Reconnaissance chirale et énantiosélectivité par voie électrocinétique

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Reconnaissance chirale et énantiosélectivité par voie électrocinétique

Règle des trois points d’attache (Easson et Stedman)

Bien que le mécanisme de discrimination chirale ne soit pas encore bien maitrisé, une théorie basée sur la règle des trois points permet de décrire les interactions nécessaires entre les énantiomères et le sélecteur pour obtenir une séparation chirale. Le mécanisme d’interaction chirale-chirale entre le couple d’énantiomères et le sélecteur chiral fait intervenir trois sites interactifs (Figure 2). La clef de la séparation énantiomérique et de la reconnaissance chirale est basée sur la formation de complexes diastéréoisomériques réversibles via trois points d’attache entre le sélecteur chiral et au moins un des deux énantiomères. Ainsi, en électrophorèse, la séparation des énantiomères est due à leur différence de mobilités électrophorétiques une fois complexés avec le sélecteur chiral.

En 1933[3], Easson et Stedman furent les premiers à proposer le modèle des trois points d’attache pour illustrer le modèle de reconaissance chiral. Par la suite, les premières séparations chirales d’acides aminés aromatiques ont été obtenues sur papier chromatographique par Dalgliesh[4] et Kotake[5].

Dans le mécanisme de reconnaissance chirale basé sur le modèle à trois points, il semble que les interactions de types soient les plus importantes. Ainsi la position et la nature attractrice ou donneuse des groupements polaires autour du centre stéréogénique est déterminante dans l’ordre d’élution des énantiomères en chromatographie chirale. Les trois interactions doivent se passer entre trois substituants de l’isomère optique à séparer et des groupements spécifiques présents sur le sélecteur chiral. Parfois, il arrive néanmoins qu’un type d’interactions peut, de par sa grande force, compenser les deux autres interactions nécessaires à la discrimination des isomères, ou bien il se peut que les deux autres interactions manquantes dans le modèle de Easson et Stedman se produisent sur une ligne ou un plan axial chiral. Ainsi, le complexe d’inclusion stérique avec la cyclodextrine compte plusieurs interactions. De même lorsque le complexe réversible est formé, on peut retrouver parfois des interactions supplémentaires de types dipolaires (électrons donneurs, électrons accepteurs) ou liaison hydrogène selon les groupements fonctionnels modifiant la CD. On parle donc de modèle géométrique des trois points d’attache. Néanmoins dans la littérature, certains auteurs[6] discutent de quatre points d’attache au minimum (Figure 3) et d’autres[7] décrivent des CSPs à base d’acides aminés où l’ordre d’élution des énantiomères ne respecte pas systématiquement le modèle de reconnaissance chirale à trois points d’attache qui suppose que la localisation des substituants porteurs de groupements électroattracteurs sur le sélecteur chiral influence l’ordre d’élution des énantiomères porteurs de groupements électro-donneurs en chromatographie.

Interaction stéréospécifique entre sélecteurs et énantiomères

Bien que le mécanisme de reconnaissance chirale reste encore ambigu, nous pouvons étudier l’effet de certaines forces intermoléculaires pour essayer de comprendre le mécanisme de séparation chirale. En effet, lors d’une séparation énantiosélective, les interactions présentes entre les énantiomères et le sélecteur chiral sont de différentes natures. Le tableau I regroupe les principales forces intermoléculaires et leur degré d’intensité. Les forces les plus importantes sont celles de nature électrique (Forces de Coulomb) ainsi que la force issue de la gêne stérique (cavité de la cyclodextrine, éther couronne chiral).

Cependant, parmi les interactions listées ci-dessous, ce ne sont pas forcément les plus intenses qui sont responsables de la reconnaissance et de la séparation chirale :

• L’attraction moléculaire liée à la labilité de la liaison hydrogène fait intervenir un atome d’hydrogène polarisé positivement (groupe hydroxyle et amine) avec un atome d’oxygène et/ou d’azote polarisé négativement (groupe hydroxyle et amine).

• Les forces dues aux électrons π délocalisables, présents dans les groupes aromatiques, interagissent de façon à ce qu’il y ait des électrons dits π attracteurs et d’autres dits π donneurs.

Les électrons π attracteurs sont ceux présents dans les structures aromatiques possédant des substituants riches en électrons délocalisables tels que les groupements nitrates (-NO2), cyano (CN) et les électrons π donneurs sont ceux présents sur les groupements naphtyles ou ceux des substituants méthyles des groupes aromatiques. L’interaction π-π est attractive, elle implique des groupements électroniques de type donneur et accepteur présents sur les sélecteurs chiraux et les solutés à séparer.

• Parmi les forces dipolaires attractives listées dans le tableau ci-dessus, celles impliquant un moment dipolaire et une charge électrique (Ion-Dipôle) sont les plus importantes.

• Les forces de Van der Waals sont les forces moléculaires les plus faibles intervenant dans l’énantioséparation, mais elles ne sont pas à négliger dans certains cas.

• La gêne stérique provient du fait qu’un volume spatial ne peut être occupé par aucun type ou groupe d’atomes en raison de l’espace déjà encombré par d’autres groupes d’atomes. Si les deux groupes sont proches dans l’espace, la force répulsive aura tendance à augmenter. La force répulsive est autant impliquée que la force attractive dans les interactions stéréospécifiques.

Complexe diastéréoisomérique et énantiosélectivité

Pour bien comprendre le mécanisme de reconnaissance chirale impliquant les différentes forces moléculaires citées ci-dessus, nous devons nous pencher sur la structure exacte et la configuration spatiale du sélecteur chiral. Certains modèles moléculaires mathématiques permettent de prédire l’association d’un complexe « molécule chirale-sélecteur chiral » mais nous ne nous y intéresserons pas. Cependant en chromatographie, il est possible de comprendre et de définir le type des interactions responsables de la séparation chirale en observant les effets des groupements substituants présents sur le sélecteur chiral et sur les énantiomères à séparer. En effet toutes les forces intermoléculaires impliquant l’énantiomère et le sélecteur chiral font intervenir un complexe énantiomère-sélecteur chiral caractérisé par une constante d’équilibre de complexation K. Ainsi, la reconnaissance chirale d’un couple d’énantiomères notés AR et AS, par une CSP noté S, peut être décrite de façon simple selon les équilibres thermodynamiques[9] décrits ci-dessous : S+ =S. + =S. \=[ ]et=[ ]

En pratique, les CSPs possèdent également des sites non chiraux qui interviennent dans la formation du complexe influençant la rétention des racémiques injectés. De plus, afin de favoriser les forces intermoléculaires ayant lieu entre les solutés et le sélecteur chiral immobilisé, il est important de connaitre l’hydrophobicité des phases stationnaires. Ainsi en milieux aqueux on favorisera, selon la taille et l’hydrophobicité des solutés, l’inclusion partielle des groupements hydrophobes tels que les aromatiques, naphtyles ou l’inclusion de l’entité énantiomèrique dans la cavité des β-CDs. Tandis que dans en milieu moins polaire, on favorisera d’autres intéractions que celles du complexe d’inclusion. Afin de renforcer les interactions stéréospécifiques et optimiser les séparations chirales en chromatographie et en électrochromatographie, il est possible d’ajuster les paramètres opératoires comme la nature de la phase mobile, sa composition, le pH du milieu, la force ionique etc.

Le facteur d’énantiosélectivité est le rapport (α > 1) des deux constantes d’équilibre KR et KS. Ce facteur désigne la capacité d’un sélecteur à interagir majoritairement avec un énantiomère tandis que l’énantiospécificité d’un sélecteur désigne l’incapacité de l’un des énantiomères à interagir avec le sélecteur chiral. Le tracé de la courbe de Van’t Hoff, ln( ) = (1), contient les variations enthalpiques ∆ i et entropiques ∆ i des interactions pour chaque énantiomère i complexé avec le sélecteur. Ces variations d’énergie sont exprimées par les équations ci-dessous[10]: 22 ∆ ° =∆ ° − . ∆ ° et = − ∆ + ∆ + ln ɸ ɸ est la fraction entre le volume de la phase stationnaire et le volume de la phase mobile.

Donc ∆(∆ °)R,S= ∆ °S-∆ °R = -R.T ln = -R.T ln(α)

Selon la loi de Van’t Hoff, le logarithme népérien du facteur de rétention K des solutés à analyser est une fonction inverse de la température T. De la même façon l’énantiosélectivité α varie inversement de la température. Ainsi, pour chaque racémique injecté, il est judicieux de tracer la fonction ln(α)=f (1/T) afin de travailler aux températures optimales pour les séparations chirales. Sélecteurs chiraux en CEC

Les sélecteurs chiraux les plus communément retrouvés dans la littérature sont les polysaccharides naturels et leurs dérivés comme l’amylose, la cellulose (chiralpak©, chiracel©) et les cycloamyloses appelées cyclodextrines (CDs). La CD est de loin le sélecteur chiral le plus utilisé en CEC. Ces sélecteurs chiraux ont l’avantage d’être présents en abondance et d’être abordables (3$/kg). Leurs dérivés sont en revanche beaucoup plus couteux (200$/g). Néanmoins, il existe une autre stratégie qui préfère utiliser des antibiotiques, des macrocycles, des peptides, des polymères ou de plus petites molécules (Pirkle, échangeur de ligand) en tant que sélecteurs chiraux pour la résolution des énantiomères en chromatographie liquide et en CEC.

Nous pouvons classer les sélecteurs chiraux en deux catégories. Ceux qui sont dits « conventionnels » et ceux qui sont dits « sur mesure ».

Sélecteurs sur mesures

Les polymères à empreintes moléculaires (MIPs)

Les polymères à empreintes moléculaires (MIPs) sont en général des monolithes organiques avec l’empreinte de l’énantiomère pur incorporé dans le support monolithique. On trouve également des MIPs à base de monolithes de silice qui sont des candidats idéaux pour préparer des CSPs. Les MIPs sont obtenus de la même façon que les monolithes polymères organiques sauf que la molécule « empreinte » n’est pas liée de façon covalente au réseau polymére afin de facilement l’extraire avant nos analyses. Leurs préparations nécessitent l’emploi de monomères fonctionnels, d’une molécule empreinte chirale (acides aminés, médicaments non stéreoïdaux, drogues, pesticides et peptides) d’agents réticulants, d’amorceurs radicalaires et de solvants porogéniques. Une fois la copolymérisation effectuée, la molécule empreinte est extraite du réseau et laisse place à une cavité stéréospécifique (Figure 4). Ainsi les molécules empreintes ne doivent pas être trop volumineuses afin d’être facilement extraites du réseau polymère. La spécificité de ce type de sélecteur est intéressante mais les interactions étant principalement stériques, elles dépendent de la structure des autres molécules à séparer. Ce type de chromatographie est de nos jours très utilisé pour l’étude du bio-mimétisme et permet ainsi de mimer l’activité enzymatique « in vivo » ou pour d’autres applications visant à détecter des traces d’explosifs, biomolécules et produits stupéfiants.

La très haute spécificité de ce type de sélecteur est à son désavantage. Citons quelques exemples d’applications des MIPS en chromatographie chirale :

Un des pionniers de cette technique en séparation chirale est le Pr. Jun Matsui[12]. Il synthétisa en 1993, par polymérisation thermique un MIP chiral in-situ à base d’acide méthacrylique, d’éthylène diméthacrylate (EDMA) et de phénylalanine anilide dissous dans du cyclohexanol et dodécanol en présence d’un amorceur radicalaire. L’équipe de Huang[13] synthétise des MIPs pour la chromatographie liquide chirale et sépare ainsi les énantiomères d’acides aminés et les diastéréoisomères d’alcaloïde (cinchona) à l’aide d’empreintes moléculaires telles que le N-(carbobenzyloxy)-L-tryptophane (Cbz-L-Trp), le Fmoc-L-Tryptophane (Fmoc-L-Trp), la cinchonine, la cinchonidine, la quinidine, la quinine et la (-)norépinéphrine[14]. L’équipe de Liu[15], de la même façon, utilise le (R)-1,1’-bi-2,2’naphtol pour séparer les deux énantiomères du binaphtol en CEC avec pression assistée monodirectionnelle. L’équipe de Junjie Ou[16] utilise une technique similaire pour la chromatographie liquide avec comme empreintes moléculaires, le (S)-(-)-1,1’-bi-2-naphtol et le (R)-(+)-5,5’, 6,6’, 7,7’, 8,8’-octahydro-1,1’-bi-2-naphtol. Dans ce cas, le monomère fonctionnel est la 4-vinylpyridine qui copolymérise avec l’EDMA. L’équipe de Junfa Yin[10] sépare en chromatographie liquide, les énantiomères de la Natéglinide avec un MIP possédant une distribution bimodale (mésopores et macropores) à base de L-Nateglinide. L’équipe de Zaidi et Cheong utilise des MIPs à base de multiples dérivés de camphor[17], de S-Ofloxacin[18] pour des applications en OT-CEC. D’autres monolithes en OT-CEC chirale ont été décrits de la même façon à base de (S)-kétoprofène[19].

Les aptamères

Les aptamères sont des oligonucléotides simples brin d’ADN ou d’ARN de courtes tailles, capables de fixer spécifiquement un ligand par de très grandes affinités similaires à celles des anticorps pour leurs cibles prédéterminées. Ainsi Ellington et Szostak[20] sont à l’origine de cette appellation, « aptamère », lors de leur utilisation en chimie combinatoire pour des applications biochimiques en chromatographie et en électrophorèse. Ces molécules permettent de générer des banques de sélecteurs chiraux hautement spécifiques aux énantiomères cibles (α >1000). Depuis 2002, les aptamères en série ADN et ARN sont employés en tant que sélecteurs chiraux dans une technologie de séquençage appelée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). L’utilisation des aptamères en tant que phases stationnaires offre plusieurs avantages en chromatographie d’affinité et pour la préparation de biocapteurs. Parmi ces avantages nous retrouvons la facilité des techniques de synthèse, la stabilité en milieu physiologique et la capacité des aptamères à être attachés à la surface via le couplage Biotine-Streptavidine. L’équipe de Rehder[21] greffe des aptamères en surface de capillaire avec une structure appelée G-quadruplex (G4) pour séparer en OT-CEC, huit protéines originaires de lait bovin dont la β-lactoglobuline, α-caséine, β-caséine, α-lactalbumine dans les conditions de température et pH physiologiques. Les aptamères présentent des affinités et spécificités comparables à celles des anticorps pour des molécules complexes comme les cellules cibles, les acides nucléiques, les antibiotiques. Ils servent aussi à séparer de manière énantiosélective de petites molécules comme les acides aminés (citrulline, arginine, histidine et tryptophane), les nucléosides (adénosine, tyrosinamide) ainsi que de plus grosses molécules comme les hormones peptidiques (vasopressine) par exemple. En raison du coût élevé de ce type de sélecteur chiral, les applications de ces oligonucléotides sont limitées aux systèmes miniaturisés comme en µ-LC[22, 23] et en CE[24].

Sélecteurs conventionnels

Les glycopeptides macrocycliques (ou antibiotiques)

Les glycopeptides ou antibiotiques sont d’excellents sélecteurs chiraux qui sont souvent utilisés pour séparer les acides aminés. Ils furent utilisés en 1994 par Armstrong[25] dans les séparations de certains acides aminés en HPLC. Les antibiotiques les plus remarquables dans l’énantioséparation des acides aminés sont la vancomycine, la ristocétine, la teicoplanine et leurs dérivés. Ces sélecteurs possèdent tous de nombreux sites chiraux, des groupements alcools, des cycles aromatiques, des groupements polaires et apolaires ainsi que des sites mono ou bi-chargés. Ces sites vont interagir selon les forces citées dans le tableau I et permettre de complexer et séparer des composés racémiques en CEC et avec d’autres méthodes chromatographiques.

La vancomycine ainsi que d’autres glycopeptides (vancomycine-aglycone, norvancomycine, teïcoplanine, teïcoplanine-aglycone, ristocétine, thiostrepton A, rifamycine, kanamycine, streptomycine, fradiomycine, et avoparcine) sont des molécules relativement grosses (Figure 5) et possèdent de nombreux sites chiraux entourés de différents groupes d’hétéroatomes. Ces nombreuses fonctionnalités chimiques permettent, aux interactions attractives avec au moins trois points d’attache sur l’énantiomère à séparer, de se produire. Des colonnes CSPs commerciales pour l’HPLC (ChirobioticTM) sont d’ailleurs préparées à partir de cette famille de sélecteurs. Ces dernières années, des auteurs ont décrit la préparation de colonnes monolithes à base de glycopeptides [26-28] pour l’emploi en CEC chirale. L’équipe de Hsieh[29] a synthétisé un monolithe de silice chiral à base de vancomycine en une étape. Ils décrivent de très bonnes résolutions (Rs > 7) en CEC lors de la séparation de la thalidomide et d’autres β-bloquants. Un autre dérivé anionique d’antibiotique, nommé clindamycine–phosphaté a aussi servi pour produire des CSPs sur colonnes monolithes en CEC[30]. Les auteurs séparent six racémiques basiques mais aussi acides sur un monolithe polymère poreux revêtu de zirconium et fonctionnalisé par un antibiotique phosphaté. Les structures complexes des antibiotiques permettent d’intensifier le nombre de sites intervenant dans la reconnaissance stéréosélective des énantiomères et ainsi de séparer efficacement les acides aminés et autres molécules chirales.

Cependant pour des raisons de coût et de disponibilité, d’autres types de sélecteurs chiraux seront préférés en chimie préparative comme en sciences séparatives.

Les protéines

Les protéines sont des polymères naturels à hautes masses moléculaires composées d’un assemblage de plusieurs acides aminés possédant de nombreux sites chiraux. Les pionniers de l’utilisation de CSPs avec ce type de sélecteur sont Stewart et Doherty[31]. Ils utilisent l’albumine-succinoyl-amino-éthyle-agarose à des fins énantiochromatographiques pour la séparation par affinité du (D) et (L)-Tryptophane. L’acide α-1-glycoprotéine, l’albumine de sérum humain et l’albumine de sérum bovin (AGP, HSA et BSA) sont des protéines solubles dans l’eau largement employées en sciences énantioséparatives. En 1983, ce type de CSPs fut employé et utilisé en HPLC pour la résolution des énantiomères médicamenteux du propranolol, du disopyramide, du vérapamil, de l’indole, des benzodiazépines, de l’oxazépam, de la bupivacaïne et de la warfarine. Les multiples sélecteurs protéiniques existants permettent d’augmenter la spécificité des interactions établies entre sélecteurs et racémiques. Il est ainsi possible d’utiliser ces sélecteurs chiraux pour élaborer des CSPs pour l’OT-CEC, la m-CEC et la p-CEC. Ce type de sélecteur supramoléculaire est très sensible à son environnement intermoléculaire. Donc, le pH, la quantité de protéine, la température, la composition de l’électrolyte ainsi que la nature du greffon et le type de lien chimique reliant la protéine à la surface interne vont affecter la structure géométrique du sélecteur, la qualité de l’énantioséparation en OT-CEC (efficacité et résolution) et seront la cause de leur dégradation et L’équipe de Kitagawa[32] prépare une CSP en greffant l’avidine via une réaction de Schiff en surface du capillaire de silice fondue modifiée en amont par l’APTEOS puis ensuite par le gluteraldéhyde en milieu aqueux. Ce type de CSP liée de façon covalente a permis de séparer en OT-CEC les énantiomères de l’acide abscissique et des acides arylpropioniques. Les protéines citées précédemment ainsi que l’ovomucoïde (OVM), l’ovotransferine, la chymotrypsine et la cellobiohydrolase-I sont des sélecteurs chiraux aussi utilisés pour l’immobilisation au sein de monolithes organiques et inorganiques. Ces CSPs peuvent être synthétisées de différentes manières : encapsulation[33] du sélecteur dans la matrice, liaison covalente[34] ou adsorption physique[35]. Cependant, les protéines étant des molécules sensibles à certains paramètres tels que la température, le pH du milieu, la force ionique du tampon etc, il est donc difficile de reproduire des séparations chirales avec ce type de sélecteur. Pourtant ces bio-macromolécules semblent être les sélecteurs naturels parfaits pour l’énantioséparation d’une grande gamme de solutés chiraux auxquels nous nous intéresserons. En effet les protéines du corps humain permettent la reconnaissance chirale des médicaments, des nutriments ainsi que des drogues. Ce type de sélecteurs chiraux est en théorie idéale pour la séparation de nos racémique mais il ne sera cependant pas retenu à cause de sa faible stabilité et de la complexité du mécanisme de reconnaissance chirale en raison des nombreux sites chiraux présents chez les protéines.

Les alcaloïdes naturels à base de quinquina

Les deux énantiomères « cinchona » alcaloïdes (8S, 9R) et (8R, 9S), respectivement la quinine et la quinidine (Figure 6), sont des molécules extraites de l’écorce d’un arbre d’Amérique du Sud (quinquina). Ces deux isomères sont utilisés comme médicaments contre le paludisme. Ces deux molécules aux configurations opposées, peuvent aussi servir de sélecteurs chiraux dans les CSPs en chromatographie. La structure moléculaire de ce type de sélecteur chiral permet de mettre en jeu des interactions dipolaires de type π- π, ioniques, liaison hydrogène etc. (Figure 7). Lämmerhofer et Svec[36] ont copolymerisé, par voie photochimique et thermique, deux monomères acryliques dérivés de cet alcaloïde avec le 2-hydroxyéthyl-méthacrylate en présence d’un réticulant (EDMA), afin d’obtenir deux CSPs sur support monolithique. Les auteurs ont décrit de belles séparations des racémiques de dérivés d’acides aminés avec des résolutions comprises entre 2 et 4 et des efficacités de l’ordre de 100 000 plateaux/m. D’autres études[37-41] ont décrit des CSPs échangeuses d’anions utilisant des carbamates de quinine greffés de façon covalente[1] à la silice ou sur le monolithe in-situ permettant de séparer en HPLC et en CEC efficacement de nombreux dérivés DNP (Di-Nitro-Phenyl) et DNB (Di-Nitro-Benzoyle) d’acides aminés chiraux. De plus, nous pouvons observer différents groupements chimiques susceptibles d’être modifiés aisément sur la quinine et ses dérivés. En effet la double liaison du groupement allylique pourrait servir pour une « click-chemistry » de type thiol-ène ou bien pour une hydrosilylation sur une surface de silicium hydrogéné par exemple. D’autres types de réactions chimiques, comme la substitution nucléophile du 1-(4-Aminobutyl-terguride[42] (alcaloïde) sur les groupes époxydes du monolithe GMA-co-EDMA, ont servi pour élaborer des CSPs et séparer un racémique d’acide-2-aryloxypropionique en CEC.

les échangeurs de ligands

Les CSPs utilisant des échangeurs de ligands impliquent la formation d’un complexe organométallique avec l’ion, le sélecteur (Figure 8) et l’analyte. Parmi les sélecteurs, on retrouve la proline, l’hydroxyproline, l’histidine, la phénylalanine, l’acide aspartique, l’acide glutamique, la méthionine, la théreonine, la leucine et la valine. Le mécanisme met au centre l’ion métallique C 2+( 2+, 2+) et un sélecteur chiral dérivé d’acides aminés munis de ligands bidendates capables de chélater le cuivre. En sachant que deux molécules d’eau occupent également la sphère de coordination du Cu2+ et afin de respecter la coordination électronique du métal cationique, l’énantiomère à séparer doit porter des groupes chélatants bidentates pour former deux points parmi les interactions selon la règle des 3 points. Dès 1969, le complexe cinétiquement labile, sélecteur/ion métallique/soluté, permet à l’équipe de Davankov de résoudre des racémiques d’acides aminés par chromatographie chirale d’échange de ligands. Les ligands portent des groupes carboxylates, amines, amides, hydroxyles et thiols. Lors de la complexation avec le support sélecteur/ion métallique, des échanges de chélation avec d’autres ligands provenant de la phase mobile permettent d’assurer les séparations chirales. L’énantiosélectivité est meilleure lorsque les ligands des sélecteurs sont bidentates avec Cu2+ et lorsqu’ils sont tridentates avec Ni2+[43]. Ainsi les complexes diastéréoisomériques formés sont labiles, stables et permettent de comprendre simplement la règle du modèle d’interaction à 3 points d’Easson et Stedman. En CEC, les CSPs à base d’échanges de ligands sont le plus souvent cités dans l’emploi de monolithe incorporant le sélecteur chiral dans une matrice polystyrène[44], polyacrylamide[45] ou sol-gel[46, 47].

Le sélecteur Whelk-O-1 ou Pirkle

Le sélecteur « Whelk-O-1 » (Figure 9) désignant le 3,5-dinitrobenzamido(DNB)-1,2,3,4-tétrahydrophénanthrène est utilisé dès les années 90 pour l’énantioséparation des anti-inflammatoires non stéroïdaux comme le naproxène[48, 49] en HPLC. Le sélecteur est attaché à la surface de silice par l’intermédiaire d’un bras alkyle lié aux siloxanes. Ce sélecteur synthétique dérivant du phénanthrène (HAP) possède deux centres stéréogéniques (3S,4R) et (3R,4S), une fonction amide rendant labile la liaison H en interaction avec l’amine tertiaire du naproxène et des substituants riches en électrons dans le plan axial ou équatorial tels que les deux groupements électroattracteurs (NO2). La reconnaissance chirale est basée sur les propriétés électroniques ( − accepteur-donneur) du sélecteur et des énantiomères du naproxène. La liaison hydrogène et la gêne stérique due à la rigidité de la structure jouent les rôles des deux autres interactions nécessaires dans le mécanisme de la reconnaissance chirale à trois points d’attache. Par réciprocité, le (S)-naproxène est aussi un sélecteur chiral synthétique et efficace. En effet puisque le sélecteur de Pirkle est capable de distinguer le (R) du (S)-naproxène, de la même façon, le naproxène est aussi capable de jouer le rôle de sélecteur chiral en discriminant de manière énantiosélective les isomères du Whelk-O-1 par réciprocité. Le sélecteur de Pirkle est aussi utilisé pour préparer des CSPs pour la p-CEC avec pression assistée[50] et séparer ainsi les racémiques du bendrofluméthiazide, de la base de Tröger, de la benzoïne et de la warfarine.

Les éthers couronnes

Les éthers couronnes sont le plus souvent des dérivés de poly-oxyéthylène (poly-éther) cycliques, avec dix-huit atomes au total et six atomes d’oxygène, synthétisés en 1967 par Pedersen (18-C-6). Ces éthers couronnes ont une cavité au centre qui a la taille commode pour y inclure un groupement aminé protoné (NH3+). Cette inclusion compte pour un premier point d’attache selon le mécanisme inclusion-complexation des énantiomères. Les deux autres points d’attache aux isomères optiques résultent des interactions hydrophobiques et stériques des substituants des éthers couronnes. En effet, pour que les éthers couronnes aient une capacité de reconnaissance chirale, il leur faut des sites asymétriques apportés par des groupements tels que les bi-naphtyles, bi-phénanthrène, héricènes, acide tartrique, spirobifluorènes, carbohydrates, carbones asymétriques etc. Ce type de sélecteur est utilisé en HPLC[51], CEC[52, 53] pour la séparation des molécules chirales comme les acides α-aminés, les peptides de petites tailles ayant un groupe ammonium (provenant d’amines primaires) mais les éthers couronnes sont aussi utilisés en tant qu’additif dans l’électrolyte d’analyse pour la CZE[54]. Daicel commercialise ce type de CSP pour la séparation des acides aminés en HPLC.

Les polymères synthétiques

Des polymères synthétiques optiquement actifs peuvent être obtenus en greffant[55] le sélecteur chiral sur les chaines d’un polymère achiral, par réticulation[56] avec de l’épichlorohydrine ou en co-polymérisant[57] des monomères organiques en présence d’un sélecteur chiral. Les polymères chiraux peuvent ainsi servir en tant que CSPs en HPLC et en CEC. Certains polymères chiraux comme le polytriphényl-méthyl méthacrylate hélicoïdal[58], le polysodium N-undécanoyl-L-Leucyl-leucinate(poly-SULL) et le polysodium N-undécanoyl-L-Leucyl-valinate(poly-SULV) sont des dipeptides en forme de micelles synthétisés pour l’application en MEKC chirale[59, 60]. Les polymères chiraux ont l’avantage de présenter de nombreux sites stéréosélectifs et la possibilité d’avoir des charges idéalement distribuées en surface facilitant ainsi l’électro-osmose en CEC. De plus, les polymères CSPs peuvent être obtenus in-situ dans le capillaire en une étape. L’équipe de Schmid[45] copolymérise le méthacrylamide, le diacrylamide de pipérazine (PDA), l’acide vinyl sulfonique et le N-2-hydroxy-3-allyloxypropyl d’hydroxyproline. Cette CSP échangeuse de ligands a permis l’énantioséparation en CEC de plusieurs acides aminés.

Durant nos travaux, nous avons utilisé deux polymères synthétiques de CD. L’un est le poly-carboxyméthyl-β-cyclodextrine commercial (p-CM-β-CD- cyclolab) servant de sélecteur chiral avec des charges négatives qui pourraient favoriser le FEO cathodique en CEC. L’autre polymère favorisant la présence de FEO anodique est le polytriméthylammonium-β-cyclodextrine (p-CD+) synthétisé par le Pr B. Carbonnier. Les polymères synthétiques chiraux, obtenus à partir de monomères chiraux comme les CDs ou les acides aminés, sont des sélecteurs chiraux souvent utilisés en HPLC[61] et en CEC[62].

Les polysaccharides

Les polysaccharides sont des polymères naturels de glucose liés par des ponts osidiques. Ce sont des assemblages de monomères chiraux qui servent en énantiochromatographie en tant que macromolécule chirale. Les CSPs à base de polysaccharides sont les colonnes les plus employées en HPLC chirale[63] (>90%). Ce type de CSP est aussi employé en CEC en immobilisant par diverses manières possibles un polysaccharide sur un gel de silice ou sur des colonnes monolithes. La cellulose, l’amylose, la chitine et le chitosane[64] sont les polyosides natifs les plus courants et les plus utilisés en raison de leur abondance et de leurs faibles coûts en CEC chirale. A cause de leurs structures particulièrement hélicoïdales, les dérivés de l’amylose sont généralement préférés à ceux de la cellulose. Les substituants polaires des polysaccharides tels que les esters et carbamates permettent aux sélecteurs d’être plus efficaces que les polysaccharides natifs en termes de reconnaissance chirale. Ainsi, les dérivés de polysaccharides sont considérés comme appartenant à l’une des meilleures classes de sélecteurs chiraux employés en chromatographie chirale. Cependant, en raison de leurs tailles et structures complexes, le mécanisme de reconnaissance chirale avec ce type de sélecteurs demeure difficile à comprendre. De nos jours, il existe plus d’une centaine de CSPs commercialisées (Figure 11) (Chiralcel® OD, Chiralpack® AD, Chiralpak® IA et IB) dans le monde à partir d’une dizaine de sélecteurs de type polysaccharides. Les sélecteurs employés sont le plus souvent des polymères de D-glycopyranose ou D-glucosamine modifiés par acétylation (ester) ou en faisant réagir les groupements hydroxyles du polymère avec le phényl-isocyanate (carbamate). Chankvetadze et Okamoto ainsi que Lv et Mangelings ont immobilisé de façon covalente le 3,5-diméthylphénylcarbamate de cellulose (CDMPC) sur monolithe de silice pour des séparations chirales en HPLC[65] et en CEC[66] respectivement. L’équipe de Dong décrit des CSPs avec le même type de sélecteur. Les auteurs immobilisent le polymère sur monolithe organique par adsorption physique. Ils séparent ainsi en CEC, neuf paires d’énantiomères parmi douze racémiques acides, basiques et neutres[67]. Le tris(3,5-diméthylphénylcarbamate) d’amylose (ADMPC) est, de la même façon, utilisé par les équipes précédemment citées pour décrire des énantioséparations en HPLC[68] et en CEC[69]. Les CSPs à base d’ADMPC et/ou de CDMPC ont une large sélectivité et sont très célèbres en chromatographie et électrochromatographie capillaire chirale. Le mécanisme de reconnaissance, faisant intervenir l’énantiomère dans la structure hélicoïdale chirale du polysaccharide, reste complexe. Cependant, nous pouvons citer[70] quelques interactions intervenant dans le modèle à trois points de Easson et Stedman. En effet les groupements électroniques des 3,5-diméthyl-phényl-carbamates et 4-méthyl benzoate, des carbamates et esters respectifs, interagissent avec un des deux énantiomères selon des interactions impliquant la liaison H, les électrons π-π et l’effet stérique.

La cyclodextrine (CD)

Les cyclodextrines sont des macrocycles en forme de cône tronqué possédant une cavité aux propriétés hydrophobes de tailles variées selon le nombre (n) de motifs glucopyranose. Cette famille de molécules « cages » appartient aux oligosaccharides cycliques ayant des centres de chiralité sur chaque unité (D)-(+)-glucopyranosique liée en α-1,4. Elles sont le plus souvent formées de 6, 7 ou 8 unités de glucopyranose appelées α, β ou γ –CD (Figure 12).

Selon la polarité et la taille des énantiomères, il est envisageable d’utiliser différentes tailles de cavité de CDs. La β-CD possède cependant de meilleures propriétés de reconnaissance chirale que ses deux sœurs (α-CD et γ-CD), probablement en raison de son nombre impair de motifs plutôt que de sa taille. Les caractéristiques les plus courantes des CDs sont regroupées dans le tableau 2. Ces molécules cristallines ont été découvertes par Villiers en 1891 en dégradant l’amidon par une activité microbienne. Elles sont de nos jours très employées dans l’industrie agroalimentaire[71] et pharmaceutique[72] pour leurs propriétés de reconnaissance chirale tout d’abord et plus généralement pour leur capacité d’encapsulation des biomolécules[73] via un mécanisme supramoléculaire de formation d’un complexe d’inclusion « hôte-invité ». Le nombre de publication faisant référence aux cyclodextrines est en croissance exponentielle depuis la fin des années 60 (Figures 13 et 14). Nous relevons que la β-CD est largement majoritairement utilisée en tant que sélecteur chiral pour la GC, CEC et la CE.

Parmi les propriétés remarquables des CDs, celles d’être peu couteuses (3€/Kg et Dérivés : 190€/g), transparentes aux U.V, hydrosolubles et efficaces dans la reconnaissance chirale, aussi bien dans un milieu aqueux que dans un milieu totalement organique, en font un choix de qualité parmi la liste des sélecteurs chiraux utilisés en énantiochromatographie. Les cyclodextrines et leurs dérivés sont les sélecteurs chiraux les plus utilisés de toute évidence en science séparative chirale [76-78]. Elles servent à l’état natif en tant que sélecteurs chiraux en chromatographie liquide depuis 1984[79] et depuis 1989 en CZE.

La structure unique et particulière des CDs permet de former, à l’intérieur de leurs cavités et selon leur taille, des complexes d’inclusion avec des molécules hydrophobes portant des groupements aromatiques. La cavité interne des CDs possède des propriétés hydrophobes liées à la faible polarité apportée par les carbones asymétriques et le groupe éther présent sur chaque unité D-glucopyranosique. En effet, en milieux aqueux (phase inverse) on suppose que les principales interactions intervenant dans le mécanisme de reconnaissance chirale se déroulent dans la cavité des cônes tronqués. Cependant, chez les CDs natives et leurs dérivés, la conformation et l’orientation des groupements chiraux alcools secondaires jouent aussi un rôle majeur dans le mécanisme de séparation chirale à travers les interactions de type liaisons hydrogène accompagnant la formation du complexe d’inclusion. Les alcools primaires, quant à eux, serviront à co-polymériser ou greffer le sélecteur sur un support de phase stationnaire. Ainsi, les deux faces externes des cônes des CDs, aux propriétés hydrophiles, rendent les CDs solubles en milieu aqueux et permettent par complexation de mieux solubiliser certaines molécules hydrophobes. Chez la β-CD, la face de plus petit diamètre (face primaire) contient 7 groupes hydroxyles primaires, tandis que la plus grande (face secondaire), possède les 14 groupements alcools secondaires (Figure 15).

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Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I : PHASES STATIONNAIRES CHIRALES POUR L’ELECTROCHROMATOGRAPHIE CAPILLAIRE
Chiralité : Généralités
Reconnaissance chirale et énantiosélectivité par voie électrocinétique
II.1. Règle des trois points d’attache (Easson et Stedman)
II.2. Interaction stéréospécifique entre sélecteurs et énantiomères
II.3. Complexe diastéréoisomérique et énantiosélectivité
Sélecteurs chiraux en CEC
III.1. Sélecteurs sur mesures
III.1.1. Les polymères à empreintes moléculaires (MIPs)
III.1.2. Les aptamères
III.1.3. Les glycopeptides macrocycliques (ou antibiotiques)
III.2. Sélecteurs conventionnels
III.2.1. Les protéines
III.2.2. Les alcaloïdes naturels à base de quinquina
III.2.3. Les échangeurs de ligands
III.2.4. Le sélecteur Whelk-O-1 ou Pirkle
III.2.5. Les éthers couronnes
III.2.6. Les polymères synthétiques
III.2.7. Les polysaccharides
III.2.8. La cyclodextrine (CD)
Electrochromatographie capillaire
IV.1. Principe de la CEC
IV.2. Flux électroosmotique, mobilité électrophorétique et paramètres électrochromatographiques
Electrochromatographie capillaire chirale en tube ouvert
V.1. CSPs par adsorption de multicouches de polyélectrolyte (PEM)
V.2. CSPs non poreuses greffées de façon covalente
V.3. CSPs poreuse en Tube Ouvert
V.4. MIPs chiraux
V.5. CSPs sur colonnes gravées
V.6. CSPs sur colonnes en OT-CEC avec des nanoparticules
Electrochromatographie capillaire chirale sur monolithe
VI.1. Phase stationnaire monolithique sous forme de gel de polyacrylamide
VI.1.1. Synthèse directe de CSPs monolithes gels organiques de type poly(méth)acrylamide
VI.1.2. Synthèse indirecte de CSPs monolithes gels organiques de type poly(méth)acrylamide
VI.2. Phase stationnaire monolithique polymère (méth)-acrylate
VI.2.1. Synthèse directe de CSPs monolithes organiques rigides
VI.2.2. Synthèse indirecte de CSPs monolithes organiques rigides
VI.3. Phase stationnaire monolithique inorganique et hybride à base de sol-gel
VI.3.1. Synthèse directe de CSPs monolithes sol-gel inorganiques
VI.3.2. Synthèse indirecte de CSPs monolithes sol-gel inorganiques
Conclusion
Annexe
CHAPI TRE II : PHASES STATIONNAIRES COVALENTES A BASE DE CARBOXYMETHYL CYCLODEXTRINE POUR L’ELECTROCHROMATOGRAPHIE CAPILLAIRE EN TUBES OUVERTS (OT-CEC)
Introduction
I.1. Problématique de la séparation chirale en électrophorèse
I.2. Définition de la stratégie de greffage pour l’énantioséparation en CEC
Gravure chimique de la silice du capillaire par le procédé « etching »
II.1. Principe
II.2. Mise en œuvre de la gravure par le sel de bifluorure d’ammonium
II.3. Caractérisation de la surface du capillaire gravé par microscopie à force atomique (AFM) et microscopie électronique à balayage (MEB)
II.4. Caractérisation de la gravure par une étude de flux électroosmotique Modification du capillaire par l’APTEOS en milieu organique
III.1. Principe
III.2. Mise en œuvre de la silanisation
III.3. Caractérisation de l’état de surface après silanisation par voie électrocinétique Greffage du sélecteur de cyclodextrine en surface de la silice modifiée
IV.1. Principe
IV.2. Mécanismes
IV.3. Caractérisation du greffage du p-CDen CEC avec et sans agents de couplages EDC/NHS
IV.4. Effet de la gravure sur la CSP à base de p-CDen OT-CEC
Effet des variations des conditions opératoires sur les propriétés énantioséparatives de la phase stationnaire covalente à base de p-CD-
V.1. Effet de la tension de séparation sur des CSPs en colonnes gravées et non gravées
V.2. Effet de la température sur la séparation sur des CSP en tubes gravés
V.3. Effet de la nature du tampon sur la séparation sur des CSPs en colonnes gravées
V.4. Effet de la longueur de la colonne sur la qualité de la séparation
V.5. Effet de la nature du selecteur greffé
V.6. Effet du couplage du p-CDen milieu organique avec TBTU/TEA
Conclusion
CHAPITRE III : PHASES STATIONNAIRES MONOLITHIQUES A BASE DE -CYCLODEXTRINE POUR L’ELECTROCHROMATOGRAPHIE CAPILLAIRE CHIRALE
Introduction
I.1. Définition de la stratégie d’élaboration des CSPs sur support monolithique
I.2. Description des supports monolithiques employés pour la synthèse de CSP
Synthèse de CSP sur monolithe organique « 6a36 »
II.1. Principe
II.2. Mise en œuvre des CSPs à partir du support « 6a36 »
II.3. Caractérisation de la matrice « 6a36 » par MEB, spectroscopie RAMAN et CEC
II.4. Caractérisation de la fonctionnalisation de la matrice « 6a36 »
II.4.1. Caractérisation en RAMAN et CEC des CSPs obtenues avec la stratégie de greffage covalent
II.4.2. Caractérisation en RAMAN et CEC des CSPs obtenues avec la stratégie d’immobilisation non covalente136
II.5. Caractérisation des différentes CSPs élaborées en CEC chirale
Synthèse de CSP sur monolithe EGMP-BA par voie non covalente
III.1. Principe
III.2. Mise en œuvre
III.3. Caractérisation de la CSP par MEB et mesures de FEO en CEC
III.4. Séparation chirale en m-CEC sur la matrice EGMP-co-BAA modifiée par le p-CD+
Synthèse de CSP sur SPMA-MPTS-TEOS par voie non covalente
IV.1. Principe
IV.2. Mise en œuvre
IV.3. Caractérisation du support monolithe par MEB et CEC
IV.4. Séparations chirales en m-CEC sur la matrice SPMA-MPTS-TEOS modifiée par le p-CD+
Conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
PARTIE EXPERIMENTALE
Appareillages
I.1. Electrophorèse capillaire et Nanobaume
I.2. Analyses en Spectroscopie Raman
I.3. Analyses en Microscopie Electronique à Balayage
I.4. Analyses en Microscopie à Force Atomique
I.5. Autres appareillages
Réactifs et solutés
II.1. Liste des sélecteurs chiraux employés en OT-CEC
II.2. Liste des réactifs employés en OT-CEC
II.3. Liste des sélecteurs chiraux employés en m-CEC
II.4. Liste des réactifs employés en m-CEC
II.4.1. Réactifs pour les CSPs sur NAS-co-EDMA
II.4.2. Réactifs pour les CSPs sur EGMP-BAA
II.4.3. Réactifs pour les CSPs sur SPMA-MPTS-TEOS
II.5. Liste des solvants utilisés
Préparation des électrolytes tampons
Elaboration de CSPs sur colonnes gravées pour l’OT-CEC
IV.1. Gravure des tubes ouverts par NH4, HF2 saturé dans le MeOH
IV.2. Greffage de l’APTEOS en surface de la silice dans le toluène
IV.3. Couplage des sélecteurs chiraux en milieu aqueux avec EDC/NHS
IV.3.1. Couplage peptidique du polymère p-CD-
IV.3.2. Couplage peptidique des monomères CM-β-CDet Scc-β-CD-
IV.4. Couplage des sélecteurs chiraux en milieux non aqueux avec TBTU/TEA
Elaboration des CSPs sur colonne monolithe pour la m-CEC
V.1. Mise en œuvre d’une CSP sur le monolithe SPMA-MPTS-TEOS
V.2. Mise en œuvre d’une CSP sur le monolithe EGMP-co-BAA
V.2.1. Activation du capillaire par le γ-MAPS
V.2.2. Elaboration des colonnes monolithes EGMP-co-BAA et leur fonctionnalisation
V.3. Mise en œuvre des CSPs sur le monolithe NAS-co-EDMA
V.3.1. Elaboration des supports monolithes NAS-co-EDMA en capillaire
V.3.2. CSPs obtenues avec la stratégie de greffage covalent
V.3.2.1. Mise en œuvre de la CSP1
V.3.2.2. Mise en œuvre de la CSP2
V.3.2.3. Mise en œuvre de la CSP3
V.3.2.4. Mise en œuvre de la CSP4
V.3.3. CSPs obtenues avec la stratégie d’immobilisation électrostatique
V.3.3.1. Mise en œuvre de la CSP5
V.3.3.2. Mise en œuvre de la CSP6
V.3.3.3. Mise en œuvre de la CSP7
Annexes
VI.1. Description de la CEC
VI.2. Tableaux solutés (nom, formule et pKa)
VI.3. Colonnes et solutés analysés en OT-CEC
VI.3.1. Liste des solutés racémiques injectés en OT-CEC (Couplage EDC/NHS)
VI.3.2. Liste des solutés racémiques injectés en OT-CEC (Couplage TBTU/TEA)
VI.4. Colonnes et solutés analysés en m-CEC
VI.4.1. Liste des solutés racémiques injectés dans les colonnes 6A36-EDA greffées avec le polymère p-CDvia EDC/NHS sur 10cm
VI.4.2. Liste des solutés racémiques injectés dans la colonne 6A36-EDA greffée par le monomère CMβ-CD- (0,5g.L-1) via EDC/NHS sur 10 cm
VI.4.3. Liste des solutés racémiques injectés dans les colonnes 6A36-EDA greffées par le monomère Scc-β-CD- (1g.L) via EDC/NHS sur 10 cm couplage à pH=8,0 Tris durant 15 minutes de réactions
VI.4.4. Liste des solutés racémiques injectés dans les colonnes 6A36- pCD+ non covalent
VI.4.5. Liste des solutés racémiques injectés dans les colonnes (EGMP-BAA)-p-CD+
VI.4.6. Liste des solutés racémiques injectés dans les colonnes (SPMA-MPTS-TEOS)-p-CD+
BIBLIOGRAPHIE