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Mort cellulaire programmée et apoptose
Généralités
La « mort cellulaire programmée » est un processus biologique fondamental des organismes multicellulaires dans lesquels une séquence d’événements hautement régulés, contrôlés par un programme génétique, conduit à la mort de la cellule [Lockshin et al. 2001]. Focalisés sur l’étude du « vivant », les biologistes ont cependant longtemps négligé le phénomène de mort cellulaire. Bien que les premières descriptions morphologiques datent de la moitié du XIXe siècle, principalement par Walther Flemming, la notion même de « mort cellulaire programmée » n’a en effet été formulée que bien plus tard en 1964 par Lockshin. C’est uniquement en 1973 que la première classification de mort cellulaire a été établie par Schweichel et Merker [Schweichel et al. 1973].
Cette première classification morphologique proposée suite à l’étude d’embryons de rats exposés à des substances toxiques est divisée en 3 types de mort cellulaire: le type I associé à l’hétérophagie, le type II associé à l’autophagie et le type III caractérisé par une absence de digestion des cellules mortes. Aujourd’hui, ces modes de mort cellulaire sont considérés, respectivement, comme l’apoptose, la mort cellulaire autophagique et la nécrose [Galluzzi et al. 2007]. Le terme d’apoptose, dérivé du grec ancien et qui évoque « la chute des feuilles », a été utilisé pour la première fois par Kerr et collaborateurs en 1972 pour décrire une forme morphologiquement particulière de mort cellulaire. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans le processus d’apoptose des cellules de mammifères est issue notamment de l’étude du développement du nématode Caenorhabditis elegans (C. elegans) par le laboratoire d’Horvitz dans les années 80 [pour revue Lettre et al. 2006]). L’apoptose a depuis été reconnue et acceptée comme un mode de mort cellulaire programmée, qui implique une élimination génétiquement déterminée des cellules.
En quelques mots, l’autophagie du grec « auto » soi-même et « phagie » manger, permet à une cellule en manque de nutriments, ou à une cellule privée de facteurs de croissance, de survivre en utilisant ses propres composants (organites, matériel non essentiel, etc.). Cependant, les cellules qui ne reçoivent pas de nutriments pendant des périodes prolongées, finissent par mourir d’une mort cellulaire associée à l’autophagie [Kroemer et al. 2005]. La nécrose, du grec « nekros» cadavre, a été définie comme un type de mort cellulaire qui ne possède pas les caractéristiques de l’apoptose et de l’autophagie, et est généralement considérée comme incontrôlée. Toutefois, des recherches récentes suggèrent que son apparition et son évolution peuvent être strictement régulées, en impliquant notamment RIP1 ; on parle ainsi de nécroptose [Galluzzi et al. 2008; Hitomi et al. 2008; Vandenabeele et al. 2010].
Modifications morphologiques
Les différents types de mort cellulaire sont principalement décrits par des critères morphologiques définis par le comité de la nomenclature de la mort cellulaire (NCCD : Nomenclature Committee on Cell Death) [Kroemer et al. 2009]. De toutes les morts cellulaires, l’apoptose reste celle qui est la plus fréquemment rencontrée aussi bien in vitro qu’in vivo. La microscopie électronique montre que les changements structurels de l’apoptose se déroulent en trois étapes distinctes. La première étape comprend un arrondissement et la condensation de la cellule, la rétraction des pseudopodes, la réduction du volume cellulaire (pycnose) ainsi que la condensation de la chromatine. La deuxième étape également appelée étape de fragmentation comprend : la fragmentation nucléaire (caryorrhexie), peu ou pas de modifications ultra-structurales des organites cytoplasmiques et le bourgeonnement de la membrane plasmique en corps apoptotiques (zéose). Enfin, la troisième étape correspond, in vivo, à l’élimination par les phagocytes résidents. En absence de prise en charge par les macrophages, les corps apoptotiques finissent in vitro, par gonfler et perdre leur intégrité membranaire. On parle alors de nécrose secondaire [Kerr et al. 1972]. Il est également important de signaler que lors d’une mort cellulaire par apoptose, l’intégrité de la membrane plasmique est conservée tout au long du processus.
L’autophagie est ainsi décrite par une absence de condensation de la chromatine, une vacuolisation massive du cytoplasme, une accumulation de vésicules à double membrane (nommées autophagosome) et in vivo à une faible prise en charge par les cellules phagocytaires [Debnath et al. 2005; Klionsky et al. 2008; Klionsky et al. 2011]. La nécrose est généralement, quant à elle, définie par un gonflement (swelling) des organites ou de la cellule, également appelé oncose (pour gonflement en grec), puis par la rupture des membranes et un déversement du contenu intracellulaire avec une condensation modérée de la chromatine [Majno et al. 1995; Lemasters 2005; Golstein et al. 2007; Van der Meer et al. 2010].
De toutes les morts cellulaires, l’apoptose a d’abord été étudiée pour ces changements morphologiques caractéristiques. Ces études ont ensuite été élargies afin de mieux comprendre l’implication et la régulation des modifications biochimiques qui conduisent au démantèlement ordonné et séquentiel de la cellule.
Modifications biochimiques
Les mécanismes de l’apoptose sont très complexes et sophistiqués, impliquant une cascade d’événements moléculaires. En général, on décrit deux voies de l’apoptose : la voie extrinsèque ou des récepteurs de mort et la voie intrinsèque médiée principalement par les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Cependant, il est maintenant prouvé que les deux voies sont liées et que les molécules dans une voie peuvent influencer l’autre [Igney et al. 2002].
Les voies extrinsèque et intrinsèque diffèrent dans l’implication de caspases initiatrices et de molécules d’adaptation distinctes, mais convergent sur la même voie d’exécution. Cette voie est initiée par le clivage de la caspase-3 et résulte en la fragmentation de l’ADN, la dégradation des protéines nucléaires et du cytosquelette, la réticulation des protéines, la formation de corps apoptotiques et l’expression de ligands pour les cellules phagocytaires [Elmore 2007]. Les caspases (« cysteine-aspartic protéases ») sont des protéases à cystéine cruciales pour l’apoptose des cellules eucaryotes. Leur suppression par recombinaison homologue a révélé des fonctions importantes dans l’apoptose, dans la maturation des cytokines et dans la croissance et la différenciation cellulaire [Wang et al. 2000]. Les caspases sont synthétisées sous forme zymogène contenant un prodomaine et un domaine protéase. Elles clivent des protéines cibles au niveau d’un résidu aspartate spécifique, ce sont les trois résidus d’acides aminés qui se trouvent en amont qui permettent de déterminer la reconnaissance spécifique du substrat. Une fois que les caspases sont activées, il semble y avoir un engagement irréversible vers la mort cellulaire.
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Table des matières
CHAPITRE I : Introduction
1. Mort cellulaire programmée et apoptose
1.1. Généralités
1.2. Modifications morphologiques
1.3. Modifications biochimiques
1.4. Apoptose : fonctions physiologiques et pathologiques
2. Phagocytose et élimination des cellules apoptotiques
2.1. Généralités
2.2. Modifications de surface
2.3. Molécules de reconnaissance
2.4. Signalisation intracellulaire
3. Cellules apoptotiques et réponse immunitaire
4. Cellules apoptotiques et C1q
4.1. Généralités
4.2. C1q et reconnaissance des cellules apoptotiques
5. Le double jeu de la calréticuline
5.1. Généralités
5.2. Calréticuline et phagocytose des cellules apoptotiques
6. Résultats à la base du projet et objectifs du travail
CHAPITRE II : Matériel et Méthodes
1. Biologie cellulaire
1.1. Lignées et cultures cellulaires
1.2. Transfection des cellules
1.2.1. Principe
1.2.2. Transfection d’ADN
1.2.3. Transfection d’ARN interférents (ARNi)
1.3. Induction de l’apoptose
2. Biologie moléculaire
2.1. Matériel de biologie moléculaire
2.2. Construction des différents plasmides codant pour une calréticuline de fusion
2.2.1. Construction du plasmide psig-EGFP-CRT-C1 codant pour psig-GFP-CRT
2.2.2. Construction du plasmide psig-CRT-EGFP-N1 codant pour psig-CRT-GFP
2.2.3. Construction du plasmide psig-CRT-SNAP-N1 codant pour psig-CRT-SNAP
2.3. Construction du plasmide codant pour GST-ERp57 et certains de ses domaines
3. Analyses biochimiques
3.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
3.1.1. Préparation des échantillons
3.1.2. Préparation du gel d’électrophorèse
3.2. Techniques de transfert sur membrane
3.3. Spectrométrie de Masse
4. Analyses immuno-cytochimiques
4.1. Analyse par microscopie
4.1.1. Marquage par immunofluorescence indirecte
4.1.2. Utilisation d’une protéine fluorescente
4.1.3. Marquage par étiquette protéique (tag protéique)
4.2. Analyse par cytométrie en flux
4.2.1. Principe de la cytométrie en flux
4.2.2. Marquages pour la cytométrie en flux
5. Analyses fonctionnelles
5.1. Mesure de l’apoptose
5.2. Expériences de phagocytose
5.3. Obtention des surnageants de phagocytose pour l’analyse des cytokines
6. Obtention des protéines d’intérêt
6.1. Purification d’une protéine plasmatique : C1q et ses domaines
6.2. Préparation des protéines cellulaires
6.2.1. Préparation des lysats cellulaires
6.2.2. Dosage des lysats cellulaires
6.2.3. Libération des protéines en interaction avec la membrane externe des cellules par une technique dite de « shaving »
6.3. Purification des protéines recombinantes
6.3.1. Calréticuline entier et ses différents domaines
6.3.2. ERp57 entière et ses différents domaines
6.4. Détermination de la concentration des protéines purifiées
7. Interactions protéiques
7.1. Mesure d’un signal de FRET
7.1.1. Principe
7.1.2. Obtention d’un signal de FRET
7.2. Analyse par co-immunoprécipitation
7.3. Analyse par dosage immuno-enzymatique
7.4. Analyse par Biacore/SPR
7.4.1. Principe du Biacore
7.4.2. Immobilisation des ligands sur la sensor chip CM5
7.4.3. Conditions expérimentales des interactions
7.4.4. Analyses cinétiques des interactions
8. Anticorps utilisés
9. Principaux tampons et solutions
CHAPITRE III : Résultats
1. Mise en évidence d’une interaction directe entre la calréticuline et la région globulaire de C1q à la surface des cellules apoptotiques
1.1. Stratégies mises en place pour la détection d’une interaction par FRET
1.1.1. Expression d’une calréticuline en fusion avec la GFP
1.1.2. Expression d’une calréticuline en fusion avec SNAP
1.1.3. Conclusion
1.2. Détection d’une interaction par FRET
1.2.1. Définition des zones de photoblanchiment
1.2.2. Mesure des efficacités de FRET
1.2.3. Conclusion
1.3. Bilan
2. Caractérisation de la calréticuline de surface
2.1. Analyse des conditions de rétention de la calréticuline à la surface
2.2. Analyse de la présence de la séquence KDEL en position C-terminale sur la calréticuline de surface
2.3. Bilan
3. Etude fonctionnelle de l’interaction C1q-calréticuline au cours de la phagocytose
3.1. Développement d’un test de phagocytose
3.1.1. Les cellules phagocytaires
3.1.2. Etat d’apoptose des cellules phagocytées
3.1.3. Effet de C1q
3.1.4. Niveau d’expression de la calréticuline des cellules phagocytées
3.2. Etude de l’effet de C1q et de la calréticuline sur la phagocytose des THP-1-m
3.2.1. Phagocytose de cellules HeLa partiellement déplétées en calréticuline
3.2.2. Phagocytose de cellules MEF déficientes en calréticuline
3.3. Impact de C1q sur la phagocytose de monocytes humains purifiés
3.4. Bilan des tests de phagocytose
4. Etude de l’interaction C1q-calréticuline sur la réponse inflammatoire
4.1. Analyse de la production de cytokines par les cellules de notre modèle
4.2. Influence de la phagocytose des cellules HeLa ARNi sur l’expression de cytokines par les THP-1-m
4.3. Analyse de la production de cytokines produites par les THP-1-m suite à la phagocytose de cellules MEF déficientes ou non en calréticuline
4.4. Bilan de la modulation des cytokines
5. Mise en évidence d’un nouveau partenaire potentiel de C1q pouvant jouer un rôle dans la phagocytose
5.1. Colocalisation d’ERp57 et de la calréticuline avec C1q à la surface des cellules HeLa
5.2. Mise en évidence d’une interaction in vitro entre C1q et ERp57
5.3. Détermination du site d’interaction d’ERp57 avec C1q
5.3.1. Production et purification des différents domaines d’ERp57
5.3.2. Expériences d’interaction in vitro
5.4. Bilan
CHAPITRE IV : Discussion et perspectives
1. La calréticuline et C1q, des protéines partenaires complexes
1.1. La calréticuline de surface, encore mystérieuse
1.2. La calréticuline et les régions globulaires de C1q sont partenaires à la surface des cellules en apoptose précoce
2. La calréticuline et C1q influencent la phagocytose et le statut inflammatoire
2.1. Questions posées par le modèle des cellules apoptotiques
2.2. Questions posées par les cellules phagocytaires
3. Pour la suite
4. Le mot de la fin
Conclusion
Annexes
