’extremité C-terminal de Cav1.2 entraine l’activation de la voie MAPK (Figure 6). Une mutation du domaine IQ empêchant la liaison de la CaM sur Cav1.2 sans affecter le courant calcique inhibe l’activation des gènes induite par la dépolarisation et dépendante de CREB. Ceci indique que le complexe CaM-Ca2+ non lié au canal est incapable d’induire la phosphorylation de CREB. Également, la MAPK/Erk peut phosphoryler la RSK (ribosomal s6 kinase) qui subit une translocation nucléaire et phosphoryle CREB (West et al. 2002). L’activation de la voie MAPK/Erk implique l’activation de Ras, une petite protéine G, suivie de la phosphorylation de MEK1 (Mitogen-activated protein kinase) par la MEK kinase. À son tour, MEK1 activée phosphoryle et active MAPK/Erk qui migre dans le noyau où elle phosphoryle CREB (Rosen et al. 1994). L’idée générale étant que CREB est déjà liée à ses régions spécifiques dans le promoteur des gènes régulés par CREB et que sa phosphorylation sur la Ser133 par la MAPK favorise le recrutement de la CBP. L’implication de la CBP dans l’acétylation des histones et le recrutement ultérieur de la machinerie de transcription permet le remodelage de la chromatine et la transcription.
La voie de signalisation NFAT représente également un exemple intéressant de transcription initiée par la dépolarisation neuronale (Graef et al. 1999). Ce processus est lié aux canaux de types-L parce que leur inhibition empêche la transcription de gènes contrôlés par NFAT. Le mécanisme nécessite l’action de la calcineurine qui permet la déphosphorylation de NFATc4 et sa translocation nucléaire (Figure 6) (Beals et al. 1997).
En 2007, Oliveria et al. ont montré que l’ancrage de la calcineurine à Cav1.2 via la PKA AKAP79/150 est nécessaire à l’activation de la voie de régulation génique dépendante de la NFATc4 (Oliveria et al. 2007). En effet, l’inhibition de l’expression d’AKAP150 à l’aide d’ARNi entraine l’inhibition de la translocation nucléaire de NFATc4, ce qui suggère que l’absence d’AKAP150 empêche la déphosphorylation de NFATc4 dépendante de la calcineurine.
Ces exemples montrent encore une fois l’implication des CCDVs et des protéines liant le calcium, qui leurs sont associées, dans diverses voies de régulation géniques.
Régulation des facteurs de transcription par le Ca2+
Dans les études décrites ci-dessus, les facteurs de transcription étaient sous le contrôle des protéines liant le Ca2+, tels que la CaM. Cependant, certains facteurs de transcription peuvent lier directement le Ca2+ ce qui met en evidence un lien direct entre le Ca2+ intracellulaire et la régulation de la transcription. Ce modèle de régulation est parfaitement illustré par le répresseur transcriptionnel DREAM (Downstream Responsive Element Antagonist Modulator). C’est une proteine de 29 kDa qui possède quatre motifs structuraux « EF hand ». Ce motif constitué de deux hélices α liées par une boucle formée d’une douzaine d’acides aminés a été caractérisé comme un site de fixation du Ca2+ des facteurs de transcription liant le Ca2+ par les CCDVs (Barbado et al. 2009).
(Carrión et al. 1999; Carrión et al. 1998). La liaison du Ca2+ à DREAM permet sa dissociation de DRE (Downstream Response Elements) en favorisant son passage d’un état tétramérique à un état dimérique (Lusin et al. 2008). Dans ce cas de figure, le Ca2+ joue un rôle activateur de la transcription au niveau des promoteurs contenant un DRE. Parmi les gènes régulés par DRE on peut citer c-fos et GnRH qui code pour l’hormone de libération des gonadotrophines hypophysaires (GnRH) (Carrión et al. 1999; Leclerc & Boockfor 2007). Dans des neurones immortalisés, l’utilisation de la nimodipine, un bloqueur des canaux de type-L, ou la neutralisation de DREAM à l’aide d’un anticorps spécifique empêche l’expression et la libération de GnRH. Ces observations établissent un lien direct entre l’entrée du calcium à travers les CCDVs de type-L et l’activation de DREAM (Leclerc & Boockfor 2007).
Régulation directe de la transcription par certains composants des CCDVs
Après une série d’études démontrant l’implication indirecte des CCDVs dans la régulation de la transcription, un nouveau concept commence à émerger décrivant les sous-unités des CCDVs comme régulateurs directs de la transcription. La première preuve d’une telle implication des domaines des canaux calciques dans la transcription a été apportée par Hibino et al. (Hibino et al. 2003). Dans cette étude, les auteurs ont mis en évidence un variant d’épissage particulier de β4, appelé β4c, et montré que ce variant interagit avec HP1 (Heterochromatin Protein 1), une protéine
nucléaire impliquée dans la régulation génique et diminue son activité inhibitrice de la transcription. Le mécanisme de cette régulation sera détaillé ultérieurement (Chapitre II. Paragraphe 4.f). 2009).
Plus récemment, un fragment protéolytique de l’extrémité C-terminale de Cav1.2 a été décrit comme un facteur de transcription (Gomez-Ospina et al. 2006). Ce fragment de 75 kDa, nommé « CCAT » (calcium channel-associated transcriptional regulator), a été détecté dans les noyaux des neurones au cours du développement et persiste aussi dans les neurones adultes. Il contient un domaine de rétention nucléaire, mais aucun signal de localisation nucléaire. Au cours de son trajet vers le noyau, ce fragment s’associe à une protéine nucléaire p54(nrb)/NonO qui intervient dans la régulation de la transcription (Shav-Tal & Zipori 2002). Ainsi, l’expression de plusieurs gènes est modifiée suite à la translocation nucléaire de CCAT. Parmi ces gènes, le gène codant pour la connexine Cx31.1, une protéine des jonctions communicantes « gap » qui joue un rôle essentiel dans l’extension des neurites, est régulée positivement en présence de CCAT. Il important de noter que l’augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+, résultant de l’ouverture des canaux calciques de type-L, déclenche l’exportation de CCAT à partir du noyau (Gomez-Ospina et al. 2006). Un fragment de 60-75 kDa de la partie C-terminale de Cav2.1 a été aussi détecté dans le noyau des cellules de Purkinje du cervelet de souris et d’humains (Kordasiewicz et al. 2006).
Par la suite, d’autres études ont mis en évidence une translocation nucléaire de la sous-unité β des CCDVs et son interaction avec des protéines nucléaires et des facteurs de transcriptions. Ces études seront décrites de façon détaillées dans le paragraphe 4.f du chapitre II.
Les mutations pathologiques des CCDVs altèrent la régulation génique
Des mutations des gènes codant pour différentes sous-unités des CCDVs ont ete associées à différentes pathologies (Pietrobon 2002; Kim 2014). Jusqu’à récemment, l’étude des pathologies liées aux canaux calciques a principalement porté sur les conséquences des mutations sur les propriétés biophysiques de ces canaux ainsi que sur leur adressage à la membrane plasmique. Compte tenu de l’implication directe de domaines ou sous-unité des CCDVs dans la régulation de l’expression des gènes, il devient aujourd’hui important d’étudier le lien entre les mutations touchants ces canaux et des défauts de transcription de certains gènes comme facteur important des pathologies associées à ces mutations. Ainsi, certaines études montrent que les pathologies associées aux mutations des CCDVs peuvent résulter de la modification de l’expression de certains gènes. Dans ce contexte, la mutation du gène codant pour la sous-unité Cav2.1 des canaux calciques de type-P/Q aboutit à un phénotype ataxique sévère. Dans ce modèle de souris, il a été remarqué que les niveaux d’ARNm et l’expression protéique des récepteurs de la ryanodine de type 1 et 3 sont altérés dans le cervelet (Sawada et al. 2008). Les taux d’ARNm du RyR de type 1 sont également modifiés chez les souris qui portent un autre type de mutation de Cav2.1 (Cicale et al. 2002).
Le mécanisme cellulaire liant les mutations des CCDVs et l’expression de RyR n’est aujourd’hui pas connu. En considérant le rôle des CCDVs dans la régulation des gènes, des altérations transcriptomiques sont susceptibles d’être à la base d’une liste croissante des « channelopathies ».
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Table des matières
e des matières
Remerciments
Résumé
Abstract
Abréviations
Abréviations des Acides Aminés
Liste des Figures
Liste des Tableaux
Partie I. Bibliographie
Chapitre I. Les canaux calciques et signalisation calcique
1. Canaux Calciques
2. L’homéostasie du calcium
3. Canaux Calciques Dépendant du Voltage
a. Généralité et Classification
b. Composition
4. La régulation de l’expression génique par les CCDVs
a. Régulation des facteurs de transcription par les protéines fixant le Ca2+ mais non associées au CCDVs
b. Régulation des facteurs de transcription par les protéines fixant le Ca2+ et associées au CCDVs
c. Régulation des facteurs de transcription par le Ca2+
d. Régulation directe de la transcription par certains composants des CCDVs
5. Les mutations pathologiques des CCDVs altèrent la régulation génique ….
Chapitre II. La Sous-unité β
1. Découverte
2. Les isoformes de Cavβ et leur distribution tissulaire
3. Structure de Cavβ
4. Les protéines partenaires de Cavβ
a. Cavα1, le premier partenaire de Cavβ
b. Cavβ et les protéines kinases: une relation complexe
c. Interaction de Cavβ avec des récepteurs membranaires et d’autres canaux ioniques
d. L’interaction de Cavβ avec les GTPases
e. L’interaction de Cavβ avec d’autres protéines
f. Les fonctions de Cavβ indépendantes du canal
5. Pathologies liées à Cavβ
Chapitre III. La voie de signalisation des protéines Wnt
1. Généralités
2. Wnt et Frizzled
3. Signalisation Wnt/β-caténine canonique
a. Mécanisme de la signalisation Wnt/β-caténine
b. La β-caténine
c. Kaiso
d. Les facteurs de transcription TCF/LEF
4. Signalisation Wnt/β-caténine et le développement cérébral
Chapitre IV. Les cellules souches mésenchymateuses
1. Généralités
2. Les cellules souches mésenchymateuses
3. Différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules souches neurales.
4. Les CSM dans la médecine régénérative
5. Les limitations de l’application des CSM dans la médecine régénérative
Partie II. Objectifs
Partie III. Matériel et Méthodes
1. Modèles cellulaires
a. Lignée CHO
b. Lignée FOCUS
2. Plasmides et transfection
3. Génération des lignées stables CHO
4. Les lignées stables FOCUS
5. Quantification de la prolifération cellulaire
6. Synchronisation des cellules
7. Extraction protéique et fractionnement subcellulaire
8. Immunoprécipitation
9. Electrophorèse et Western-blot
10. Immunocytochimie des cultures cellulaires
11. Analyse du cycle cellulaire
12. Incorporation du BrdU
13. Extraction d’ARN et RT-PCR
14. Test de luciférase et CopGFP
15. Différentiation des cellules souches en cellules neuronales
a. Isolation et culture des CSM
b. Différentiation des CSM en cellules neuronales
c. Caractérisation des CSM par cytométrie en flux
Partie IV. Résultats
Chapitre I. Les partenaires protéiques de Cavβ et leurs fonctions associées
Chapitre II. Le rôle de Cavβ dans la prolifération cellulaire
Chapitre III. Cavβ, un régulateur de la voie Wnt/β-caténine
Chapitre IV. Expression de Cavβ4 au cours de la différentiation neuronale
1- Immunophénotypage des cellules
2- L’expression de β4 varie en fonction de la différentiation neuronale
Partie V. Discussion, perspectives et conclusion
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
Partie VI. Références
Partie VII. Annexes
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