Soutenance mémoire
Les biodiversités faunistiques et floristiques sont importantes pour un pays et les services écosystémiques rendus sont nombreux (RAMIHARANTSOA, 2003). La forêt assure, entre autres, les services d’approvisionnement, de régulation ainsi que les services culturels (http://1). Dans les zones tropicales du globe, où les conditions environnementales sont idéales, il existe des diversités génétiques très particulières (GAUTIER et GOODMAN, 2003 ; http://2). À Madagascar, 85% de la flore et 80 % de la faune sont endémiques (http://3). Dès l’année 2011, il a été rapporté que l’île renfermait environ 5% des espèces animales et végétales de la planète, elle est une île de méga-diversité (CIRAD, 2013). À part ces richesses faunistiques et floristiques, le sous-sol de Madagascar possède aussi des minerais importants et des pierres précieuses (ilménite, nickel, cobalt, terre rare, fer, or, uranium, hydrocarbures, etc.) (http://4).
CULTURE IN VITRO
La culture in vitro est une branche de la biotechnologie végétale qui a pour principe la culture axénique (protégé de toute contamination) des fragments de tissus végétaux (explants) dans des milieux nutritifs artificiels, et sous conditions environnementales contrôlées (MONTES, 2009). Le but est d’obtenir une nouvelle plante entièrement autonome (vitroplant) à partir de ce fragment, ceci grâce à la totipotence des cellules végétales définie par HABERLANDT en 1902. Par définition, la cellule végétale, unité morphologique et physiologique de la plante, est capable d’autonomie car elle détient la majeure partie de l’information génétique nécessaire dans son noyau (95%) pour régénérer une plante entière (HABERLANDT in GAUTHERET, 1959).
CULTURE IN VITRO DES EMBRYONS VEGETAUX
HISTORIQUE
La culture in vitro d’embryon précède de loin toutes les autres techniques de culture in vitro. Dès 1904, des essais de culture d’embryons matures sur des milieux artificiels composés d’éléments minéraux et de sucres ont été effectués (KACEM, 2005; http://8).
Le sauvetage d’embryons est une technique de culture in vitro impliquant l’utilisation d’embryon immature extrait de la graine au stade globulaire à torpillaire comme explant (RAGHAVAN, 1980; BRIGEN, 1994). La culture d’embryon immature est souvent réalisée comme support pour la callogenèse et l’embryogenèse somatique directe, car les jeunes tissus des embryons sont fortement embryogènes (NORREL, 1973). A partir des tissus de l’embryon zygotique immature, des embryons somatiques se développent en l’absence de prolifération des cals et chacune des cellules de l’explant deviennent compétentes (PIATTI, 1988). Ces embryons somatiques issus des embryons zygotiques se développent et effectuent l’organogenèse après leur transfert sur un milieu de régénération (ROUGET, 1989; DODEMAN et al., 1997).
La culture d’embryon mature consiste à utiliser des embryons bien structurés appartenant au stade cotylédonaire jeune ou âgés comme explant (annexe1). Le résultat aboutit directement à des plantules par l’organogenèse in vitro (rhizogenèse et caulogenèse) (ZRYD, 1988). Le développement du méristème apical racinaire (MAR) en véritable racine par la rhizogenèse est souvent considéré comme la condition essentielle qui définit le début de la régénération chez les embryons zygotiques (RAGHAVAN, 1986). Le développement du méristème apical caulinaire (MAC) par caulogenèse permet le développement des organes aériens (tiges, feuilles et bourgeons) et achève la régénération (MONNIER, 1980; JULLIEN, 1991).
COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE
Le milieu de culture correspond à la substance ou le support sur lequel l’explant sera cultivé (GAMBORG et PHILLIPS, 1995). En général les milieux de base les plus avantageux sont ceux de Murashige et Skoog (MS) et le milieu de Gamborg (B5), lorsqu’il s’agit de la culture d’embryons zygotiques (NORSTOG, 1979). Cependant, quelques modifications comme l’enrichissement et/ou la diminution de la quantité d’un composé sont nécessaires suivant l’espèce à cultiver et le stade de développement de l’embryon (KUMARIJAYASREE et THULASEEDHARAN, 2004). En culture in vitro d’embryon, plus l’environnement maternel est conformément reproduit, plus l’embryon pourra survivre (KACEM, 2005). A cet effet, un embryon globulaire nécessite d’être transféré successivement sur des milieux de croissance, de maturation et d’enracinement avant d’aboutir à une plantule. Ces transferts sont effectués pour respecter les différents stades d’évolution de cet embryon à l’intérieur d’un ovule (BARIKISSOU, 2012).
a) Sels minéraux
En général, l’azote est le plus important pour la culture d’embryon, mais certaines espèces préfèrent une quantité abondante de potassium (ROUGET, 1989). L’azote est apporté sous forme de nitrate ou nitrite par l’ajout de complexe d’acides aminés comme la caséine qui est composée de 18 acides aminés (RAGHAVAN, 1980; TANG et GUO, 2001). L’unique utilisation de la glutamine est aussi efficace pour stimuler la croissance des embryons chez de nombreuses espèces (GROLL et al., 2002).
b) Sources de carbone
Il est indispensable d’apporter le sucre comme source de carbone dans le milieu de culture car les embryons sont en pleine croissance, le saccharose est le plus utilisé (BHOJWANI et RAZDAN, 1983). D’une part, le sucre servira pour la croissance et d’autre part, pour le maintien de la pression osmotique pour la survie des embryons (DJIBRIL et al., 2013).
Le sucre intervient aussi dans le développement et la régénération des embryons issus d’organes végétatifs en plantules (embryons somatiques) (BRHADDA et al., 2008).
c) Vitamines
Le milieu de culture doit contenir des vitamines pour permettre la croissance de l’embryon. La thiamine et l’acide ascorbique qui sont des éléments favorisant l’allongement cellulaire sont les plus utilisées pour la culture d’embryon (NEWTON, 1995).
d) Régulateurs de croissance
Les régulateurs de croissance ne sont pas sollicités si les embryons sont déjà matures. L’environnement extérieur n’a pas d’influence potentielle sur l’embryon s’il est de taille supérieure à 200µm (MONNIER , 1980). L’ajout de régulateurs de croissance aboutit souvent à la formation des cals ou à des développements anormaux des plantules tels que l’hypercaulogenèse, l’atrophie des feuilles ou l’absence de développement racinaire (WILLIAMS et MAHESWARAN, 1986). Les cals blancs friables issus de ces embryons sont fortement embryogènes et possèdent la capacité cytologique de régénérer des plantules après leur culture (NZEFOUO, 2010).
Cependant, certaines espèces requièrent une concentration en auxine (AIA) supérieure à celle du cytokinine (BA ou BAP) pour que l’embryon se développe (YEUNG et al., 1981). C’est le cas de certaines espèces dans la famille des Euphorbiaceae (RAJESH et al., 2009). Par ailleurs, la levée de dormance peut nécessiter l’ajout d’une faible quantité d’Acide Abscissique (ABA) ou d’Acide Gibbérellique (GA3) (GROUT, 1986) .
e) Substances naturelles
Dans la culture d’embryons, le lait de coco était également additionné au milieu de culture dans le but de fournir les éléments essentiels aux tissus. L’endosperme liquide du coco est riche en éléments minéraux et en régulateurs de croissance (YONG et al., 2009). L’efficacité du lait de coco fut expliquée par l’existence de « facteurs embryogènes » dans le lait de coco qui a été progressivement remplacé par des substances synthétiques imitant sa composition. La composition du milieu Murashige et Skoog (1962) favorise l’expression de ce facteur chez les embryons zygotiques (YEUNG et al., 1981).
f) Gélifiant
La culture d’embryon peut se faire sur un milieu liquide ou solidifié à base d’agar-agar allant de 0,5% à 1,5%. Une concentration trop élevée d’agar-agar peut inhiber la croissance des embryons à cause de la mauvaise hydratation (BRIGEN, 1994). Les feuilles de papier en ouate de cellulose sont fréquemment utilisées pour la culture d’embryons cotylédonaires matures car ils sont autonomes du point de vue nutritionnels, mais une hydratation régulière est nécessaire (HOLEMAN, 2009).
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE I : GENERALITES
I.CULTURE IN VITRO
II.CULTURE IN VITRO DES EMBRYONS VEGETAUX
II.1 HISTORIQUE
II.2 COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE
II.3 CONDITIONS DE CULTURE DES EMBRYONS
III AUTRES FACTEURS INFLUENÇANT LA CULTURE IN VITRO DES EMBRYONS VEGETAUX
PARTIE II: MATERIELS ET METHODES
I. MATERIEL VEGETAL
I.1 CLASSIFICATION BOTANIQUE DE Croton droguetioïdes
I.2 DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE
II. METHODES
II.1 PRETRAITEMENT DE LA PLANTE MERE
II.2 ETABLISSEMENT DE LA CULTURE ASEPTIQUE
II.2.1 Protocole de stérilisation de surface des fruits
II.2.2 Paramètre étudié
II.3 PREPARATION DU MILIEU DE CULTURE MURASHIGE ET SKOOG (MS) (1962)
II.4 CONDITIONS DE CULTURE DES EMBRYONS
II.5 ETUDE DE L’INFLUENCE DES REGULATEURS DE CROISSANCE SUR LA CULTURE IN VITRO DES EMBRYONS ZYGOTIQUES DE Croton droguetioïdes
II.5.1 Utilisation du Benzyle Adénine (BA)
II.5.2 Utilisation de l’Acide Indole Acétique (AIA)
II.5.3 Utilisation des combinaisons d’Acide Naphtalène Acétique /Benzyle Adénine (ANA/BA), et d’Acide Indole Acétique/Benzyle Adénine (AIA/BA)
II.6 TRAITEMENT STATISTIQUE DES DONNEES
PARTIE III : RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I.INFLUENCE DES CONCENTRATIONS DE DESINFECTANTS ET DES DUREES DE TREMPAGE SUR LA STERILISATION DE SURFACE DES FRUITS DE Croton droguetioïdes
II. INFLUENCE DES REGULATEURS DE CROISSANCE SUR LA CULTURE IN VITRO DES EMBRYONS ZYGOTIQUES DE Croton droguetioïdes
II.1 INFLUENCE DU BENZYLE ADENINE (BA)
II.1.1 Taux de régénération
II.1.2 Croissance et développement
II.1.3 Callogenèse
II.2 INFLUENCE DE L’ACIDE INDOLE ACETIQUE (AIA)
II.2.1 Taux de régénération
II.2.2 Croissance et développement
II.2.3 Callogenèse
II.3 EFFETS COMPARATIFS DE LA COMBINAISON D’ACIDE NAPHTALENE ACETIQUE /BENZYLE ADENINE (ANA/BA), ET D’ACIDE INDOLE ACETIQUE/BENZYLE ADENINE (AIA/BA) SUR LA REGENERATION DES EMBRYONS
II.3.1 Taux de régénération
II.3.2 Croissance et développement
II.3.3 Callogenèse
PARTIE IV: DISCUSSIONS
I.ETABLISSEMENT DE LA CULTURE ASEPTIQUE
II.CHOIX DES EXPLANTS ET DU MILIEU DE BASE DE MURASHIGE ET SKOOG (MS) (1962) POUR LA REGENERATION DES EMBRYONS DE Croton droguetioïdes
III. INFLUENCE DE L’UTILISATION DES REGULATEURS DE CROISSANCE SUR LA REGENERATION DES EMBRYONS ET LA CROISSANCE DES PLANTULES DE Croton droguetioïdes
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
WEBOGRAPHIE
ANNEXES
