Régulation de la méiose CHEZ LA CHIENNNE

Régulation de la méiose CHEZ LA CHIENNNE

La maturation cytoplasmique de l’ovocyte

La maturation cytoplasmique regroupe l’ensemble des remaniements ovocytaires qui ont lieu au cours de la folliculogenèse et éventuellement de la maturation in vitro. Ces remaniements sont aussi bien moléculaires que morphologiques et ne sont, pour la plupart, connus que par leurs conséquences sur la capacité de l’ovocyte à être fécondé et à permettre le développement embryonnaire.

Aspects morphologiques

La migration des granules corticaux est sans doute le trait le plus marquant de la maturation cytoplasmique. Elle a des conséquences importantes sur la fécondation et plus précisément concourt à éviter la polyspermie. Ces granules ont une localisation cytoplasmique sous-corticale diffuse dans l’ovocyte immature et, dès la reprise de méiose, commencent à migrer vers la zone corticale, s’associent au cytosquelette de cette zone (filaments d’actine) et y restent jusqu’à la fécondation. Leur contenu sera alors libéré dans l’espace périvitellin (espace compris entre l’ovocyte et la zone pellucide). Cette migration des granules, sous la dépendance des microtubules, s’accompagne d’un rassemblement des autres organites (mitochondries, appareil de Golgi) dans la zone périnucléaire (Figure 4).Pendant la maturation, les microvillosités de la surface ovocytaire disparaissent dans la région surplombant le matériel nucléaire (Maro et al., 1990 ; Gallicano et al., 1994). La couche sous-corticale uniforme de filaments d’actine s’épaissit à cet endroit, ce qui pourrait aider à la stabilisation de ce réseau de filaments et donc au blocage de l’ovocyte en métaphase
II. Cette région est également dépourvue de granules corticaux. La différenciation de la surface ovocytaire à l’aplomb du matériel nucléaire pourrait être importante dans la fécondation. En effet, nous pouvons observer que le spermatozoïde ne pénètre jamais dans cette région pauvre en protéines de surface, ce qui permettrait d’éviter l’expulsion de la tête du spermatozoïde en même temps que le second globule polaire ce qui conduirait à une impasse reproductive (Mermillod et Le Lannou, 1999). Les filaments d’actine interviennent également dans la constriction du pont cytoplasmique menant à l’expulsion des globules polaires. En plus de leur rôle dans la formation du fuseau méiotique, les microtubules interviennent aussi dans l’expulsion des globules polaires, avec les filaments d’actine.De même, les mitochondries migrent durant la méiose : situées autour de la vésicule germinative au début de la méiose, elles se dispersent ensuite à l’occasion de l’émission du premier globule polaire.

Aspects moléculaires

Une des caractéristiques importantes de la maturation ovocytaire est la traduction de nombreux transcrits stockés à l’état quiescent dans l’ovocyte. Ceci entraîne des changements notables des profils de néosynthèses protéiques, évoluant tout au long de la maturation. Peu des protéines sont actuellement connues. Néanmoins, certaines protéines intervenant dans le contrôle du cycle cellulaire méiotique, telle que la cycline B, en font partie. On considère qu’environ 60% des transcrits maternels présents dans l’ovocyte I sont détruits lors de la maturation (Huarte et al., 1987 ; Strickland et al., 1988)..Des changements métaboliques interviennent également au cours de la maturation et l’un d’eux a des conséquences importantes pour la fécondation, il s’agit de la synthèse de glutathion (GSH). Le niveau de GSH est très faible dans l’ovocyte immature, augmente pendant la maturation pour atteindre un maximum à la métaphase II puis chute à nouveau dans l’embryon précoce. Le GSH intervient dans la réduction des ponts disulfures lors de la décondensation de la chromatine du spermatozoïde et le remplacement des protamines de l’ADN du spermatozoïde par des histones. Le GSH accumulé pendant la maturation serait à la fois originaire de l’ovocyte et du cumulus, ce qui constitue une explication possible de l’importance de la présence de cellules de cumulus pour la qualité de la maturation cytoplasmique.

L’expansion du cumulus

Les cellules du cumulus subissent elles aussi des transformations notables au cours de la maturation. La plus spectaculaire est l’expansion du cumulus. Cette expansion résulte de la dispersion des cellules suite à la production par ces cellules d’une matrice viscoélastique abondante s’accumulant dans les espaces intercellulaires. L’acide hyaluronique est le composant majeur de cette matrice, lui conférant sa viscosité. Cette matrice permet à l’ensemble cumulus-ovocyte de conserver son intégrité même après la rupture des complexes de jonction ovulatoire et permet donc aux cellules de cumulus de continuer à envoyer des facteurs diffusibles vers l’ovocyte en cours de maturation. De plus, ce cumulus expansé faciliterait la capture de l’ovocyte par le pavillon et favoriserait la fécondation (Chen et al., 1993).

Régulation de la méiose

Inhibition de la reprise avant l’ovulation

On sait depuis longtemps (Pincus et Enzmann, 1935) que si l’ovocyte est extrait de son contexte folliculaire et placé dans un milieu de culture, il reprend spontanément sa méiose, sans décharge de LH et bien avant que le follicule n’ait terminé sa croissance.
Cette inhibition folliculaire est maintenant bien admise même si les mécanismes moléculaires en sont encore mal connus. Elle repose sur les relations intrafolliculaires que l’ovocyte établit avec les cellules de granulosa qui l’entourent.
D’autre part, à long terme, un ovocyte dénudé va dégénérer et même si cet ovocyte est cultivé en présence d’un autre type cellulaire somatique (fibroblastes par exemple), il est incapable de reformer les communications nécessaires à son développement. Ceci montre bien que l’ovocyte est dépendant de la présence de cellules de granulosa pour se développer et maturer.
Enfin, la présence de cellules autour de l’ovocyte intervient également dans le contrôle du blocage méiotique : des ovocytes débarrassés de leurs cellules de cumulus, donc de leur environnement folliculaire, et placés en culture sont capables d’accomplir spontanément leur méiose jusqu’en métaphase II mais sont incapables d’être fécondés et de se développer normalement (Zhang et al., 1995). Ceci indique que des facteurs provenant du fluide folliculaire et/ou des cellules de granulosa inhibent la maturation méiotique ovocytaire.
Il semble donc que la présence de cellules de cumulus soit importante pour la qualité de la maturation cytoplasmique (Salustri et al., 1993 ; Cecconi et Colonna, 1996).

Les projections transzonales

Dans le follicule, les cellules de granulosa communiquent entre elles mais aussi avec l’ovocyte, bien qu’il existe entre la granulosa et l’ovocyte une « barrière » formée par la zone pellucide. La présence de cette zone pellucide n’est pourtant pas un obstacle aux échanges entre l’ovocyte et les cellules qui l’entourent. Pour communiquer, les cellules de granulosa proches de l’ovocyte mettent en place des extensions cellulaires appelées projections transzonales. Ces projections cellulaires sont extrêmement nombreuses et forment un véritable réseau permettant des échanges considérables entre les cellules de granulosa et l’ovocyte. Leur cytosquelette est formé de microtubules, et les projections transzonales s’orientent vers l’ovocyte grâce aux jonctions d’attachement, c’est-à-dire aux desmosomes (connection des filaments intermédiaires) et aux jonctions adhérentes (connection des filaments d’actine).
Les communications entre l’ovocyte et ses cellules de granulosa évoluent en fonction de la maturation ovocytaire et folliculaire. Ainsi, aux stades précoces, les jonctions gap sont détectées dès la formation des follicules primordiaux. Dans les follicules primordiaux et secondaires, de très nombreuses microvillosités sont présentes et ces extensions des cellules du cumulus sont en contact avec les organelles ovocytaires (appareil de Golgi, réticulum endoplasmique…) et pénètrent dans l’ooplasme, parfois jusqu’à proximité du noyau ovocytaire. Ensuite, dans le follicule préantral, les projections transzonales sont nombreuses et forment des jonctions adhérentes et gap, tandis que dans le follicule antral, les projections se rétractent peu à peu et forment moins de connections.

Les jonctions communicantes

A la zone de contact, entre l’ovocyte et les cellules de granulosa, au début du développement folliculaire (stade primordial et primaire), les échanges de molécules s’effectuent majoritairement via des vésicules sécrétoires, produites par l’ovocyte ou les cellules de granulosa, puis absorbées par endocytose. Ensuite dès que le follicule atteint le stade secondaire, les échanges continuent à se faire par exocytose/endocytose (avec libération de certains facteurs dans l’espace périvitellin ovocytaire), mais la communication s’effectue également activement par les jonctions communicantes (avec contact cellule-cellule).
Ces jonctions communicantes sont les jonctions gap (encore appelées « junctions communicans » ou « nexus »). Ce sont des canaux membranaires entre les cellules. Elles permettent une communication intercellulaire directe et sont formées de connexons, hexamères de six sous-unités appelées connexines. La famille des connexines comporte au moins dix-sept protéines différentes, nommées selon leur poids moléculaire. Huit de ces connexines (Cx26, Cx30.3, Cx32, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45 et Cx57) ont déjà été mises en évidence dans les ovaires de nombreuses espèces. Néanmoins, toutes n’interviennent pas dans les jonctions ovocyte-granulosa. Certaines sont plutôt détectées dans les cellules de thèque ou de granulosa. Elles ne sont pas toutes toujours présentes dans les ovaires : ainsi, la Cx32 pourtant présente chez la souris au niveau des ovaires n’est pas détectable dans les ovaires chez la chienne alors qu’elle est exprimée dans le foie.
A l’interface ovocyte-cumulus, trois connexines (Cx37, Cx43 et Cx45) ont été mises en évidence jusqu’à présent (Figure 5). La connexine 37, produite par l’ovocyte, n’est présente que dans les jonctions gap à la surface de l’ovocyte. Cette connexine semble être particulièrement importante car le développement folliculaire et ovocytaire (donc la maturation nucléaire) est altéré dans les ovaires de souris invalidées pour le gène Cx37-/-(homozygotz pour un allèle nul, Cx37-/- ou souris knock-out Cx37 ; Simon et al., 1997) : les follicules sont normaux jusqu’au stade gros préantral, mais les follicules préovulatoires ne se développent jamais. Chez ceux-ci, il n’y a plus de connections ovocyte-cumulus, la croissance de l’ovocyte s’arrête, il n’y a pas d’ovulation et l’ovocyte ne peut reprendre sa méiose. La connexine 43, quant à elle, est présente au niveau des jonctions des projections transzonales et est également présente dans les cellules de granulosa (Wiesen et Midgley, 1994 ; Wright et al., 2001 ; Kidder et Mhawi, 2002). Comme la connexine 37, la connexine 43 paraît primordiale car les souris mutées Cx43-/- présentent des troubles de reproduction : le nombre de cellules germinales est très fortement réduit (-90%) et le développement folliculaire s’arrête précocement (pas de follicules antraux).
Ces nombreuses jonctions couplant l’ovocyte à ses cellules de granulosa en font donc un syncytium fonctionnel. L’existence des multiples projections transzonales traversant la zone pellucide et de ces nombreux types de contacts possibles entre l’ovocyte et les cellules qui l’entourent montre bien que l’ovocyte n’est pas « séquestré » dans une zone pellucide imperméable.
Figure 5 : Modèle proposé pour l’agencement des différentes connexines mises en évidence dans les complexes cumulo-ovocytaires murins. La Cx37 semble être la seule exprimée par l’ovocyte. La connexine la plus importante du cumulus est la Cx43 qui participe d’une part à des jonctions gap ovocyte-cumulus et d’autre part entre cellules de granulosa directement ou par l’intermédiaire des projections transzonales. La Cx45 est minoritaire et n’est jamais retrouvée au niveau de la membrane ovocytaire. D’autres connexines sont exprimées dans les complexes cumulo-ovocytaires mais leur localisation n’a pas été déterminée au niveau ultrastructural (d’après Kidder et Mhawi, 2002). gc : cellules de granulosa ; zp : zone pellucide ; tzp : projections transzonales ; mv : microvillosités.

Les molécules échangées via ces jonctions communicantes

Ces projections ont plusieurs fonctions telles que le transfert de substances permettant la formation de la zone pellucide, l’échange de nutriments, de facteurs de croissance, mais également l’évacuation des catabolites venant de la zone pellucide ou de l’ovocyte.
Les deux types cellulaires ovocyte/granulosa sont couplés chimiquement, électriquement, partagent la majorité de leurs ions inorganiques et se transfèrent des molécules de faible poids moléculaire (1 000 Da). Une coopération métabolique se met en place, notamment concernant l’absorption de certains acides aminés, pour lesquels l’ovocyte a besoin des cellules de granulosa. D’autres composés peuvent également être échangés tels que des petits métabolites (ions, pyruvate, vitamines, nucléotides (ATP), purines (AMPc), Ca2+…), des petites molécules hydrosolubles, des sels minéraux et des protéines (facteurs de croissance…).
Le transfert de certaines molécules des cellules de granulosa à l’ovocyte pourrait donc contrôler la méiose ovocytaire et parmi ces facteurs inhibiteurs d’origine somatique, on peut citer l’OMI et l’adénosine mono phosphate cyclique (AMPc).
• L’OMI
Le follicule produirait une ou plusieurs substances appelées « Oocyte Meiotic Inhibitor » ou OMI dont la nature reste incertaine bien que quelques candidats soient suspectés. L’OMI doit probablement transiter par le fluide folliculaire puisque celui-ci exerce une activité OMI transitoire in vitro. Plusieurs peptides à activité OMI ont été partiellement purifiés de fluide folliculaire de différentes espèces et plusieurs facteurs de croissance ou hormones ont été proposés comme candidats OMI (TGF-β, AMH, activine, inhibine, follistatine) mais à ce jour aucune certitude n’est possible quant à la nature chimique de l’OMI. Des bases puriques (hypoxanthine, adénosine), présentes dans le fluide folliculaire de plusieurs espèces pourraient jouer ce rôle d’OMI. Toutefois, le niveau de ces bases dans le fluide folliculaire ne change pas suite à la décharge gonadotrope ovulante et d’autre part, ces bases sont absentes du fluide folliculaire de certaines espèces (bovins) ayant par ailleurs une activité OMI. Ces bases agissent en maintenant un taux élevé d’AMPc intraovocytaire par inhibition de la phosphodiestérase (Downs et al., 1989).
Depuis les expériences de Foote et Thibault en 1969, montrant le blocage méiotique d’ovocytes de vache ou de truie cultivés dans des follicules entiers ou dans des hémisections folliculaires, il était généralement admis que la paroi folliculaire était à l’origine du signal d’inhibition méiotique. On admettait également que l’OMI était originaire de la granulosa et transitait par le cumulus où il subissait une transformation activatrice avant d’être transmis à l’ovocyte. Cependant, des expériences récentes montrent que la thèque interne pourrait également intervenir dans la production d’OMI. En effet, il a été montré en utilisant des co-cultures d’ovocytes et de fragments de paroi folliculaire (Richard et Sirard, 1993) ou d’ovocytes et de primocultures de thèque et de granulosa (Kotsuji et al., 1994) que la thèque et la granulosa coopèrent pour maintenir l’ovocyte au stade de vésicule germinative. Les meilleurs résultats de blocage méiotique in vitro sont en effet obtenus lorsque les deux types cellulaires sont présents. Le signal inhibiteur (OMI) pourrait donc être originaire de la thèque et, selon l’environnement gonadotrope, être ou non modifié et/ou transmis à l’ovocyte par la granulosa via le cumulus et le fluide folliculaire. Lors de la décharge gonadotrope ovulante, ce signal inhibiteur ne serait plus transmis par la granulosa.
• L’AMPc
L’AMPc semble jouer un rôle important dans le blocage et la reprise de méiose de nombreuses espèces. Ainsi, chez les rongeurs, des molécules augmentant le niveau d’AMPc sont capables de prolonger le blocage méiotique in vitro. C’est le cas d’analogues stables de l’AMPc franchissant les membranes tel que le dibutyryl-AMPc (dbAMPc) ou le 8-bromo AMPc, d’agents activateurs de l’adénylate cyclase (forskoline) ou encore d’inhibiteurs de la phophodiestérase (isobutyl-méthyl xanthine ou IBMX, hypoxanthine). Cependant, ce rôle de l’AMPc ne semble pas aussi important dans les espèces autres que les rongeurs. En effet, il a été montré chez les bovins (Sirard, 1990) que les drogues agissant en élevant le taux d’AMPc intracellulaire n’ont qu’un effet transitoire sur le maintien du blocage méiotique. Les mécanismes régulateurs du blocage méiotique de l’ovocyte pourraient donc varier selon les espèces, ce qui pourrait également constituer une des difficultés d’identification de l’OMI.

Acquisition progressive de l’aptitude à reprendre la méiose

La reprise de méiose n’est possible qu’à partir d’un certain stade de croissance ovocytaire et on parle alors de compétence méiotique. On admet généralement que l’ovocyte contenu dans le follicule à antrum est capable de reprendre sa méiose lorsqu’il a atteint 80% de sa taille définitive. Des études détaillées chez la chèvre (De Smedt et al., 1994 ; Gall et al., 1996) ont montré que cette compétence est acquise progressivement au cours de la folliculogenèse et de la croissance ovocytaire (Tableau 1) . Les ovocytes deviennent d’abord capables d’accomplir la rupture de la vésicule germinative (follicules de 0,5 à 0,8 mm), puis de poursuivre la méiose seulement jusqu’en métaphase I (1 à 1,8 mm) et enfin en métaphase II (3 à 6 mm). La compétence ovocytaire à la fécondation et au développement embryonnaire (maturation cytoplasmique) s’acquière ultérieurement.
Le niveau de pré-meiosis promoting factor ou pré-MPF, intraovocytaire (c’est-à-dire la quantité de pré-MPF disponible au sein de l’ovocyte) pourrait constituer l’explication de l’acquisition progressive de la compétence méiotique par l’ovocyte en cours de folliculogenèse. En effet, il a été montré dans plusieurs espèces que le manque de compétence méiotique des ovocytes de petits follicules pourrait être dû à l’absence ou à la présence limitante de cycline B (Chesnel et Eppig, 1995 ; Hue et al., 1997) ; cette cycline B étant une protéine interagissant avec la protéine intraovocytaire p34cdc2 pour constituer le pré-MPF.

Table des matières

Introduction 
Etude bibliographique : la maturation ovocytaire 
A – La maturation nucléaire 
1 – Rupture de la vésicule germinative
2 – Condensation des chromosomes
3 – Blocage en métaphase II
B – La maturation cytoplasmique de l’ovocyte 
1 – Aspects morphologiques
2 – Aspects moléculaires
C – L’expansion du cumulus
D – Régulation de la méiose
1 – Inhibition de la reprise avant l’ovulation
a – Les projections transzonales
b – Les jonctions communicantes
c – Les molécules échangées via ces jonctions communicantes
2 – Acquisition progressive de l’aptitude à reprendre la méiose
3 – Mécanismes de reprise de la méiose
a – La disparition des jonctions communicantes
b – L’hormone lutéinisante et l’AMPc
c – Les molécules-clé de la reprise de la méiose : Meiosis
4 – Blocage au stade métaphase II
E – Particularités de la méiose ovocytaire chez la chienne
1 – Un modèle endocrinien singulier
2 – L’ovulation d’un ovocyte bloqué en prophase I
3 – Des conditions de maturation ovocytaire difficiles
4 – Des conditions de fécondation particulières
Etude expérimentale : effet de la modulation du niveau d’AMPc sur la reprise de la méiose ovocytaire chez la chienne
A – Matériels et méthodes
1 – Collecte des ovaires de chienne
2 – Milieux de dissection et de maturation
a – Le milieu de dissection
b – Les milieux de maturations : les traitements visant à moduler le rôle de l’AMPc
3 – Dissection et la sélection des ovocytes
4 – Fixation et coloration des ovocytes mis en culture
a – Fixation
b – Coloration
5 – Observation des ovocytes au microscope confocal
6 – Détermination du stade de maturation des ovocytes
B – Résultats 
1 – Effectifs – difficultés de manipulation
2 – Images de méiose ovocytaire canine obtenues
3 – Effets des traitements sur la reprise de méiose
Discussion
Conclusion
Bibliographie

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