Soutenance mémoire
« La vie, ce concept mystérieux, est ramenée à la présence d’ADN. Il n’y a plus de frontière entre matière animée et inanimée. Tout n’est qu’une question de degré de complexité. » . Albert Jacquard, Extrait d’une Conférence du 10 Avril 2001.
L’ADN
Du plus petit micro-organisme à l’homme, de la bactérie à la baleine, en passant par les plantes et les fruits, tous les êtres vivants sans exception, possèdent leurs informations génétiques codées dans un langage universel au sein de l’Acide Désoxyribonucléique (ADN).
Historique
L’histoire de l’ADN commence avec Gregor Mendel en 1865. Moine botaniste tchèque devenu le père de la génétique actuelle, il démontra grâce à ses expériences sur les pois, que les traits de l’hérédité étaient fondés sur des lois spécifiques. En 1869, un jeune scientifique suisse du nom de Friedrich Miescher, isolait pour la première fois une substance inconnue riche en phosphore. Issu du noyau (anglais nucleus, pluriel nuclei) de globules blancs, il baptisa ce composé ‘nucléine’ – un terme toujours conservé dans la dénomination actuelle de l’Acide désoxyribonucléique (ADN). Les constituants de la nucléine sont par la suite découverts : des bases azotées au nombre de quatre, un sucre pentose et des substituants phosphates. En 1929, un biologiste anglais, Frederick Griffith, postula qu’un « facteur transformant » pouvait être libéré par des bactéries et intégré par d’autres, conférant alors à ces dernières de nouvelles propriétés héréditaires issues des bactéries donneuses. Cette découverte a donné lieu à une scission dans la communauté scientifique. Certains biologistes pensent en effet que l’hérédité induite par ce facteur transformant est supportée par du matériel protéique, alors que d’autres penchent eux pour un support d’origine nucléique, l’ADN. C’est Oswald T. Avery qui trancha et clôtura ce débat. Il démontra en 1944, que ce facteur transformant était également le support de l’information génétique : l’ADN. Moins de 10 ans plus tard, la structure spatiale de l’ADN en « double hélice » était résolue par James D. Watson et Francis Crick, découverte dont on fête cette année les 60 ans.
Structure et fonction de l’ADN
L’ADN est une macromolécule biologique appartenant à la classe chimique des polymères dont les nucléotides sont les monomères de bases. Ils résultent de la combinaison en quantité équimolaire d’un groupement phosphate, d’un pentose (le 2-désoxy-D-ribose) et d’une base azotée à noyau purique (Adénine, Guanine) ou pyrimidique (Thymine ou Cytosine) désignée par les lettres A, T, C, G.
Structures secondaires
La structure en double hélice de l’ADN découverte par Watson et Crick appelée conformation B, est une des structures polymorphes de l’ADN existant dans le vivant. On en dénombre 21, chacune désignée par une des 26 lettres de l’alphabet. Seules 5 lettres, F, Q, U, V et Y ne caractérisent aucune conformation. Les différents polymorphes de l’ADN sont caractérisés par leurs structures (duplex, triplex, quadruplex), leur sens d’enroulement (gauche ou droite) et le pas d’enchaînement des bases. Trois des 21 conformères de l’ADN sont majoritaires dans le vivant : les polymorphes de type B, A et Z. Leurs propriétés sont détaillées ci-dessous.
La conformation B
La conformation B est la structure secondaire décrite par le modèle de Watson et Crick. C’est la forme prédominante de l’ADN dans les systèmes biologiques. C’est une hélice droite de pas égal à 3,4 nm (10 paires de bases par tour). Les bases sont inclinées de 1° par rapport au plan formé par une paire de bases et la distance entre deux plans successifs est de 0,34 Å. La chaîne hydrophile sucre-phosphate des brins d’ADN est orientée vers l’extérieur de la double hélice, alors que les bases plus hydrophobes, sont orientées vers le cœur perpendiculairement à l’axe de l’hélice. Elles s’empilent parallèlement les unes par rapport aux autres. L’attachement dissymétrique des bases au squelette sucre-phosphate de chaque brin et la position de l’axe de l’hélice au centre de chaque paire de base induisent la formation de deux sillons distincts dans la double hélice : le grand sillon et le petit sillon .
La conformation Z
Caractérisée pour la première fois dans les années 1970, la conformation Z est une conformation secondaire locale d’un duplex d’ADN possédant une région de composition alternée de bases purine-pyrimidine (ex G-C-G-C). Dans cette conformation, les bases puriques adoptent une conformation syn . L’enchaînement de nucléosides syn puriques-anti pyrimidiques entraîne la formation d’un enroulement gauche en zigzag des deux brins d’ADN. Le pas est de 4,5 nm par tour (12 paires de bases par tour). L’inclinaison des plans des bases est de 9° et la distance entre deux plans est de 0,37 nm. Un ADN de conformation Z est donc plus étendu que le B (ADN). Il ne possède qu’un seul type de sillon, similaire au petit sillon de la conformation B . Dans cet ADN zigzag, les groupements phosphates sont plus proches. Il est donc nécessaire d’augmenter la concentration saline afin de stabiliser la conformation du Z-(ADN). En effet, la présence de sels, en particulier des cations, masque la charge globale de ce polymorphe et réduit ainsi fortement les répulsions électrostatiques entre groupements phosphates. Cette conformation semble jouer un rôle dans l’expression et la régulation des gènes. En effet, 80% des sites d’initiation de la transcription du chromosome 22 de l’homme adoptent une conformation de type Z-(ADN). D’autres études ont montré que les séquences d’ADN de type Z ont le potentiel d’augmenter la fréquence de recombinaison, délétion et translocation de gènes dans les systèmes cellulaires.
Ces trois polymorphes d’ADN A, B et Z sont des structures appartenant à la famille des duplex. L’ADN peut cependant s’arranger en suprastructure et adopter des arrangements spatiaux tertiaires dépendant de l’environnement chimique et de la séquence des bases qui le composent.
Structures tertiaires
La famille des triplex d’ADN
C’est en 1957 que la première triple hélice a été caractérisée . Une triple hélice est composée d’une molécule d’ADN bi-caténaire et d’un troisième brin nucléotidique. Celuici s’apparie au duplex par le grand sillon de l’ADN via la formation de liaisons hydrogène aux sites accepteurs et donneurs des bases puriques du duplex. Cet appariement peut être soit parallèle soit antiparallèle à l’axe de la double hélice. On définit l’appariement parallèle et antiparallèle selon l’orientation 5’p-3’OH du mono brin d’ADN par rapport à la double hélice. On parle d’appariement antiparallèle lorsque qu’un brin à motif « puriques » (A ou G) ciblera les motifs puriques (A et G) du duplex par la formation de liaisons hydrogène de Hoogsteen . À l’inverse, on parlera d’appariement parallèle lorsqu’un troisième brin à motifs « pyrimidiques » (T ou C) ciblera les bases puriques (A ou G) du duplex via des liaisons hydrogène de Hoogsteen inverse. Ceci nécessite la protonation de l’azote de la cytosine contenue dans le brin monocaténaire .
|
Table des matières
Introduction Générale
Chapitre I
I L’Acide Désoxyribonucléique
I.1 Historique
I.2 Structure et fonction de l’ADN
I.1.1 Structure primaire
I.1.2 Structures secondaires
I.1.2.1 La conformation B
I.1.2.2 La conformation A
I.1.2.3 La conformation Z
I.1.3 Structures tertiaires
I.1.3.1 La famille des triplex d’ADN
I.1.3.2 Quadruplex et i-motif
I.2 De la cellule à l’être vivant
I.3 L’ADN en (inter)action
I.3.1 Reconnaissance de l’ADN par des protéines
I.3.1.1 Les protéines, en bref
I.3.1.2 Interactions protéines-ADN
I.3.2 Reconnaissance par des oligonucléotides
I.4 ADN, cible thérapeutique
I.4.1 Les acides nucléiques peptidiques
I.4.2 Les complexes métalliques
I.4.2.1 Les complexes de Pt(II)
I.4.2.2 Les complexes de Pt(IV)
I.4.2.3 Autres complexes métalliques
I.5 ADN et sondes
I.5.1 Phénomène d’intercalation
I.5.2 Les complexes de reconnaissance intercalant de l’ADN
II LES LANTHANIDES
II.1 Historique
II.2 La chimie des lanthanides
II.2.1 Propriétes spectroscopiques des lanthanides
II.2.2 Propriétés magnétiques des lanthanides
II.2.3 Propriétés de luminescence
II.2.3.1 Définition
II.2.3.2 La luminescence des lanthanides
II.2.3.3 Sensibilisation et effet d’antenne
II.3 Exploitation des propriétés des lanthanides
II.3.1 Applications industrielles
II.3.2 Applications pour le vivant
II.3.2.1 Exploitation des propriétés magnétiques
II.3.2.2 Exploitation des propriétés de luminescence
II.4 Lanthanides et peptides
II.4.1 Interaction des lanthanides avec les sites à calcium des protéines
II.4.2 Insertion des lanthanides dans des peptides
II.4.2.1 Les complexes de lanthanides bioconjugués
II.4.2.2 Les peptides liant les lanthanides par les chaînes latérales des acides aminés
II.4.2.3 Hexapeptides incorporant des acides aminés chélatants non naturels
II.4.3 Élaboration de complexes peptides-lanthanides pour détecter l’ADN
Chapitre II Elaboration et Synthèse des sondes
I Les noyaux intercalants
I.1 La proflavine
I.1.1 Comme sensibilisateur ?
I.1.2 Comme intercalant ?
I.2 Le naphthalimide
I.2.1 Comme sensibilisateur ?
I.2.2 Comme Intercalant ?
II De P22 aux sondes Intercalant-P
II.1 Sondes de première génération
II.2 Sondes de deuxième génération : Introduction d’un espaceur
II.3 Sonde de troisième génération : peptide de haute denticité
II.4 Sonde de troisième génération : Noyau naphthalimide à cycle étendu
III Synthèse et caractérisation des sondes
III.1 Stratégie
III.1.1 Synthèses des intercalants
III.1.1.1 Synthèse du dérivé proflavine 3
III.1.1.2 Synthèse du dérivé naphthalimide 5
III.1.1.3 Synthèse du dérivé thiazolonaphthalimide 10
III.1.1.4 Synthèses des acides aminés non naturels
III.1.2 Synthèse des peptides
III.2 Caractérisation
Chapitre III Complexation de l’Europium
I Sonde de première génération : complexation de l’europium
I.1 Effet d’antenne dans les complexes de première génération
I.2 Spéciation et stabilité des complexes
I.2.1 Spectrométrie de masse
I.2.2 RMN
I.2.3 Dosage par luminescence
I.2.4 Constantes de stabilité conditionnelles à pH 7
I.3 Fluorescence des complexes EuP1 et EuN1
I.4 Emission de luminescence : et par rapport à P22 ?
I.5 Temps de vie
I.5.1 Nombre d’hydratation
I.5.2 Temps de vie à basse température et transfert en retour
II Sonde de deuxième génération : effet de l’espaceur glycine
II.1 Influence sur la spéciation et la stabilité
II.2 Influence sur les propriétés d’émission
II.2.1 Luminescence
II.2.2 Temps de vie
III Sonde de troisième génération
III.1 Peptide octadentate P3
III.1.1 Complexation de l’europium
III.1.2 Temps de vie et stabilité
III.1.3 Luminescence de l’europium
III.1.4 Luminescence dans l’infra rouge
III.2 Peptide dérivé du naphthalimide à cycle étendu N3
III.2.1 Sensibilisation
III.2.2 Temps de vie
III.2.3 Spéciation et stabilité
Chapitre IV Interaction avec l’ADN
I Comment mesurer l’interaction avec l’ADN ?
I.1 Absorbance
I.2 Température de fusion ou température de dénaturation
I.3 Luminescence
I.4 Modèle d’interaction utilisé
I.5 Choix de l’ADN
II Interaction des dérivés naphthalimides avec l’ADN
II.1 Naphthalimide
II.2 Sondes EuN1 et EuN2
II.2.1 Température de fusion
II.2.2 Luminescence
II.3 Sonde EuN3
II.3.1 Température de fusion
II.3.2 Luminescence
III Interaction des dérivés proflavines avec l’ADN
III.1 La proflavine
III.2 Sondes EuP1 et EuP2
III.2.1 Absorbance et température de dénaturation de l’ADN
III.2.2 Luminescence
III.3 Sonde EuP3
III.3.1 Absorbance et température de fusion
III.3.2 Luminescence
IV Sélectivité
IV.1 Choix de l’ADN
IV.2 Sélectivité et complexe EuP1
Influence de l’espaceur glycine sur la sélectivité
V Conclusion
Chapitre V Conclusions
